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Biology

Intracellular बातचीत के द्वारा व्यवहार्य कोशिकाओं में प्रेरित घटनाओं पड़ोसी कोशिकाओं के दौर से गुजर apoptotic कोशिका मृत्यु के साथ सिगनल की पहचान

Published: December 27, 2016 doi: 10.3791/54980
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 3, 4, 1,2,5
1Section of Nephrology, Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Section of Nephrology, Department of Medicine, Jesse Brown Veterans Affairs Medical Center, 3Department of Biology, Kutztown University of Pennsylvania, 4Division of Rheumatology, Department of Medicine, Research Institute of the McGill University Health Centre, 5Department of Microbiology & Immunology, University of Illinois at Chicago
* These authors contributed equally

Abstract

apoptosis से मर कोशिकाओं के रूप में भी विनियमित कोशिका मृत्यु के लिए भेजा है, कई नई गतिविधियों है कि उन्हें आसन्न जीवित कोशिकाओं के समारोह को प्रभावित करने में सक्षम अधिग्रहण। इस तरह के अस्तित्व, प्रसार, विकास, और भेदभाव के रूप में महत्वपूर्ण गतिविधियों, apoptotic कोशिकाओं द्वारा संग्राहक कई सेलुलर कार्यों में से एक हैं। समझते हैं और apoptotic कोशिकाओं के लिए प्रतिक्रिया करने की क्षमता वंश या व्युत्पत्ति के अंग की परवाह किए बिना, सभी कोशिकाओं की एक सार्वभौमिक सुविधा प्रतीत होता है। हालांकि, विविधता और उस महान देखभाल के संकेत घटनाओं और रास्ते किसी विशेष परिणाम के लिए जिम्मेदार विदारक में लिया जाना apoptotic कोशिकाओं जनादेश के जवाब की जटिलता। विशेष रूप से, एक कई तंत्र है जिसके द्वारा apoptotic कोशिकाओं व्यवहार्य प्रत्युत्तर कोशिकाओं के भीतर intracellular संकेत दे रास्ते प्रभावित कर सकते हैं, सहित के बीच अंतर करना चाहिए: apoptotic सेल के रिसेप्टर की मध्यस्थता मान्यता, apoptotic सेल द्वारा घुलनशील मध्यस्थों की रिहाई, और / या सगाई की फागोcytic मशीनरी। यहाँ, हम intracellular संकेत घटनाओं है कि व्यवहार्य प्रत्युत्तर कोशिकाओं में apoptotic कोशिकाओं के लिए अपने जोखिम निम्नलिखित प्रेरित कर रहे हैं की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल का एक प्रमुख लाभ यह ध्यान व्यवस्था है जिसके द्वारा apoptotic कोशिकाओं जवाब कोशिकाओं के भीतर की घटनाओं का संकेत मिलाना के विच्छेदन के लिए भुगतान करता है में निहित है। जबकि प्रोटोकॉल एक सशर्त अमर माउस गुर्दे समीपस्थ ट्यूबलर सेल लाइन (BU.MPT कोशिकाओं) के लिए विशिष्ट है, यह आसानी से सेल लाइनों है कि मूल में गैर उपकला और / या गुर्दे के अलावा अन्य अंगों से निकाली गई हैं के लिए अनुकूल है। एक प्रोत्साहन के रूप में मृत कोशिकाओं के उपयोग के कई अनूठी कारक है कि intracellular संकेत घटनाओं का पता लगाने में बाधा कर सकते हैं परिचय। इन समस्याओं के साथ-साथ रणनीतियों को कम करने या उन्हें नाकाम करने के लिए, प्रोटोकॉल के भीतर चर्चा कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल के आवेदन दोनों के स्वास्थ्य में और disea में व्यापक प्रभाव है कि मृत या मर कोशिकाओं उनके रहते पड़ोसियों पर डालती है की हमारी विस्तार ज्ञान सहायता करनी चाहिएएसई।

Introduction

Apoptosis, या विनियमित कोशिका मृत्यु 1, ऊतकों के रखरखाव और विकास के लिए एक आवश्यक ढंग से योगदान देता है। सबसे बस देखा, apoptosis परमिट, आयु वर्ग के क्षतिग्रस्त, या अतिरिक्त कोशिकाओं के आसपास के ऊतकों 2,3 लिए नुकसान के बिना समाप्त किया जा सके। ऊतक homeostasis को apoptosis के योगदान है, तथापि, काफी अधिक गतिशील और विविध है। Apoptosis से मर कोशिकाओं कई नई गतिविधियों के अधिग्रहण, दोनों स्रावित और सेल जुड़े है, जो उन्हें आसन्न जीवित कोशिकाओं 4-10 के समारोह को प्रभावित करने के लिए सक्षम है। इससे पहले apoptotic कोशिकाओं की क्षमता सूजन 11-16 को दबाने के लिए पर ध्यान केंद्रित अध्ययन, लेकिन apoptotic कोशिकाओं को भी, अस्तित्व 4,9,10, प्रसार 4,9,10, भेदभाव 17 के रूप में इस तरह के महत्वपूर्ण गतिविधियों सहित सेलुलर कार्यों की एक व्यापक रेंज मिलाना पलायन 18, और विकास के 19। इसके अलावा, इन प्रभावों, पेशेवर फ़ैगोसाइट करने के लिए ही सीमित नहीं हैं बृहतभक्षककोशिका की तरहएस, लेकिन लगभग सभी प्रकार के और प्रजातियों, इस तरह के उपकला और endothelial कोशिकाओं 7,9,10,18-21 के रूप में पारंपरिक रूप से गैर-phagocytic कोशिकाओं, सहित सेल के लिए करता हूं।

apoptotic कोशिकाओं को प्रदर्शन के बाद आसन्न जीवित कोशिकाओं के विशिष्ट प्रतिक्रिया के लिए कई कारक है कि दोनों व्यवहार्य जवाब कोशिकाओं और apoptotic कोशिकाओं को खुद से संबंधित पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, हालांकि apoptotic कोशिकाओं के लिए जोखिम दोनों murine मैक्रोफेज और गुर्दे समीपस्थ ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं (PTECs) के प्रसार को रोकता है, इन दो प्रकार की कोशिकाओं में नाटकीय रूप apoptotic कोशिकाओं 4,6,9,10 को अपने अस्तित्व के जवाब में भिन्न होते हैं। Apoptotic कोशिकाओं मैक्रोफेज के अस्तित्व को बढ़ावा देने, लेकिन PTECs 4,6,9,10 की apoptotic मौत प्रेरित। विशेष रूप से, apoptotic कोशिकाओं की प्रतिक्रिया, एक ही वंश की कोशिकाओं जवाब उत्पत्ति 10 (जैसे, स्तन उपकला बनाम गुर्दे PTECs का जवाब सेल के अंग पर निर्भर करता है के बीच भी अलग हो सकता हैकोशिकाओं) या सक्रियण के राज्य 22 (जैसे, न्यूट्रोफिल)। इसके विपरीत, apoptotic कोशिकाओं 10,23 या apoptosis 10,14 के मंच प्रोत्साहन apoptotic की प्रकृति पर निर्भर करता है बहुत ही सेल में अलग-अलग प्रतिक्रियाओं का आह्वान कर सकते हैं।

diverseness और apoptotic कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की जटिलता को देखते हुए, महान देखभाल के संकेत घटनाओं और रास्ते किसी विशेष परिणाम के लिए जिम्मेदार विदारक में लिया जाना चाहिए। सबसे पहले, व्यवहार्य और apoptotic कोशिकाओं के बीच प्रत्यक्ष शारीरिक बातचीत की आवश्यकता प्रतिक्रियाएं जारी या apoptotic सेल 3,6-10 द्वारा उत्पन्न घुलनशील मध्यस्थों द्वारा हासिल उन से भेदभाव किया जाना चाहिए। शारीरिक संपर्क की आवश्यकता है, तो एक और भेदभाव किया जाना चाहिए। संकेत घटनाओं apoptotic सेल, बाद घिराव के स्वतंत्र, या phagocytic तेज पर, विशिष्ट रिसेप्टर के स्वतंत्र है कि apoptotic सेल बांधता के रिसेप्टर की मध्यस्थता मान्यता पर निर्भर हो सकता है 3-7,9,10,19। उदाहरण के उत्तरार्द्ध में, प्रतिक्रिया apoptotic कोशिकाओं के लिए विशिष्ट नहीं है, और किसी भी phagocytic सामग्री 4,6 से शुरू हो सकता है।

इन भेद के महत्व को फिर से मैक्रोफेज और गुर्दे PTECs की प्रतिक्रियाओं विषम द्वारा सराहना की जा सकती है। दोनों प्रकार की कोशिकाओं के लिए, apoptotic कोशिकाओं के लिए जोखिम समर्थक अस्तित्व काइनेज Akt की गतिविधि को बदल। मॉड्यूलेशन शारीरिक बातचीत पर निर्भर है, और एक 0.4 माइक्रोन पॉली कार्बोनेट झिल्ली द्वारा apoptotic कोशिकाओं जवाब की जुदाई के बाद प्रतिक्रिया 4,9,10,19 समाप्त करता है। हालांकि, PTECs की प्रतिक्रिया जबकि मैक्रोफेज की प्रतिक्रिया phagocytosis 4,9,10,19 द्वारा संचालित है, रिसेप्टर की मध्यस्थता और phagocytosis से स्वतंत्र है। यह निष्कर्ष इस तथ्य लेटेक्स मोती, एक तटस्थ phagocytic प्रोत्साहन, के लिए जोखिम PTECs में Akt गतिविधि पर कोई प्रभाव नहीं है, लेकिन mimics मैक्रोफेज 4,9 में apoptotic कोशिकाओं का असर है कि द्वारा प्रबलित है।

"कम अच्छी तरह से अध्ययन> हालांकि, गल जाना, या आकस्मिक कोशिका मृत्यु 1 से मर कोशिकाओं भी पास व्यवहार्य कोशिकाओं के समारोह 3-10,19 मिलाना। Apoptotic कोशिकाओं की तरह, परिगलित कोशिकाओं तंत्र की एक किस्म है, विशेष रूप से रिसाव के माध्यम से अपने प्रभाव डालती PTECs और मैक्रोफेज सहित कई कोशिकाओं, उनके उठी कोशिका झिल्ली 3,5,6,9,24 के माध्यम से intracellular सामग्री के।, कोशिकाओं नेक्रोसिस 5.9 से मरने के लिए अलग-अलग गैर प्रतिस्पर्धा रिसेप्टर्स के पास है। इन रिसेप्टर्स की सगाई संकेत घटनाओं हैं कि लाती है अक्सर apoptotic कोशिकाओं 4-10,19 के लिए रिसेप्टर्स की सगाई से प्रेरित उन लोगों के लिए विपरीत है। उदाहरण के लिए, PTECs में, परिगलित कोशिकाओं Akt के फोस्फोराइलेशन, जबकि बढ़ाने apoptotic कोशिकाओं फोस्फोराइलेशन 9,10,19 कमी।

यहाँ, हम intracellular संकेत घटनाओं आसन्न apoptotic PTECs के रिसेप्टर की मध्यस्थता मान्यता के माध्यम से व्यवहार्य गुर्दे PTECs में प्रेरित पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन 9,10,19,25,26 रूप में जाना जाता लाइन के लिए विशिष्ट है, यह आसानी से सेल लाइनों है कि मूल में गैर उपकला और / या के अलावा अन्य अंगों से निकाली गई हैं के लिए अनुकूल है गुर्दे की। महत्वपूर्ण बात है, एक सेल प्रोत्साहन के रूप में apoptotic कोशिकाओं के उपयोग के कुछ निहित प्रयोगात्मक कठिनाइयों घुलनशील ligands के साथ मौजूद नहीं बन गया है। इनमें से सबसे महत्वपूर्ण है कि apoptotic कोशिकाओं एक निलंबन के रूप में नहीं बल्कि एक समाधान के रूप में जोड़ा जाना चाहिए। इन कठिनाइयों, साथ ही रणनीतियों को कम करने या उन्हें नाकाम करने के लिए, प्रोटोकॉल के भीतर चर्चा कर रहे हैं। लगभग तकनीक प्रोटोकॉल में वर्णित के सभी सीधा और सेल संस्कृति के लिए मानक हैं। इस प्रोटोकॉल का लाभ कई तंत्र है जिसके द्वारा apoptotic कोशिकाओं कोशिकाओं के भीतर जवाब संकेत पारगमन मिलाना पर अपना ध्यान में निहित है। ये तंत्र सतह निर्धारकों के माध्यम से बाध्यकारी या फिर पर विशिष्ट रिसेप्टर्स करने के अणुओं को पाटने में शामिलsponding सेल, घुलनशील मध्यस्थों की रिहाई, और / या phagocytic मशीनरी की सगाई की। परिगलित कोशिकाओं सभी प्रयोगों में शामिल हैं सुनिश्चित करने के लिए है कि परिणाम कोशिका मृत्यु की विधा है, और न मृत कोशिकाओं के लिए एक सामान्यीकृत प्रतिक्रिया के लिए विशिष्ट हैं। एक सावधान दृष्टिकोण, के रूप में इस प्रोटोकॉल में सिफारिश की है, कभी विस्तार प्रभाव है कि मर कोशिकाओं उनके रहते पड़ोसियों पर डालती है, दोनों के स्वास्थ्य और रोग में की हमारी समझ के लिए महत्वपूर्ण है।

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Protocol

1. तैयारी

नोट: इस प्रोटोकॉल, दो या अधिक सेल लाइनों, या प्राथमिक सेल संस्कृतियों में, स्वतंत्र रूप से विशेष परिस्थितियों में तैयार किया जाता है। इन तैयारियों apoptotic कोशिकाओं (1 प्रोटोकॉल), परिगलित कोशिकाओं (प्रोटोकॉल 2), और स्वस्थ प्रत्युत्तर कोशिकाओं (प्रोटोकॉल 3) शामिल हैं। स्वतंत्र तैयारी के बाद, apoptotic या परिगलित कोशिकाओं प्रत्युत्तर कोशिकाओं को जोड़ रहे हैं और जिसके परिणामस्वरूप संकेत पारगमन नजर रखी है (प्रोटोकॉल 4, 5, और 6)।

  1. संस्कृति मीडिया और अभिकर्मकों तैयार
    1. 500 संस्कृति के एमएल मध्यम एक (, जब अनुमोदक की शर्तों के तहत कोशिकाओं बढ़ते उपयोग के लिए खंड 1.2 देखें) तैयार निम्नलिखित संयोजन के द्वारा: 1x Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 4.5 छ / एल ग्लूकोज, 584 मिलीग्राम / एल ʟ-glutamine युक्त, 110 मिलीग्राम / एल सोडियम पाइरूवेट, 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), और 10 इकाइयों / इंटरफेरॉन γ (IFN-γ) एमएल।
    2. उपयोग क लिए संस्कृति के माध्यम बी के 500 एमएल (तैयारएन गैर अनुमोदक की शर्तों के तहत सीरम भूख से मर कोशिकाओं, खंड 1.2) गैर अनुमोदक की स्थिति (पूर्व सीरम भुखमरी के तहत कोशिकाओं को विकसित करने के लिए संस्कृति के माध्यम ए) का नुस्खा से FBS और IFN-γ छोड़ते से देखते हैं, 10% वी जोड़ने / वी संस्कृति के माध्यम से बी करने के लिए एफबीएस
    3. 1x Dulbecco फॉस्फेट बफर मृत कोशिकाओं के निर्धारण के लिए 4% paraformaldehyde शेयर से खारा (DPBS) में 0.4% (वी / वी) paraformaldehyde, पीएच 7.2 से तैयार करें।
      नोट: Paraformaldehyde विषैला होता है, और उचित सावधानी इसके उपयोग में प्रयोग किया जाना चाहिए।
  2. संस्कृति BU.MPT कोशिकाओं
    1. तरल नाइट्रोजन से BU.MPT कोशिकाओं की एक शीशी पिघलना।
      नोट: BU.MPT एक माउस गुर्दे समीपस्थ ट्यूबलर उपकला सेल (PTEC) लाइन एक ट्रांसजेनिक माउस माउस प्रमुख के नियंत्रण में एक तापमान के प्रति संवेदनशील (टीएस) SV40 बड़े ट्यूमर प्रतिजन (टैग) का उत्परिवर्तन (tsA58) असर से प्राप्त होता है उतक अनुरूपता जटिल (एमएचसी) एच -2 k बी क्लास मैं प्रमोटर 25,26।
    2. बाँझ polystyr पर प्लेट कोशिकाओंएकदा वैक्यूम गैस प्लाज्मा इलाज टिशू कल्चर व्यंजन (~ 100 मिमी व्यास पकवान प्रति 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं)।
    3. एक humidified 5% (वी / वी) सीओ 2 माहौल में अनुमोदक की शर्तों के तहत कोशिकाओं को विकसित।
      नोट: उदारचेता की स्थिति है, जो 33 पर संस्कृति के रूप में परिभाषित कर रहे हैं - IFN-γ की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस, tsA58-उत्परिवर्तित टैग transgene की अभिव्यक्ति स्थिर सक्षम करें। माउस गुर्दे PTEC के प्राथमिक संस्कृतियों, जो एक ही पारित होने या दो से अधिक जीवित नहीं है के विपरीत, BU.MPT सुसंस्कृत तहत अनुमोदक की स्थिति अनिश्चित काल के लिए passaged जा सकता है।
      1. पारित होने कोशिकाओं में कम से कम तीन उन्हें एक प्रयोग में उपयोग करने से पहले विगलन के बाद बार।
        1. पारित होने की कोशिकाओं के लिए, 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 100 मिमी पकवान प्रति 0.05% trypsin के 1 एमएल जोड़ने के लिए, और एक humidified 5% (वी / वी) सीओ 2 माहौल में सेते हैं। 10 मध्यम ए महाप्राण एमएल अलग कोशिकाओं जोड़कर trypsin बेअसर, और विभाजन 1: नई 100 मिमी बाँझ polystyrene वैक्यूम गैस प्लाज्मा इलाज Tiss में 5: 1 से 3UE संस्कृति व्यंजन। मध्यम एक 100 मिमी पकवान प्रति 10 एमएल की कुल करने के लिए खंड को लाने के लिए जोड़ें।
    4. कोशिकाओं को जवाब के रूप में प्रयोगात्मक उपयोग के लिए तैयार करने में, गैर अनुमोदक की शर्तों के तहत एक humidified 5% में संगम के लिए कोशिकाओं (वी / वी) सीओ 2 माहौल हो जाना (यानी IFN-γ के अभाव में 39 डिग्री सेल्सियस पर [मध्यम बी 10% v युक्त / वी एफबीएस])।
      नोट: गैर अनुमोदक शर्तों के तहत, tsA58-उत्परिवर्तित टैग transgene की अभिव्यक्ति> 95% से हिचकते हैं, और BU.MPT कोशिकाओं माउस गुर्दे PTEC के प्राथमिक संस्कृतियों की तरह व्यवहार करते हैं।

2. apoptotic BU.MPT प्रकोष्ठों की तैयारी (1 प्रोटोकॉल)

नोट: इस प्रोटोकॉल apoptotic कोशिकाओं का स्रोत है, और apoptosis प्रेरण की विधि के रूप में के रूप में staurosporine BU.MPT कोशिकाओं के लिए विशिष्ट है। वैकल्पिक रूप से, एक और सेल लाइन, या प्राथमिक सेल संस्कृति, मानकीकृत protoco द्वारा प्रेरित apoptosis के साथ, apoptotic कोशिकाओं का एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैकि विशेष सेल प्रकार और apoptosis प्रेरण की विधि के लिए LS।

  1. 100 मिमी व्यास बाँझ polystyrene वैक्यूम गैस प्लाज्मा इलाज टिशू कल्चर व्यंजन पर पारित होने के बाद, हो जाना BU.MPT कोशिकाओं एक humidified 5% में संगम के लिए (वी / वी) अनुमोदक की शर्तों के तहत सीओ 2 माहौल (यानी कम से संस्कृति के माध्यम से एक में 37 डिग्री सेल्सियस पर 100 मिमी पकवान प्रति 10 एमएल), धारा 1.2.3 में वर्णित है।
  2. पक्षपाती सेल monolayer कुल्ला प्रति 10 एमएल का उपयोग कर संस्कृति के माध्यम बी के साथ तीन बार कुल्ला।
  3. Staurosporine, एक गैर-चयनित प्रोटीन kinase अवरोध युक्त संस्कृति के माध्यम से बी में कोशिकाओं 1 माइक्रोग्राम / एमएल में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 माहौल एक humidified 5% में 3 घंटे के लिए incubating (v / v) सीओ द्वारा apoptosis प्रेरित।
  4. "अस्थायी" apoptotic कोशिकाओं है कि monolayer से अलग किया है जिसमें staurosporine युक्त मध्यम aspirate। अपकेंद्रित्र 500 XG पर 10 मिनट के लिए इस माध्यम का, तैरनेवाला त्यागें गोली संस्कृति के माध्यम बी के साथ तीन बार धो, औरगोली अगले कदम, 2.5 में एकत्र कोशिकाओं को वापस जोड़ने।
  5. 5 मिमी (ethylenediaminetetraacetic एसिड) 1x सीए में EDTA के अलावा द्वारा कदम 2.3 और 2.4 से शेष पक्षपाती कोशिकाओं को अलग 2 + - और मिलीग्राम 5 मिनट के लिए पकवान प्रति 1 एमएल में 2 + मुक्त DPBS। EDTA युक्त अलग apoptotic कोशिकाओं से युक्त मध्यम aspirate, और एक बाँझ 15 एमएल polystyrene अपकेंद्रित्र ट्यूब में 2.4 कदम से "अस्थायी" apoptotic कोशिकाओं के साथ अलग कोशिकाओं पूल।
  6. और मिलीग्राम + 2 धोने के प्रति मुक्त DPBS - apoptotic कोशिकाओं 10 1x एमएल सीए + 2 में 500 XG पर 10 मिनट के लिए और मेजबान के लिए centrifugation द्वारा तीन बार धोएं।
  7. पिछले धोने के बाद, प्रत्युत्तर कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए उपयोग करने से पहले एमएल प्रति ~ 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं पर ताजा संस्कृति के माध्यम बी में apoptotic कोशिकाओं को निलंबित। वैकल्पिक रूप से, धोया apoptotic कोशिकाओं में 0.4% (वी / वी) paraformaldehyde 1x DPBS में 30 मिनट के लिए ठीक है, और फिर संस्कृति के साथ तीन बार धोनेमध्यम बी, संस्कृति के माध्यम से बी में निलंबन से पहले
  8. उचित रूप में, apoptotic कोशिकाओं का एक अलग तैयारी का उपयोग cytometry (या इस उद्देश्य के लिए कुछ कोशिकाओं आरक्षित करके), के रूप में पहले से 6,9,10,15 वर्णित प्रवाह से apoptosis की प्रेरण की पुष्टि करें।
    नोट: प्रारंभिक apoptotic कोशिकाओं बरकरार कोशिका झिल्ली है, और के रूप में propidium आयोडाइड (पीआई) दिखाई -नकारात्मक और Annexin वी पॉजिटिव की कोशिकाओं सेल आकार (व्यवहार्य कोशिकाओं के सापेक्ष) की कमी हुई। देर apoptotic कोशिकाओं गैर बरकरार कोशिका झिल्ली है, और के रूप में प्रकट पीआई पॉजिटिव और Annexin वी पॉजिटिव कोशिकाओं की कोशिका का आकार कम किया है। मौजूदा प्रोटोकॉल का प्रयोग, ठेठ तैयारियों ~ 85% जल्दी apoptotic और ~ 15% देर apoptotic कोशिकाओं होते हैं।
  9. 1 के एक apoptotic करने वाली प्रत्युत्तर सेल अनुपात में प्रत्युत्तर कोशिकाओं (प्रोटोकॉल 3) BU.MPT को apoptotic कोशिकाओं जोड़ें: 1, या तो सीधे या 0.4% (वी / वी) 1x DPBS में paraformaldehyde के साथ 30 मिनट के लिए apoptotic कोशिकाओं के निर्धारण के बाद ।
    नोट: apoptotic सेल निर्धारण responders की उत्तेजना से पहले करना चाहिएपरिणामों को प्रभावित नहीं है, जब तक मनाया संकेत घटनाओं एक घुलनशील मध्यस्थ (तालिका 1) के रिलीज होने के कारण कर रहे हैं।

3. परिगलित BU.MPT प्रकोष्ठों की तैयारी (प्रोटोकॉल 2)

नोट: इस प्रोटोकॉल परिगलित कोशिकाओं का स्रोत है, और नेक्रोसिस प्रेरण की विधि के रूप में हीटिंग के रूप में BU.MPT कोशिकाओं के लिए विशिष्ट है। वैकल्पिक रूप से, एक और सेल लाइन, या प्राथमिक सेल संस्कृति, कि विशेष सेल प्रकार और नेक्रोसिस प्रेरण की विधि के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल द्वारा प्रेरित नेक्रोसिस के साथ, परिगलित कोशिकाओं का एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. 100 मिमी व्यास बाँझ polystyrene वैक्यूम गैस प्लाज्मा इलाज टिशू कल्चर व्यंजन पर पारित होने के बाद, हो जाना BU.MPT कोशिकाओं एक humidified 5% में संगम के लिए (वी / वी) अनुमोदक की शर्तों के तहत सीओ 2 माहौल (यानी कम से संस्कृति के माध्यम से एक में 37 डिग्री सेल्सियस पर पकवान प्रति 10 एमएल), धारा 1.2.3 में वर्णित है।
  2. पक्षपाती सेल monolayer संस्कृति के माध्यम बी के साथ तीन बार कुल्ला, का उपयोगकुल्ला प्रति 10 एमएल।
  3. और मिलीग्राम + 2 से 5 मिनट के लिए पकवान प्रति 1 एमएल पर मुक्त DPBS - 1x सीए + 2 में 5 मिमी EDTA के अलावा द्वारा कोशिकाओं को अलग करें। EDTA युक्त अलग कोशिकाओं से युक्त मध्यम aspirate, और एक बाँझ 15 एमएल polystyrene सेंट्रीफ्यूज ट्यूब सेल निलंबन जोड़ें।
  4. और मिलीग्राम + 2 धोने के प्रति मुक्त DPBS - कोशिकाओं सीए + 2 के 10 एमएल में 500 XG पर 10 मिनट के लिए और मेजबान के लिए centrifugation द्वारा तीन बार धोएं।
  5. पिछले धोने के बाद, एमएल प्रति ~ 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं पर ताजा संस्कृति के माध्यम बी में कोशिकाओं को निलंबित।
  6. एक नहाने के पानी में 45 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस के लिए कोशिकाओं को गर्म करने के लिए, धीरे सेल निलंबन हर 10 मिनट vortexing द्वारा नेक्रोसिस प्रेरित।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified 5% (वी / वी) सीओ 2 माहौल में 2 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं। धीरे सेल निलंबन हर 15 मिनट भंवर।
  8. उचित रूप में, पूर्वोत्तर के एक अलग तैयारी का उपयोग प्रवाह cytometry द्वारा नेक्रोसिस की प्रेरण पुष्टिcrotic कोशिकाओं (या इस उद्देश्य के लिए कुछ कोशिकाओं आरक्षित करके), के रूप में पहले से 6,9,10,15 का वर्णन किया।
    नोट: परिगलित कोशिकाओं कोशिका झिल्ली उठी है, और (व्यवहार्य कोशिकाओं के सापेक्ष) बढ़ सेल आकार के पीआई पॉजिटिव कोशिकाओं के रूप में दिखाई देते हैं। मौजूदा प्रोटोकॉल का प्रयोग, ठेठ तैयारियों ≥ 95% परिगलित कोशिकाओं होते हैं। वैकल्पिक रूप से, गल जाना और झिल्ली अखंडता के नुकसान की प्रेरण Trypan नीले धुंधला द्वारा की पुष्टि की जा सकती है।

4. BU.MPT प्रत्युत्तर प्रकोष्ठों की तैयारी (प्रोटोकॉल 3)

नोट: इस प्रोटोकॉल प्रत्युत्तर कोशिकाओं के स्रोत के रूप में BU.MPT कोशिकाओं के लिए विशिष्ट है। वैकल्पिक रूप से, एक और सेल लाइन, या प्राथमिक सेल संस्कृति, प्रत्युत्तर कोशिकाओं के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रयोगात्मक उपयोग करने से पहले, निष्क्रियता प्रयोगशाला के भीतर मानकीकृत प्रोटोकॉल द्वारा रात भर प्रेरित किया जा सकता है।

  1. पकवान प्रति 10 एमएल में संस्कृति के माध्यम से एक में अनुमोदक की शर्तों के तहत बाँझ 100 मिमी टिशू कल्चर व्यंजन में BU.MPT कोशिकाओं को विकसित जब तक वे लक्ष्य को हासिल ~85% संगम।
  2. महाप्राण संस्कृति के माध्यम से एक है, और कुल्ला प्रति 10 एमएल में संस्कृति के माध्यम बी के साथ तीन बार कुल्ला कोशिकाओं। कोशिकाओं रात भर 18 से 24 घंटे के लिए एक humidified 5% में सीरम भूखा (वी / वी) सीओ 2 गैर अनुमोदक की शर्तों के तहत वातावरण (यानी कम से पकवान प्रति 10 एमएल में 39 डिग्री सेल्सियस संस्कृति में मध्यम बी), धारा 1.2 में वर्णित के रूप में .4, क्रम में निष्क्रियता प्रेरित करने के लिए। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं संस्कृति के माध्यम से बी प्लस 10% (v / v) FBS 39 डिग्री सेल्सियस से कम एक दिन के लिए सीरम भूख से मर कोशिकाओं से पहले रात भर संस्कृति के माध्यम से बी में FBS के बिना हो जाना।
  3. प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए मिला हुआ BU.MPT कोशिकाओं का एक अलग टिशू कल्चर पकवान लेबल।
  4. 15 मिनट के लिए या तो वाहन या epidermal वृद्धि कारक (EGF) के साथ व्यवहार्य BU.MPT responders की उत्तेजना, या तो कोई कोशिकाओं, apoptotic कोशिकाओं, या परिगलित कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए अपने जोखिम को निम्नलिखित हैं: निम्नलिखित छह शर्तों को शामिल करें।
    नोट: मृत कोशिकाओं के संपर्क में या तो उत्तेजित या एक सैनिक की गतिविधि के स्तर को बाधित कर सकतेवेंचर अणु के संकेत। उत्तेजना के लिए सबसे अच्छा एक कम आधारभूत ऊपर का पता चला है (जैसे, EGF के अभाव), निषेध सबसे अच्छा एक उच्च आधारभूत से पता चला है, जबकि (जैसे, EGF की उपस्थिति)। चूंकि मृत कोशिकाओं के साथ उत्तेजना का प्रभाव एक प्राथमिकताओं अज्ञात है, यह दोनों अभाव और EGF की उपस्थिति में सभी अध्ययनों प्रदर्शन करने की सिफारिश की है।

5. apoptotic और परिगलित कोशिकाओं (प्रोटोकॉल 4) के साथ प्रत्युत्तर कोशिकाओं की उत्तेजना

  1. महाप्राण मौन के पूर्व लेबल व्यंजन से संस्कृति के माध्यम से बी (सीरम की कमी से जूझ) BU.MPT प्रत्युत्तर कोशिकाओं (प्रोटोकॉल 3)।
    नोट: के बाद गैर-अनुमोदक की शर्तों के तहत रातोंरात संस्कृति, BU.MPT कोशिकाओं माउस गुर्दे PTEC के प्राथमिक संस्कृतियों की तरह व्यवहार करना चाहिए।
  2. प्रति 100 मिमी पकवान, निम्न में से एक के 2 एमएल जोड़ें: संस्कृति के माध्यम से बी (कोई कोशिकाओं); ~ 5 एक्स 10 6 संस्कृति के माध्यम से बी में एमएल प्रति कोशिकाओं (1 प्रोटोकॉल) पर apoptotic सेल निलंबन; पर या परिगलित सेल निलंबन ~ 5 एक्स 10 6 एमएल मैं प्रति कोशिकाओंn संस्कृति के माध्यम से बी (प्रोटोकॉल 2)।
    1. समान रूप से 100 मिमी पकवान पर मृत कोशिकाओं के 2 एमएल निलंबन बांटो, और उन्हें एक न्यूनतम करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए समय रहते हैं। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, प्रत्युत्तर सेल व्यंजनों की पूरी सतह पर एक विस्तृत टिप विंदुक के साथ ड्रॉप द्वारा मृत सेल निलंबन बूंद वितरित। निपटाने के समय को कम करने और मृत कोशिकाओं के clumping से बचने के बीच एक समझौते के रूप में 2 मिलीलीटर की मात्रा का प्रयोग करें।
      नोट: मृत कोशिकाओं के निलंबन के उपयोग के रूप में एक विशेष प्रोत्साहन विचार है, जो अधिक से अधिक विस्तार (2 टेबल और चर्चा) में नीचे वर्णित हैं के एक नंबर पर जोर देता।
    2. एक मिला हुआ 100 मिमी पकवान है, जो ~ 10 x 10 6 कोशिकाओं में शामिल करने के लिए एमएल प्रति ~ 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं में मृत कोशिकाओं के 2 एमएल जोड़कर 1: ~ 1 के एक मरा करने वाली प्रत्युत्तर सेल अनुपात पाना। वैकल्पिक रूप से, ताकि किसी भी मनाया संकेत घटनाओं की खुराक-निर्भरता की स्थापना के लिए, प्रत्युत्तर कोशिकाओं को मृत के अनुपात लगातार पंथ में प्रगतिशील कमजोर पड़ने से भिन्न हैUre प्रोटोकॉल 1 और 2 में तैयार मृत सेल निलंबन की मध्यम बी।
  3. धीरे व्यंजन ज़ुल्फ़, तो एक humidified 5% (वी / वी) सीओ 2 माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. 30 मिनट के बाद, संस्कृति डिश के पूर्व लेबलिंग के अनुसार, या तो वाहन या 50 एनएम EGF साथ प्रत्युत्तर कोशिकाओं को उत्तेजित।
  5. एक humidified 5% (वी / वी) सीओ 2 माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. , ठंडा 1x DPBS के 5 एमएल जोड़ने पकवान घूमता है, और धोने के तरल पदार्थ aspirating से मृत कोशिकाओं को दूर धो लें। तीन बार दोहराएँ।
  7. इसके तत्काल बाद आगे की प्रक्रिया के लिए बर्फ पर प्रत्युत्तर सेल व्यंजन जगह है।
  8. सेल lysates तैयार
    1. सेल निम्नलिखित युक्त बफर तैयार: 1 × Tris बफर खारा (टीबीएस), 10 मिमी सोडियम पाइरोफॉस्फेट, 0.5% w / v deoxycholate, 0.1% w / v एसडीएस, 10% ग्लिसरॉल, और 25 मिमी सोडियम फ्लोराइड।
      1. इसके तत्काल बाद, सेल सेल इंडस्ट्रीज़ में दी गई सटीक क्रम में निम्न जोड़ने से पहलेicated सांद्रता: मिनी EDTA मुक्त protease अवरोध कॉकटेल (1 गोली lysis बफर के 10 एमएल प्रति), 10% (वी / वी) ट्राइटन X-100, 1 मिमी dithiothreitol (डीटीटी), 1 मिमी phenylmethanesulfonyl फ्लोराइड (PMSF), और 10 मिमी सोडियम orthovanadate।
    2. 100 मिमी बर्फ पर हौसले से प्रेरित प्रत्युत्तर कोशिकाओं के पकवान प्रति ठंडा सेल बफर के 700 μL कदम 5.7 से जोड़ें। एक सेल खुरचनी के साथ कोशिकाओं को नोच, और lysate पूर्व ठंडा 1.5 एमएल microtubes हस्तांतरण। 15 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूबों को बनाए रखें।
    3. 20 हर्ट्ज, अवधि में कम से कम एक दूसरे प्रत्येक के 10 दालों के साथ बर्फ पर Sonicate lysates। , गैस / तरल इंटरफेस में फोम के सृजन से बचें क्योंकि इस नमूने से ज़्यादा गरम कर सकते हैं। पर पूरी तरह से sonicator स्विच करने से पहले lysates युक्त microtubes में sonicator जांच विसर्जित, और lysates से जांच निकालने से पहले sonicator बंद।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 20,000 XG पर अपकेंद्रित्र, ताजा पूर्व ठंडा microtubes में supernatants स्थानांतरणऔर -70 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
    5. जेल वैद्युतकणसंचलन और lysates के supernatants पर immunoblotting, जैसा कि पहले 6,9,10,15 वर्णित प्रदर्शन करना।

6. एक semipermeable polycarbonate झिल्ली उपयोग करते हुए लक्ष्यों और responders के बीच प्रत्यक्ष शारीरिक संपर्क की रोकथाम (प्रोटोकॉल 5)

  1. एक अपवाद के साथ, प्रोटोकॉल 3 के अनुसार BU.MPT प्रत्युत्तर कोशिकाओं को तैयार; बाँझ polystyrene टिशू कल्चर में कोशिकाओं को विकसित 12 अच्छी तरह से समूहों का इलाज किया।
  2. चुने गए कुओं में, एक 0.4 माइक्रोन पॉली कार्बोनेट झिल्ली युक्त मर चुका है और प्रत्युत्तर कोशिकाओं के बीच शारीरिक संपर्क को रोकने के लिए एक पारगम्य समर्थन प्रणाली जगह है। एक ही प्रयोग में एक झिल्ली के बिना नियंत्रण कुओं को शामिल करें।
  3. महाप्राण सीरम की कमी से जूझ BU.MPT प्रत्युत्तर कोशिकाओं की प्रयोगात्मक कुओं से संस्कृति के माध्यम से बी।
  4. apoptotic या परिगलित कोशिकाओं, निम्नलिखित संशोधनों के साथ साथ प्रत्युत्तर कोशिकाओं की उत्तेजना के लिए प्रोटोकॉल 4 का पालन करें:
    1. अच्छी तरह से प्रति 12-अच्छी तरह से क्लस्टर, निम्न में से एक की 0.1 मिलीलीटर जोड़ें: संस्कृति के माध्यम से बी (कोई कोशिकाओं); ~ 5 एक्स 10 6 संस्कृति के माध्यम से बी में एमएल प्रति कोशिकाओं (1 प्रोटोकॉल) पर apoptotic सेल निलंबन; या संस्कृति के माध्यम से बी में एमएल प्रति ~ 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं (प्रोटोकॉल 2) में परिगलित सेल निलंबन।
      नोट: एक 12 अच्छी तरह से क्लस्टर का एक मिला हुआ अच्छी तरह से होता है के रूप में ~ 0.5 x 10 6 कोशिकाओं, ~ में मृत कोशिकाओं के 0.1 एमएल के अलावा एमएल प्रति 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं की एक मरा करने वाली प्रत्युत्तर सेल अनुपात ~ पैदावार 1: 1।
    2. पारगम्य समर्थन प्रणाली से युक्त कुओं के लिए, पारगम्य समर्थन प्रणाली के भीतर 0.4 माइक्रोन पॉली कार्बोनेट झिल्ली के शीर्ष पर मृत कोशिकाओं को जोड़ने के लिए, तो वहाँ मर चुका है और प्रत्युत्तर कोशिकाओं के बीच कोई सीधा शारीरिक संपर्क है।

Cytochalasin डी के साथ phagocytosis की 7. निषेध (प्रोटोकॉल 6)

  1. प्रोटोकॉल 3 के अनुसार BU.MPT प्रत्युत्तर कोशिकाओं को तैयार।
  2. dimeth में cytoskeletal अवरोध cytochalasin डी तैयारYL sulfoxide 4 मिलीग्राम / एमएल (1,000 ×) में (DMSO)। BU.MPT प्रत्युत्तर कोशिकाओं के पूर्व लेबल व्यंजन जोड़े या तो वाहन के 10 μL (DMSO) या cytochalasin डी के 10 μL संस्कृति के माध्यम बी के 10 एमएल में 4 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए
    नोट: BU.MPT कोशिकाओं और एक बृहतभक्षककोशिका सेल लाइन से cytochalasin डी, phagocytosis की इस एकाग्रता पर ≥90% 9,10 से हिचकते था।
  3. एक humidified 5% (वी / वी) सीओ 2 माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं।
  4. apoptotic या परिगलित कोशिकाओं के साथ प्रत्युत्तर कोशिकाओं की उत्तेजना के लिए प्रोटोकॉल 4 का पालन करें।
  5. उचित रूप में, मर चुका है और प्रत्युत्तर कोशिकाओं (या कोशिकाओं को इस उद्देश्य के लिए आरक्षित) की एक अलग तैयारी का उपयोग प्रवाह cytometry द्वारा मृत कोशिकाओं के phagocytosis के निषेध की पुष्टि के रूप में पहले 9,10 का वर्णन किया।

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Representative Results

चित्रा 1 में, हम एक योजनाबद्ध समय और महत्वपूर्ण कदम apoptotic कोशिकाओं की तैयारी में शामिल (1 प्रोटोकॉल) और परिगलित कोशिकाओं (प्रोटोकॉल 2) और apoptotic और परिगलित कोशिकाओं के निलंबन के साथ प्रत्युत्तर कोशिकाओं की उत्तेजना (प्रोटोकॉल 4) चित्रण प्रदान करते हैं।

चित्रा 2 में, हम सेरीन-threonine काइनेज ग्लाइकोजन synthase काइनेज-3 (जीएसके-3), जीएसके-3α और जीएसके-3β के दो isoforms के फोस्फोराइलेशन पर apoptotic कोशिकाओं का असर दिखा प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करते हैं। जीएसके-3α / β सेलुलर प्रसार और अस्तित्व के नियमन में एक प्रमुख भूमिका है, साथ ही ग्लूकोज चयापचय में इसकी महत्वपूर्ण भूमिका है। सेरीन-9 पर सेरीन -21 और जीएसके-3β में जीएसके-3α के फोस्फोराइलेशन काइनेज गतिविधि को रोकता है और बदले में, सुराग फोस्फोराइलेशन कमी आई है और वृद्धि की β-catenin के स्थिरीकरण के लिए। बीटा cateninतो नाभिक है, जहां यह सेल प्रसार को प्रोत्साहित और apoptosis को बाधित करने के लिए जाना जाता है जीनों के प्रतिलेखन को बढ़ावा देता है translocates। इसलिए, जीएसके-3α / β की वृद्धि की phosphorylation वृद्धि प्रसार और अस्तित्व के साथ जुड़ा हुआ है, जबकि जीएसके-3α / β के फोस्फोराइलेशन में कमी आई प्रसार और अस्तित्व के साथ संबद्ध कमी आई है।

मौन BU.MPT responders का एक्सपोजर 30 मिनट जीएसके-3α / β (2A चित्रा) के जोरदार हिचकते बेसल फोस्फोराइलेशन के लिए कोशिकाओं apoptotic करने के लिए। इसी तरह, 30 मिनट के लिए apoptotic लक्ष्यों को करने से पहले जोखिम जोरदार बाद epidermal वृद्धि कारक (EGF) जीएसके-3α / β (2A चित्रा) के प्रेरित फोस्फोराइलेशन हिचकते हैं। इसके विपरीत, परिगलित कोशिकाओं को BU.MPT responders के जोखिम जीएसके-3α / β के दोनों बेसल या EGF प्रेरित फोस्फोराइलेशन पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा।

preven करने के लिएBU.MPT responders और apoptotic कोशिकाओं के बीच टी शारीरिक संपर्क, BU.MPT responders एक पारगम्य समर्थन प्रणाली में हो गई है और एक 0.4 माइक्रोन पॉली कार्बोनेट झिल्ली द्वारा apoptotic लक्ष्यों से अलग हो गए थे। BU.MPT responders और apoptotic कोशिकाओं के बीच शारीरिक संपर्क की रोकथाम जीएसके-3α / β (चित्रा 2 बी) के फोस्फोराइलेशन को बाधित करने apoptotic लक्ष्यों की क्षमता समाप्त कर दिया। phagocytosis की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए, हम मृत कोशिकाओं की phagocytic तेज रोकने के लिए cytoskeletal अवरोध cytochalasin डी का इस्तेमाल किया। Apoptotic कोशिकाओं के जवाब में जीएसके-3α / β के फोस्फोराइलेशन का निषेध phagocytosis की अनुपस्थिति (चित्रा -2) में हुई। हम पहले कि cytochalasin डी से पता चला है, का इस्तेमाल किया एकाग्रता में, ≥90% 9,10 द्वारा PTEC और बृहतभक्षककोशिका phagocytosis को रोकता है। साथ में ले ली, हमारे परिणाम बताते हैं कि GSK3α / β के फोस्फोराइलेशन की apoptotic सेल की मध्यस्थता निषेध प्रत्यक्ष शारीरिक संपर्क की आवश्यकता है betwe लक्ष्य और प्रत्युत्तर कोशिकाओं, लेकिन एन phagocytosis से स्वतंत्र है।

आकृति 1
चित्रा 1। के लिए सेल मौत के दौर से गुजर पड़ोसी की कोशिकाओं के साथ शारीरिक संपर्क से व्यवहार्य प्रत्युत्तर कोशिकाओं में intracellular संकेतन की प्रेरण घटनाओं स्कीमा। लाइन रेखांकन (ए) apoptotic (एपीओ) सेल और (बी) परिगलित (Necro) BU.MPT कोशिकाओं के सेल निलंबन की तैयारी में समय और महत्वपूर्ण घटनाओं को दर्शाती है, और (सी) में व्यवहार्य BU.MPT प्रत्युत्तर की उत्तेजना apoptotic या परिगलित कोशिकाओं के निलंबन के साथ कोशिकाओं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2। GSK3α / apoptotic कोशिकाओं को प्रदर्शन के बाद BU.MPT प्रत्युत्तर प्रकोष्ठों में β के फोस्फोराइलेशन का निषेध प्रत्यक्ष सेल सेल बातचीत की आवश्यकता है लेकिन phagocytosis की स्वतंत्र है। सीरम की कमी से जूझ BU.MPT प्रत्युत्तर कोशिकाओं के साथ (ए, बी) के वाहन या (सी) cytochalasin डी (4 माइक्रोग्राम / एमएल), 2 घंटे के लिए pretreated और फिर 30 मिनट के लिए प्रेरित कर रहे थे कोई कोशिकाओं के साथ (-), apoptotic कोशिकाओं (ए पी ओ ), या एक मृत सेल में परिगलित कोशिकाओं (एनईसी) 1 के अनुपात सेल प्रत्युत्तर के लिए: 1। प्रत्युत्तर कोशिकाओं को फिर धोया गया, और incubated अभाव या EGF (50 एनएम) की उपस्थिति में एक और 15 मिनट के लिए, कटाई से पहले। apoptotic कोशिकाओं का स्रोत staurosporine इलाज BU.MPT कोशिकाओं था। परिगलित कोशिकाओं का स्रोत गर्मी का इलाज BU.MPT कोशिकाओं था। मृत कोशिकाओं और BU.MPT responders के बीच बातचीत प्रत्यक्ष सक्षम करने, बेरोक या तो (ए, सी) थामृत सेल प्रत्युत्तर शारीरिक संपर्क, या (ख) एक पारगम्य समर्थन प्रणाली में एक 0.4 माइक्रोन पॉली कार्बोनेट झिल्ली से मृत कोशिकाओं और responders की जुदाई के साथ। मृत कोशिकाओं और गैर पक्षपाती प्रत्युत्तर कोशिकाओं धोने से हटा दिया गया है, और BU.MPT प्रत्युत्तर सेल lysates के रूप में दिखाया विरोधी फॉस्फोरिलेटेड GSK3α / β एंटीबॉडी के साथ जांच कर रहे थे। समान लोडिंग कुल glyceraldehyde-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH) के लिए जांच कर रही द्वारा पुष्टि की गई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

घटना का संकेत इस तंत्र संभालने पर प्रभाव
हस्तक्षेप घुलनशील मध्यस्थ रिसेप्टर की मध्यस्थता मान्यता phagocytosis
apoptotic कोशिकाओं का निर्धारण * निकाल देना हठ हठ
apoptotic और प्रत्युत्तर कोशिकाओं के भौतिक जुदाई † हठ निकाल देना निकाल देना
stimulus¶ के रूप में apoptosis के दौर से गुजर कोशिकाओं से Ultracentrifuged वातानुकूलित माध्यम हठ निकाल देना निकाल देना
प्रोत्साहन के रूप में परिगलित कोशिकाओं निकाल देना उन्मूलन या विपरीत दिशा में निर्देशित प्रतिक्रिया (जैसे, निषेध उत्तेजना बनाम) हठ
प्रोत्साहन के रूप में लेटेक्स मोती निकाल देना निकाल देना हठ
phagocytosis की Pharmacologic निषेध हठ हठ निकाल देना * परिणाम की भविष्यवाणी की है कि मान निर्धारण महत्वपूर्ण सतह निर्धारकों रिसेप्टर की मध्यस्थता मान्यता और / या phagocytosis के लिए जिम्मेदार बदल नहीं है।
† परिणाम की भविष्यवाणी की दो मान्यताओं करना पड़ेगा: पहला, कि घुलनशील मध्यस्थ काफी छोटा झिल्ली के छिद्रों apoptotic को अलग करने और कोशिकाओं को जवाब, और दूसरे के माध्यम से पारित करने के लिए है, कि किसी भी शेड पुटिकाओं या microvesicles, अक्सर कहा जाता apoptotic निकायों के लिए बहुत बड़ी हैं झिल्ली के छिद्रों के माध्यम से गुजरती हैं। पुटिकाओं या microvesicles के लिए एक भूमिका बनाम ultracentrifuged वातानुकूलित माध्यम apoptotic और प्रत्युत्तर कोशिकाओं के भौतिक जुदाई के साथ मनाया संकेत घटनाओं में सामंजस्य की कमी के द्वारा सुझाव दिया जाएगा।
ultracentrifugation (30 मिनट के लिए 20,000 × छ) किसी भी apoptotic निकायों को दूर करने के लिए या अन्य अघुलनशील सामग्री है कि प्रभावी तरीके की नकल कर सकते हैं बहाया आवश्यक हैबरकरार apoptotic सेल के सीटीएस।

तालिका 1। तंत्र (s) apoptotic कोशिकाओं को प्रदर्शन के बाद व्यवहार्य कोशिकाओं में घटनाक्रम संकेतन के लिए जिम्मेदार की पहचान। कई सीधा प्रयोगात्मक रणनीतियों apoptotic कोशिकाओं के लिए जोखिम के बाद मनाया संभावित तंत्र (एस) की घटनाओं के लिए जिम्मेदार संकेत के बीच भेद करने के लिए प्रदान की जाती हैं। ये तंत्र में शामिल हैं: प्रत्युत्तर सेल पर विशिष्ट रिसेप्टर्स के साथ apoptotic सेल के शारीरिक संपर्क, apoptotic सेल से घुलनशील मध्यस्थों की रिहाई, और प्रत्युत्तर सेल की phagocytic मशीनरी की सगाई की।

प्रायोगिक मुद्दा न्यूनीकरण और / या तरक़ीब के लिए उपलब्ध रणनीतियों
सीमित संख्याजवाब सेल प्रति के apoptotic कोशिकाओं (~ 1: 1 के अनुपात)। 1. apoptotic कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि, लेकिन apoptotic करने वाली प्रत्युत्तर सेल अनुपात <2 रखा जाना चाहिए: 1. *
apoptotic कोशिकाओं की गंभीरता पर निर्भर निपटाने के लिए की जरूरत है। 1. माध्यम की मात्रा में जो apoptotic कोशिकाओं निलंबित कर रहे हैं कम से कम।
2. अपकेंद्रित्र पकवान या थाली में अधिक तेजी से निलंबित माध्यम से apoptotic कोशिकाओं ड्राइव करने के लिए।
apoptotic कोशिकाओं के असमान वितरण स्थानिक। 1. ध्यान प्रत्युत्तर सेल व्यंजनों की पूरी सतह पर एक विस्तृत टिप विंदुक के साथ ड्रॉप द्वारा apoptotic सेल निलंबन बूंद वितरित।
2. बचें संस्कृति बर्तन या एक व्यास <35 मिमी, जिसमें meniscal प्रभाव असमान वितरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के साथ कुओं।
apoptotic सेल की आबादी की विविधता। 1. एक मजबूत inducer का प्रयोग करेंके apoptosis।
2. प्रेरण के बाद, प्रवाह cytometry एक और अधिक समान आबादी प्राप्त करने के लिए paraformaldehyde के साथ apoptotic कोशिकाओं को ठीक करने, और तरह से।
* कम से apoptotic करने वाली प्रत्युत्तर सेल अनुपात> 2: 1, apoptotic कोशिकाओं मिला हुआ कालीन बनेगी और अतिरिक्त apoptotic कोशिकाओं अब कोई प्रत्युत्तर कोशिकाओं के साथ सीधे संपर्क कर देगा

तालिका 2। Intracellular संकेत घटनाओं के एक प्रोत्साहन के रूप में एक सेलुलर सस्पेंशन के उपयोग के साथ प्रायोगिक मुद्दे एसोसिएटेड। कई प्रयोगात्मक एक प्रोत्साहन के रूप में एक सेल निलंबन के इस्तेमाल से जुड़े बाधाओं को सूचीबद्ध कर रहे हैं, साथ ही उनके आंशिक उपचार के लिए रणनीतियों।

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Discussion

हम यहाँ apoptosis, या कोशिका मृत्यु के अन्य रूपों के दौर से गुजर कोशिकाओं को उनके प्रदर्शन के बाद intracellular संकेत घटनाओं व्यवहार्य कोशिकाओं में प्रेरित निस्र्पक के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल कई तंत्र है जिसके द्वारा apoptotic कोशिकाओं के लिए जोखिम व्यवहार्य प्रत्युत्तर कोशिकाओं के भीतर intracellular संकेत दे रास्ते मिलाना कर सकते हैं पर जोर दिया। ये तंत्र में शामिल हैं: बातचीत (मृत सेल या उसके शेड पुटिकाओं और microvesicles पर अणुओं या सतह निर्धारकों को पाटने के माध्यम से, अक्सर apoptotic निकायों कहा जाता है) प्रत्युत्तर सेल पर विशिष्ट रिसेप्टर्स के साथ; घुलनशील मध्यस्थों (या यहां तक कि उनके बाह्य पीढ़ी 27) की रिहाई; और phagocytic मशीनरी की सगाई की। परिस्थितियों में पर्याप्त phagocytosis होता है के तहत, एक अतिरिक्त व्यवस्था पर विचार किया जा करने के लिए इस तरह के रूप में microRNA मध्यस्थों, apoptotic सेल या उसके पुटिकाओं 21 के भीतर समृद्ध की डिलीवरी है। हमारे प्रोटोकॉल का महत्व, ओ की तुलना मेंवहाँ के तरीके में, कई तंत्र है जिसके द्वारा apoptotic कोशिकाओं कोशिकाओं के भीतर जवाब संकेत पारगमन मिलाना कर सकते हैं की अपनी सावधान विच्छेदन में निहित है। एक प्रमुख लाभ यह है कि आवश्यक तकनीक का सबसे सरल और सेल संस्कृति के लिए मानक हैं।

जबकि प्रोटोकॉल BU.MPT कोशिकाओं, एक अमर माउस गुर्दे PTEC लाइन, दोनों मर चुका है और जवाब कोशिकाओं के स्रोत के रूप में के लिए विशिष्ट है, अन्य सेल लाइनों या प्राथमिक सेल संस्कृतियों के लिए प्रोटोकॉल के अनुकूलन सरल और आसानी से लागू किया है। इसके अलावा, हमारे पिछले प्रकाशनों के रूप में, मर चुका है और जवाब कोशिकाओं के स्रोत की आवश्यकता जरूरी ही 9,10,19 नहीं। हम staurosporine और apoptosis और नेक्रोसिस के inducers के रूप में गर्मी के उपयोग का वर्णन करते हैं, क्रमशः, मोड और कोशिका मृत्यु के ट्रिगर भी भिन्न हो सकते हैं। apoptotic कोशिकाओं को प्रदर्शन के बाद BU.MPT responders में प्रेरित संकेत घटनाओं apoptosis प्रेरण की विधा का काफी हद तक स्वतंत्र हैं, हम हाकुछ मतभेद 9,10 मनाया जाना है। इस कारण से, हम apoptotic कोशिका मृत्यु के कई अलग अलग चलाता है के साथ नकल कुंजी परिणाम सलाह देते हैं। उदाहरण के लिए, अगर इस तरह मैक्रोफेज के रूप में अत्यधिक phagocytic कोशिकाओं, responders 4,6 के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं, या responders और मृत कोशिकाओं के बीच बातचीत की अवधि काफी लंबे समय पर्याप्त phagocytosis लिए होते हैं, तो एक के एक गैर विषैले inducer पर विचार कर सकता है अगर apoptosis, जैसे ultraviolet- या गामा विकिरण 4,9,10, विष के संभावित phagocytic वितरण बाहर शासन करने के लिए। नेक्रोसिस की प्रेरण के वैकल्पिक तरीके पर भी विचार किया जा सकता है। हम हीटिंग और कोशिकाओं के फ्रीज विगलन के साथ समान परिणाम प्राप्त किया है, जबकि व्यापक सेल clumping और मलबे फ्रीज विगलन के साथ होने वाली इसके उपयोग समस्याग्रस्त हैं।

कई सरल रणनीतियों किसी भी संकेत घटनाओं के लिए जिम्मेदार विशेष तंत्र apoptotic कोशिकाओं (तालिका 1 के लिए जोखिम के बाद मनाया स्पष्ट करने के लिए मदद कर सकते हैं 1 टेबल में विस्तृत रूप में मनाया संकेत घटना पर प्रभाव जिम्मेदार तंत्र इंगित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, apoptotic सेल के रिसेप्टर की मध्यस्थता मान्यता के मामले में, सिगनल घटना apoptotic सेल के निर्धारण के बावजूद जारी रहती है चाहिए, और वातानुकूलित मध्यम या लेटेक्स मोती, के रूप में अच्छी तरह से शारीरिक जुदाई के साथ के रूप में apoptotic कोशिकाओं के प्रतिस्थापन के साथ समाप्त किया जाना चाहिए मर चुका है और जवाब कोशिकाओं की। परिगलित कोशिकाओं के जवाब में, सिगनल घटना समाप्त किया जाना चाहिए या विपरीत दिशा में निर्देशित हो जाते हैं (जैसे, उत्तेजना बनाम निषेध)।

(तालिका 2) के सफल क्रियान्वयन के लिए महत्वपूर्ण है। इन समस्याओं के अधिकांश सेल जवाब प्रति apoptotic कोशिकाओं की प्रयोगात्मक प्रतिबंधित नंबर से निकाले जाते हैं। यह घुलनशील कारकों के विपरीत है। यहां तक ​​कि जब साइटोकिन्स की बेहद कम femtomolar सांद्रता विशेषता पर इस्तेमाल किया, घुलनशील ligands की संख्या अब तक जवाब कोशिकाओं की संख्या से अधिक है। apoptotic कोशिकाओं के मामले में, हालांकि, steric विचार एक अनुपात प्रति व्यवहार्य जवाब सेल एक मृत सेल से काफी ऊपर में मृत कोशिकाओं के अलावा रोकता। एक बहुत ही वास्तविक डिग्री करने के लिए, इसलिए, हर मृत सेल मायने रखती है।

इस के कई परिणाम मृत करने वाली प्रत्युत्तर सेल अनुपात कर सकते हैं कि प्रतिबंधित कर रहे हैंएक कमी या संकेत घटनाओं के obscuring पैदा होती हैं। एक व्यवहार्य प्रत्युत्तर सेल के साथ शारीरिक रूप से बातचीत करने के लिए, एक apoptotic सेल पहली मध्यम निलंबित के स्तंभ के माध्यम से समझौता करना होगा। भी न्यूनतम मात्रा के साथ, कोशिकाओं के निपटाने के लिए समय के रूप में लंबे समय के रूप में 10 से 20 मिनट प्रशंसनीय हो सकता है। Intracellular संकेत घटनाओं इस प्रकार जवाब कोशिकाओं के बीच बेबुनियाद दिया जाएगा। इसलिए, प्रत्युत्तर और मृत कोशिकाओं के बीच आरंभिक संपर्क ठीक समय पर नहीं किया जा सकता है, बल्कि समय की कुछ हद तक एक व्यापक रेंज के भीतर गिर जाता है। घटनाओं है कि एक timescale को निपटाने के लिए आवश्यक है कि अधिक से कम पर होने के संकेत के लिए, तुल्यकालन की इस कमी के संकेत यह अब पृष्ठभूमि से अलग पहचाना है कि इस तरह के एक obscuring करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। विस्तारित अवधि का भी संकेत है, पर्याप्त परिमाण के नहीं हैं, इस मुद्दे के लिए अतिसंवेदनशील हो सकता है।

इन अस्थायी मुद्दों के अलावा, स्थानिक मामलों पर भी प्रतिकूल परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं। Meniscal प्रभाव, विशेष रूप से कुओं में और एस के व्यंजनमॉल व्यास, या बहुत सशक्त pipetting द्वारा उत्पन्न मृत कोशिकाओं की एक गैर वर्दी वितरण करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं तरल पदार्थ धाराओं (जैसे, polystyrene टिशू कल्चर 96 अच्छी तरह से समूहों का इलाज), जिससे कोशिकाओं प्रत्युत्तर में दावत या अकाल के एक राज्य का निर्माण। चूंकि मापा संकेत एक भी अच्छी तरह से या प्लेट में सभी प्रत्युत्तर कोशिकाओं के उस से निकला है, मृत कोशिकाओं के कब्जा में भिन्नता कमजोर संकेतों को अस्पष्ट कर सकते हैं।

एक अंतिम मुद्दा apoptotic सेल की आबादी की विविधता से संबंधित है। यहां तक ​​कि ऐसे staurosporine के रूप में apoptosis के एक मजबूत ट्रिगर, साथ, मृत कोशिकाओं के किसी भी तैयारी मौत प्रक्रिया के कई चरणों में कोशिकाओं में शामिल होंगे। यह प्रासंगिक हो जाता है, अगर apoptotic सेल के जवाब की ताकत मौत प्रक्रिया 10,14 के भीतर अपनी अवस्था पर निर्भर करता है। चूंकि औसतन हर जवाब सेल सिर्फ एक apoptotic सेल का सामना करना पड़ता है, इस मामले में विविधता समग्र पता लगाया संकेत घटना के कमजोर करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। सारणी 2

वहाँ कई अन्य प्रयोगात्मक चिंताओं विशिष्ट एक प्रोत्साहन के रूप में मृत कोशिकाओं के इस्तेमाल से जुड़े रहे हैं। महत्वपूर्ण बात है, संस्कृति की स्थिति न केवल जवाब कोशिकाओं, लेकिन यह भी मृत कोशिकाओं को खुद को प्रभावित कर सकता है। उदाहरण के लिए, सीरम प्रोटीन, अगर मौजूद है, मृत सेल की सतह के लिए संलग्न कर सकते हैं, और बढ़ाने या कोशिकाओं जवाब देने से इसकी मान्यता को रोकती हैं। में एक असंगत परिणाम के निवारण के लिए, या एक परिणाम के साहित्य में सूचना दी कि से भिन्न है, ध्यान निम्नलिखित संस्कृति की स्थिति (दोनों प्रत्युत्तर और मृत कोशिकाओं के लिए) के लिए दिया जाना चाहिए: संगम, बीतने संख्या, सीरम की उपस्थिति, सीरम की गर्मी निष्क्रियता की डिग्री , और प्रकृति और निष्क्रियता की अवधि। अंत में, एक है कि कोशिका मृत्यु सभी सेल संस्कृति का एक निष्ठुर पहलू है जागरूक होने की जरूरत है, और प्रत्युत्तर कोशिकाओं इसलिए लगातार मृत का स्तर कम करने के लिए सामने आ रहे हैंकोशिकाओं। यह जोखिम संभावित, मृत कोशिकाओं की एक सांस के लिए प्रयोगात्मक प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं के बाद से अध्ययन के तहत बहुत संकेतों लगातार प्रेरित किया जा रहा है। संकेत मॉडुलन सामान्य प्रतिक्रिया रास्ते के माध्यम से, या यहां तक ​​कि प्रत्युत्तर कोशिकाओं की एक उप-जनसंख्या के चयन के माध्यम से पीछा करना हो सकता है, खासकर अगर प्रेरित संकेत घटनाओं अस्तित्व या प्रसार शामिल है।

सारांश में, हम intracellular संकेत घटनाओं आसन्न मृत या मर कोशिकाओं के साथ उनके शारीरिक संपर्क से व्यवहार्य कोशिकाओं में प्रेरित के निर्धारण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है। हालांकि फोकस मृत कोशिकाओं के रिसेप्टर की मध्यस्थता मान्यता से प्रेरित घटनाओं के संकेत पर मुख्य रूप से है, प्रोटोकॉल भी phagocytic तेज या मृत कोशिकाओं से घुलनशील मध्यस्थों की रिहाई से प्रेरित घटनाओं संकेत की पहचान के लिए परमिट। एक प्रोत्साहन के रूप में मृत कोशिकाओं के उपयोग के कई अनूठी कारक है कि intracellular संकेत घटनाओं का पता लगाने में बाधा कर सकते हैं परिचय। इन यू के बारे में जागरूकताnique कारक है, साथ ही कई तंत्र है जिसके द्वारा मृत कोशिकाओं intracellular संकेतन मिलाना, अध्ययन के इस बढ़ते क्षेत्र के भीतर डिजाइन और प्रयोगों की व्याख्या करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल तंत्र है जिसके द्वारा मृत या मर कोशिकाओं दोनों स्वास्थ्य और रोग में उनके रहते पड़ोसियों को प्रभावित समझने में सहायता करनी चाहिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture materials
DMEM, 1x with [4.5 g/L] glucose, ʟ-glutamine & sodium-pyruvate Mediatech (Manassas, VA) 10-013-CV
HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum GE Healthcare (Logan, UT) SH30066.03 add 10% (v/v)  to the culture medium A
Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100x Life Technologies (Grand Island, NY) 10378-016 add 100 units/mL to the culture media A and B
γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) 407303 add 10 units/mL to the culture medium A
Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic Corning (Durham, NC) 353003 sterile, 100 mm diameter
Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom Corning (Durham, NC) 352095 sterile, 15 mL
Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco Fisher (Waltham, MA) 25300062 sterile, 100 mL
Name Company Catalog Comments
Chemicals and inhibitors
Staurosporine, from Streptomyces sp. Sigma (St. Louis, MO) S4400 use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis
Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/mL] Millipore (Billerica, MA) EA140 use at 50 nM to stimulate responder cells
UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies (Grand Island, NY) 15575-038 use 5 mM to detach adherent cells
Trypan blue solution, 0.4% MP Biomedicals (Santa Ana, CA) 91691049 for dead cells staining
Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS Affymetrix (Santa Clara, CA) 19943 use 0.4% (v/v) in 1x DPBS for cell fixation
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1x, Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) 14040133 stock solution
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+- and Mg2+-free, 1x, Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) 14190367 stock solution
Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii Sigma (St. Louis, MO) C8273 use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma (St. Louis, MO) D2650 solvent for cytochalasin D
Name Company Catalog Number Comments
Cell lysis buffer ingredients
Tris-buffered saline (TBS), 10x, pH 7.4 BioRad (Hercules, CA) 1706435 for cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 221368 10 mM for cell lysis buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) D6750 0.5% w/v for cell lysis buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) L3771  0.1% w/v for cell lysis buffer
Glycerol Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) G5516 10% for cell lysis buffer
Sodium fluoride Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 450022 25 mM for cell lysis buffer
Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) 4693159001 for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer
Triton X-100 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) T8787 10% for cell lysis buffer
Dithiothreitol (DTT) MP Biomedicals (Santa Ana, CA) 11DTT00005 1 mM for cell lysis buffer
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) MP Biomedicals (Santa Ana, CA) 4800263 1 mM for cell lysis buffer
Sodium orthovandate MP Biomedicals (Santa Ana, CA) 2159664 10 mM for cell lysis buffer
Name Company Catalog Comments
Equipment
Sorvall T6000B centrifuge Du Pont (Wilmington, DE) T6000B
Fisher Tissuemat, water bath Fisher (Waltham, MA)
Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 Fisher (Waltham, MA)
Miscellaneous
Cell counting chamber, Neubauer Hawksley (Lancing, Sussex, UK) AC2000
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II Millipore (Billerica, MA) CBA059 for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis
Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 mL Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) T9661
Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane Corning (Corning, NY) 3413 sterile, polystyrene, tissue culture treated
Name Company Catalog Comments
Antibodies
Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody Cell Signaling Technology 9331 rabbit polyclonal antibody
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) Cell Signaling Technology 2118 rabbit monoclonal antibody

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 118 कोशिका मृत्यु विनियमित कोशिका मृत्यु दुर्घटना कोशिका मृत्यु Apoptosis परिगलन संकेत पारगमन उपकला कोशिकाओं सहज उन्मुक्ति किडनी सेल संस्कृति रिसेप्टर की मध्यस्थता मान्यता
Intracellular बातचीत के द्वारा व्यवहार्य कोशिकाओं में प्रेरित घटनाओं पड़ोसी कोशिकाओं के दौर से गुजर apoptotic कोशिका मृत्यु के साथ सिगनल की पहचान
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Vujicic, S., Feng, L., Antoni, A., Rauch, J., Levine, J. S. Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death. J. Vis. Exp. (118), e54980, doi:10.3791/54980 (2016).

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