Abstract
Afsterven door apoptose, ook wel aangeduid als gereguleerde celdood verkrijgen meerdere nieuwe activiteiten waarmee ze de functie van aangrenzende levende cellen beïnvloeden. Vitale activiteiten, zoals overleving, proliferatie, groei, en differentiatie, behoren tot de vele celfuncties gemoduleerd door apoptotische cellen. Het vermogen om te herkennen en reageren op apoptotische cellen blijkt een algemene kenmerk van alle cellen, ongeacht geslacht of orgaan van oorsprong. De diversiteit en complexiteit van de respons op apoptotische cellen mandaat dat grote zorg worden genomen bij het ontleden van de signalerende pathways en gebeurtenissen die verantwoordelijk zijn voor een bepaalde uitkomst. Met name moet een onderscheid worden gemaakt tussen de verschillende mechanismen die apoptotische cellen kunnen beïnvloeden intracellulaire signaleringsroutes in levensvatbare responder cellen, inclusief:-receptor gemedieerde opname van de apoptotische cellen, afgifte van oplosbare mediators van de apoptotische cellen en / of inzet van de phagocytic machines. Hier bieden we een protocol voor het identificeren van intracellulaire signalering gebeurtenissen die geïnduceerd worden in levensvatbare responder cellen na hun blootstelling aan apoptotische cellen. Een groot voordeel van het protocol ligt in de aandacht die het besteedt aan dissectie van het mechanisme waarmee apoptotische cellen moduleren signalering evenementen binnen reagerende cellen. Terwijl het protocol specifiek is voor een conditioneel onsterfelijk muizennier proximale tubulaire cellijn (BU.MPT cellen), is het gemakkelijk aangepast cellijnen die niet-epitheliale oorsprong en / of afkomstig uit andere dan de nier organen. Het gebruik van dode cellen als een stimulans introduceert een aantal unieke factoren die de detectie van intracellulaire signalering gebeurtenissen kunnen belemmeren. Deze problemen, alsmede strategieën om deze te minimaliseren of te omzeilen, zijn in het protocol beschreven. De toepassing van dit protocol moet onze groeiende kennis van de brede invloed die dode of stervende cellen uit te oefenen op hun live buren te helpen, zowel in de gezondheidszorg en in disease.
Introduction
Apoptose of gereguleerde celdood 1, draagt op een essentiële manier om het onderhoud en de ontwikkeling van de weefsels. Het eenvoudigst bekeken, apoptose vergunningen oud, beschadigd, of overtollige cellen worden verwijderd zonder schade aan omringende weefsels 2,3. De bijdrage van apoptose aan weefsel homeostase echter aanzienlijk dynamischer en gevarieerd. Afsterven door apoptose verwerven meerdere nieuwe activiteiten, zowel uitgescheiden en celgebonden, waardoor zij de functie van aangrenzende levende cellen 4-10 beïnvloeden. Eerdere studies gericht op het vermogen van cellen om apoptotische 11-16 ontsteking onderdrukken, maar ook apoptotische cellen moduleert een breed scala van cellulaire functies, met inbegrip van vitale activiteiten 4,9,10 overleving, proliferatie 4,9,10, 17 differentiatie, 18 migratie en groei 19. Bovendien worden deze effecten niet beperkt tot professionele fagocyten, zoals macrofaags, maar breiden tot vrijwel alle geslachten en cellen, ook traditioneel niet-fagocytische cellen, zoals epitheel- en endotheelcellen 7,9,10,18-21.
De specifieke reactie van aangrenzende levende cellen na blootstelling aan apoptotische cellen afhankelijk van factoren die betrekking hebben op zowel de levensvatbare reagerende cellen en apoptotische cellen zelf. Hoewel bijvoorbeeld blootstelling aan apoptotische cellen de proliferatie van zowel murine macrofagen en nier proximale tubulaire epitheelcellen (PTECs) remt deze twee celtypen verschillen aanzienlijk in hun overlevingsreactie apoptotische cellen 4,6,9,10. Apoptotische cellen bevorderen van de overleving van macrofagen, maar wekken de apoptotische dood van PTECs 4,6,9,10. Met name kan de reactie op apoptotische cellen ook verschillen tussen reagerende cellen van dezelfde stam, afhankelijk van de reagerende cel orgaan van oorsprong 10 (bijvoorbeeld nier PTECs versus mammaire epithelialecellen) of de toestand van de activering 22 (bijvoorbeeld neutrofielen). Omgekeerd kan apoptotische cellen verschillende reacties oproepen in dezelfde cel afhankelijk van de aard van de apoptotische stimulus 10,23 of het stadium van apoptose 10,14.
Gezien de diverseness en complexiteit van de respons op apoptotische cellen, moet grote zorg worden genomen bij het ontleden van de signalerende pathways en gebeurtenissen die verantwoordelijk zijn voor een bepaalde uitkomst. Ten eerste moet de reacties vereisen directe fysieke interactie tussen levensvatbare en apoptotische cellen worden onderscheiden van die opgewekt door oplosbare mediators vrijgelaten of gegenereerd door de apoptotische cellen 3,6-10. Als fysische interactie vereist is, dan een verder onderscheid moet worden uitgevoerd. Signaleringsgebeurtenissen kan afhangen van receptor-gemedieerde opname van de gladde spiercellen, onafhankelijk latere afblazen, of fagocytische opname, onafhankelijk van de specifieke receptor die de apoptotische cel bindt 3-7,9,10,19. In het laatste geval, de reactie is niet specifiek voor apoptotische cellen, en kan worden geactiveerd door een fagocytische materiaal 4,6.
Het belang van dit onderscheid kan weer worden gewaardeerd door de contrasterende responsen van macrofagen en nieren PTECs. Voor beide celtypen, blootstelling aan apoptotische cellen verandert de activiteit van het pro-survival Akt kinase. Modulatie is afhankelijk van de fysieke interactie, omdat de scheiding van reageren en apoptotische cellen door een 0,4 micrometer polycarbonaat membraan schaft de reactie 4,9,10,19. De reactie van PTECs is receptor-gemedieerde en onafhankelijk van fagocytose, terwijl de respons van macrofagen wordt aangedreven door fagocytose 4,9,10,19. Deze conclusie wordt ondersteund door het feit dat de blootstelling aan latex bolletjes, een neutrale fagocytische stimulus, heeft geen effect op Akt activiteit PTECs, maar imiteert het effect van apoptotische cellen in macrofagen 4,9.
"> Hoewel minder goed bestudeerd, afsterven door necrose of toevallige celdood 1, ook moduleren van de functie van het nabijgelegen levensvatbare cellen 3-10,19. Zoals apoptotische cellen, necrotische cellen hun werking uitoefenen via verschillende mechanismen, met name de lekkage intracellulaire inhoud door hun gescheurde celmembraan 3,5,6,9,24. Veel cellen, waaronder PTECs en macrofagen, beschikken over verschillende niet-concurrerende receptoren voor cellen sterven door necrose 5,9. Engagement van deze receptoren induceert signalering gebeurtenissen die vaak tegengesteld aan die geïnduceerd door blokkering van de receptoren voor apoptotische cellen 4-10,19. bijvoorbeeld in PTECs, necrotische cellen verhogen fosforylatie van Akt, terwijl apoptotische cellen verminderen fosforylering 9,10,19. We beschrijven hier een protocol voor het identificeren van intracellulaire signalering gebeurtenissen geïnduceerd in vatbare nier PTECs doorgaande receptor gemedieerde opname van aangrenzende apoptotische PTECs
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereidingen
Opmerking: In dit protocol twee of meer cellijnen of primaire celculturen, onafhankelijk bereid onder specifieke omstandigheden. Deze preparaten omvatten apoptotische cellen (Protocol 1), necrotische cellen (protocol 2) en gezonde responder cellen (protocol 3). Na onafhankelijke bereiding worden apoptotische of necrotische cellen tot responder cellen toegevoegd en het resulterende signaal transductie wordt bewaakt (protocollen 4, 5 en 6).
- Bereid cultuur media en reagentia
- Bereid 500 ml kweekmedium A (voor gebruik bij het kweken cellen onder permissieve omstandigheden, zie paragraaf 1.2) door het volgende te combineren: 1x Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) dat 4,5 g / l glucose, 584 mg / l ʟ-glutamine, 110 mg / l natriumpyruvaat, 100 eenheden / ml penicilline-streptomycine, 10% (v / v) foetaal runderserum (FBS) en 10 eenheden / ml interferon-γ (IFN-γ).
- Bereid 500 ml kweekmedium B (voor gebruik when-serum uitgehongerde cellen onder niet-permissieve condities, zie paragraaf 1.2) door het weglaten van FBS en IFN-γ van het recept van kweekmedium A. Om cellen groeien onder niet-permissieve omstandigheden (voorafgaand aan serum-uithongering), voeg 10% v / v FBS aan kweekmedium B.
- Bereid 0,4% (v / v) paraformaldehyde, pH 7,2, in 1 x Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) van 4% paraformaldehyde voorraad voor fixatie van dode cellen.
Opmerking: Paraformaldehyde is giftig, en de nodige voorzichtigheid moet worden betracht bij het gebruik ervan.
- Cultuur BU.MPT cellen
- Dooi van vloeibare stikstof één flacon BU.MPT cellen.
Opmerking: BU.MPT een muis nier proximale tubulaire epitheel cel (PTEC) lijn afgeleid van een transgene muis die van een temperatuurgevoelige (ts) mutatie (tsA58) van het SV40 grote tumor-antigeen (TAg) onder controle van de muis belangrijkste histocompatibility complex (MHC) H-2Kb klasse I promotor 25,26. - Plaat cellen op steriele polystyrene vacuüm-gasplasma behandeld weefselkweek gerechten (~ 5 x 10 6 cellen per 100 mm diameter gerecht).
- Kweek cellen onder permissie-omstandigheden in een bevochtigde 5% (v / v) CO2 atmosfeer.
Opmerking: permissie-omstandigheden, die worden gedefinieerd als kweek bij 33-37 ° C in aanwezigheid van IFN-γ, zorgen voor stabiele expressie van de gemuteerde tsA58-TAg transgen. In tegenstelling tot de primaire kweken van muis nier PTEC, die niet meer overleven dan een enkele passage of twee, BU.MPT gekweekt onder permissieve omstandigheden voor onbepaalde tijd kan worden gepasseerd.- Passage cellen minstens driemaal na ontdooien alvorens ze in een experiment.
- Om passage cellen, voeg 1 ml 0,05% trypsine per 100 mm schaal en incuberen in een bevochtigde 5% (v / v) CO2 atmosfeer bij 37 ° C gedurende 5 min. Neutraliseer de trypsine door toevoeging van 10 ml van medium A. Zuig het losgemaakte cellen en gesplitst 1: 3 tot 1: 5 in nieuwe 100 mm steriele polystyreen vacuüm-gasplasma behandelde tissue cultuur gerechten. Voeg een medium om het volume tot een totaal van 10 ml per 100 mm schaal brengen.
- Passage cellen minstens driemaal na ontdooien alvorens ze in een experiment.
- Ter voorbereiding voor experimentele toepassing als reagerende cellen, groei cellen tot confluentie in een bevochtigde 5% (v / v) CO2 atmosfeer onder niet-permissieve omstandigheden (bijvoorbeeld bij 39 ° C bij afwezigheid van IFN-γ [medium B met 10% v / v FBS]).
Opmerking: Onder niet-permissieve omstandigheden wordt expressie van tsA58-gemuteerde TAg transgen geremd met> 95% en BU.MPT cellen gedragen als primaire, muizennier PTEC.
- Dooi van vloeibare stikstof één flacon BU.MPT cellen.
2. Voorbereiding van apoptotische BU.MPT Cells (Protocol 1)
Opmerking: Dit protocol is specifiek voor BU.MPT cellen als bron van apoptotische cellen en staurosporine als de methode van apoptose-inductie. Als alternatief kan een andere cellijn of primaire celkweek, worden gebruikt als een bron van apoptotische cellen, apoptose geïnduceerd door gestandaardiseerde protocoIs voor dat specifieke celtype en werkwijze voor inductie van apoptose.
- Na passage op 100 mm diameter steriele polystyreen vacuüm-gasplasma behandelde weefselkweekplaten, groei BU.MPT cellen tot confluentie in een bevochtigde 5% (v / v) CO2 atmosfeer onder permissieve omstandigheden (bijvoorbeeld bij 37 ° C in kweekmedium A bij 10 ml per 100 mm schaal), zoals beschreven in paragraaf 1.2.3.
- Spoel de hechtende cel monolaag driemaal met kweekmedium B, met behulp van 10 ml per spoeling.
- Induceren apoptose door de cellen te incuberen in kweekmedium B dat staurosporine, een selectieve proteïne kinase remmer, bij 1 ug / ml gedurende 3 uur in een bevochtigde 5% (v / v) CO2 atmosfeer bij 37 ° C.
- Zuig het staurosporine-bevattend medium met "zwevend" apoptotische cellen die zijn losgemaakt van de monolaag. Centrifuge dit medium 10 min bij 500 xg, verwijder het supernatant, was de pellet driemaal met kweekmedium B, envoeg de pellet terug naar cellen verzameld in de volgende stap, 2,5.
- Maak de overblijvende hechtende cellen van stap 2,3 en 2,4 door toevoeging van 5 mM (ethyleendiaminetetraazijnzuur) EDTA in 1 x Ca2 + - en Mg2 + -vrij DPBS bij 1 ml per schaal gedurende 5 min. Zuig het EDTA-bevattend medium met vrijstaand apoptotische cellen en verzamel het losgemaakte cellen met de "zwevende" apoptotische cellen uit stap 2.4 in een steriele 15 ml centrifugebuis polystyreen.
- Was de apoptotische cellen drie keer door centrifugeren gedurende 10 min bij 500 xg en resuspensie in 10 ml 1x Ca + 2 - en Mg + 2 -vrij DPBS per wasbeurt.
- Na de laatste wasbeurt, schorten de apoptotische cellen in vers kweekmedium B bij ~ 5 x 10 6 cellen per ml voor gebruik om de responder cellen te stimuleren. Als alternatief fix gewassen apoptotische cellen in 0,4% (v / v) paraformaldehyde in 1x DPBS gedurende 30 minuten, en was daarna drie keer met cultuurmedium B, voordat schorsing in kweekmedium B.
- Eventueel bevestigen inductie van apoptose door flowcytometrie met een afzonderlijke bereiding van apoptotische cellen (of cellen bewaar wat hiervoor), zoals eerder beschreven 6,9,10,15.
Opmerking: Vroege apoptotische cellen intacte celmembranen, en verschijnen als propidiumjodide (PI) -negatieve en annexine V-positieve cellen verminderde celgrootte (ten opzichte van levensvatbare cellen). Late apoptotische cellen niet intacte celmembranen en weergegeven als PI-positieve en annexine V-positieve cellen verminderde celgrootte. Met behulp van het huidige protocol, typische preparaten bevatten ~ 85% vroege apoptotische en ~ 15% laat apoptotische cellen. - Voeg apoptotische cellen aan responder cellen (protocol 3) BU.MPT tegen apoptotische naar responder cel verhouding van 1: 1, hetzij rechtstreeks of na fixatie van apoptotische cellen gedurende 30 min met 0,4% (v / v) paraformaldehyde in 1x DPBS .
Opmerking: apoptotische cel fixatie voorafgaand aan de stimulatie van responders moetenlaat resultaten, tenzij de waargenomen signalering gebeurtenissen gevolg van het vrijkomen van een oplosbare mediator (tabel 1).
3. Voorbereiding van Necrotic BU.MPT Cells (Protocol 2)
Opmerking: Dit protocol is specifiek voor BU.MPT cellen als bron van necrotische cellen en verwarming als de methode van necrose inductie. Als alternatief kan een andere cellijn of primaire celkweek, worden gebruikt als een bron van necrotische cellen, met necrose geïnduceerd door gestandaardiseerde protocollen voor dat specifieke celtype en de wijze van necrose inductie.
- Na passage op 100 mm diameter steriele polystyreen vacuüm-gasplasma behandelde weefselkweekplaten, groei BU.MPT cellen tot confluentie in een bevochtigde 5% (v / v) CO2 atmosfeer onder permissieve omstandigheden (bijvoorbeeld bij 37 ° C in kweekmedium A bij 10 ml per gerecht), zoals beschreven in paragraaf 1.2.3.
- Spoel de hechtende cel monolaag driemaal met kweekmedium B, met behulp10 ml per spoeling.
- Maak de cellen door toevoeging van 5 mM EDTA in 1 x Ca2 + - en Mg2 + -vrij DPBS bij 1 ml per schaal gedurende 5 min. Zuig het EDTA-bevattend medium met losgemaakte cellen en voeg de celsuspensie naar een steriele 15 ml centrifugebuis polystyreen.
- Was de cellen drie keer door centrifugeren gedurende 10 min bij 500 xg en resuspensie in 10 ml Ca 2 + - en Mg + 2 -vrij DPBS per wasbeurt.
- Na de laatste wasbeurt, schorten de cellen in vers kweekmedium B bij ~ 5 x 10 6 cellen per ml.
- Necrose induceren door verhitting cellen 70 ° C gedurende 45 min in een waterbad voorzichtig vortexen de celsuspensie elke 10 min.
- Incubeer cellen gedurende 2 uur in een bevochtigde 5% (v / v) CO2 atmosfeer bij 37 ° C. Voorzichtig vortex de celsuspensie elke 15 min.
- In voorkomend geval, bevestigen inductie van necrose door flowcytometrie met een aparte voorbereiding van de necrotic cellen (of cellen bewaar wat hiervoor), zoals eerder beschreven 6,9,10,15.
Opmerking: necrotische cellen celmembranen gebroken en weergegeven als PI-positieve cellen van grotere celgrootte (ten opzichte van levensvatbare cellen). Met het huidige protocol typische preparaten ≥ 95% necrotische cellen. Als alternatief kan inductie van necrose en verlies van membraan integriteit worden bevestigd door trypan blauwe vlekken.
4. Voorbereiding van BU.MPT Responder Cells (Protocol 3)
Opmerking: Dit protocol is specifiek voor BU.MPT cellen als bron van responder cellen. Als alternatief kan een andere cellijn of primaire celkweek, worden gebruikt als responder cellen. Voorafgaand aan experimenteel gebruik, kan rust 's nachts worden veroorzaakt door gestandaardiseerde protocollen in het laboratorium.
- Groeien BU.MPT cellen in steriele 100 mm weefselkweekplaten onder permissie-omstandigheden in kweekmedium A bij 10 ml per schaal totdat ze bereiken ~85% samenvloeiing.
- Aspireren kweekmedium A, en spoel de cellen drie keer met kweekmedium B bij 10 ml per spoeling. Serum-verhongeren de cellen 's nachts voor 18 tot 24 uur in een bevochtigde 5% (v / v) CO 2 atmosfeer onder niet-permissieve omstandigheden (dat wil zeggen op 39 ºC in kweekmedium B bij 10 ml per gerecht), zoals beschreven in paragraaf 1.2 0,4, om rust te induceren. Als alternatief, groeien de cellen in kweekmedium B plus 10% (v / v) FBS op 39 ºC gedurende één dag voor serum uitgehongerde cellen overnacht in kweekmedium B zonder FBS.
- Label een aparte weefselkweek schotel van confluente BU.MPT cellen voor elke experimentele conditie.
- Onder de volgende zes voorwaarden: stimulering van levensvatbare BU.MPT responders met ofwel groei voertuig of epidermale factor (EGF) gedurende 15 min, na hun blootstelling gedurende 30 min ofwel geen cellen, apoptotische cellen of necrotische cellen.
Opmerking: Blootstelling aan dode cellen kan ofwel stimuleren of remmen het niveau van de activiteit van een given signalering molecuul. Stimulatie is het best gedetecteerd boven een lage uitgangswaarde (bv afwezigheid van EGF), terwijl de remming wordt het best gedetecteerd uit een hoge uitgangswaarde (bijvoorbeeld, de aanwezigheid van EGF). Omdat het effect van stimulatie met dode cellen is a priori bekend is, is het aan al studies uitgevoerd in zowel de afwezigheid en de aanwezigheid van EGF.
5. Stimulatie van Responder Cellen met apoptotische en necrotische cellen (Protocol 4)
- Aspireren kweekmedium B van pre-gelabelde gerechten van latente (serum-uitgehongerde) BU.MPT responder cellen (Protocol 3).
Let op: Na een nacht kweken onder niet-permissieve omstandigheden BU.MPT cellen moeten gedragen als primaire culturen van muis nier PTEC. - Per 100 mm schaal, voeg 2 ml van een van de volgende: B kweekmedium (geen cellen); apoptotische cellen suspensie bij ~ 5 x 10 6 cellen per ml in kweekmedium B (Protocol 1); of necrotische celsuspensie bij ~ 5 x 10 6 cellen per ml in kweekmedium B (Protocol 2).
- Verdeel de 2 ml suspensie van dode cellen gelijkmatig over de 100 mm schaal, en houdt de tijd voor hen om zich te vestigen tot een minimum. Hiertoe distribueren dode celsuspensie druppelsgewijs met een pipet brede punt over het gehele oppervlak van de responder cel gerechten. Gebruik een volume van 2 ml als compromis tussen de zettijd minimaliseren en het vermijden van de samenklontering van dode cellen.
Opmerking: Het gebruik van een suspensie van dode cellen als een stimulus brengt een aantal speciale overwegingen, die hieronder nader (Tabel 2 en bespreking) worden beschreven. - Het bereiken van een dode-to-responder cel verhouding van ~ 1: 1 door toevoeging van 2 ml van dode cellen op ~ 5 x 10 6 cellen per ml van een confluente 100 mm schaaltje dat ~ 10 x 10 6 cellen bevat. Als alternatief, om de dosisafhankelijkheid van elke waargenomen signaleringsgebeurtenissen stellen, variëren de verhouding van dood reagerende cellen voortdurend door geleidelijke verdunning in culture medium B van de doden celsuspensies bereid in de Protocollen 1 en 2.
- Verdeel de 2 ml suspensie van dode cellen gelijkmatig over de 100 mm schaal, en houdt de tijd voor hen om zich te vestigen tot een minimum. Hiertoe distribueren dode celsuspensie druppelsgewijs met een pipet brede punt over het gehele oppervlak van de responder cel gerechten. Gebruik een volume van 2 ml als compromis tussen de zettijd minimaliseren en het vermijden van de samenklontering van dode cellen.
- Zwenk de gerechten, dan incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde 5% (v / v) CO 2 atmosfeer.
- Na 30 min, stimuleren de responder cellen met ofwel drager of 50 nM EGF, volgens de pre-labeling van de kweekschaal.
- Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C in een bevochtigde 5% (v / v) CO2 atmosfeer.
- Wegspoelen de dode cellen door toevoeging van 5 ml ijskoude 1x DPBS, wervelende het gerecht, en opzuigen van de wasvloeistof. Herhaal dit drie keer.
- Onmiddellijk in zijn responder cel gerechten op ijs voor verdere verwerking.
- Bereid cellysaten
- Bereid cellysis buffer met de volgende: 1 x Tris gebufferde zoutoplossing (TBS), 10 mM natriumpyrofosfaat, 0,5% w / v deoxycholaat, 0,1% w / v SDS, 10% glycerol en 25 mM natriumfluoride.
- Onmiddellijk voorafgaand aan cellysis, voeg de volgende in de exacte volgorde gegeven bij de INDvoor bestemde concentraties: Mini EDTA-vrije proteaseremmer cocktail (1 tablet per 10 ml lysis buffer), 10% (v / v) Triton X-100, 1 mM dithiothreïtol (DTT), 1 mM fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF) en 10 mM natriumorthovanadaat.
- Voeg 700 ul ijskoude cellysis buffer per 100 mm schaal van vers gestimuleerde reagerende cellen op ijs uit stap 5.7. Schraap cellen met een cel schraper, en breng het lysaat pre-gekoelde 1,5 mL microbuizen. Handhaaf de buizen op ijs gedurende 15 min.
- Sonificeer lysaten op ijs met 10 pulsen van 20 Hz, minder dan een seconde per duren. Vermijd de vorming van schuim op de gas / vloeistof-interface, omdat dit de monsters kunnen oververhit raken. Volledig onder te dompelen de ultrasoonapparaat sonde in de microbuizen met lysaten voordat u het ultrasoonapparaat op, en schakel het ultrasoonapparaat uit voordat het verwijderen van de sonde uit de lysaten.
- Centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en breng de supernatanten in vers voorgekoeld microbuizen, En bewaar bij -70 ºC.
- Voeren gelelektroforese en immunoblotting op supernatanten van lysaten, zoals hiervoor beschreven 6,9,10,15.
- Bereid cellysis buffer met de volgende: 1 x Tris gebufferde zoutoplossing (TBS), 10 mM natriumpyrofosfaat, 0,5% w / v deoxycholaat, 0,1% w / v SDS, 10% glycerol en 25 mM natriumfluoride.
6. Het voorkomen van direct fysiek contact tussen Doelen en Responders Met behulp van een Semi-permeabel Polycarbonaat membraan (Protocol 5)
- Bereid BU.MPT responder cellen volgens Protocol 3, met één uitzondering; groeien cellen in steriele polystyreen weefselkweek behandelde 12-well clusters.
- In geselecteerde putten, plaatst u een doorlaatbare support systeem met een 0,4 micrometer polycarbonaat membraan naar de fysieke interactie tussen doden en responder cellen te voorkomen. Omvatten controleputjes zonder membraan in hetzelfde experiment.
- Aspireren kweekmedium B van experimentele putjes van serum uitgehongerde BU.MPT responder cellen.
- Volg Protocol 4 voor stimulatie van reagerende cellen met apoptotische of necrotische cellen, met de volgende wijzigingen:
- Per putje van de 12-well cluster, voeg 0,1 ml van een van de volgende: B kweekmedium (geen cellen); apoptotische cellen suspensie bij ~ 5 x 10 6 cellen per ml in kweekmedium B (Protocol 1); of necrotische celsuspensie bij ~ 5 x 10 6 cellen per ml in kweekmedium B (Protocol 2).
Opmerking: Als confluente putje van een 12-well cluster bevat ~ 0,5 x 10 6 cellen, het toevoegen van 0,1 mL van dode cellen op ~ 5 x 10 6 cellen per ml levert een dead-to-responder cel verhouding van ~ 1: 1. - Aan putjes die de permeabele ondersteuningssysteem, voeg de dode cellen boven de 0,4 urn polycarbonaatmembraan binnen de permeabele drager systeem, zodat er geen directe fysieke interactie tussen dode en responder cellen.
- Per putje van de 12-well cluster, voeg 0,1 ml van een van de volgende: B kweekmedium (geen cellen); apoptotische cellen suspensie bij ~ 5 x 10 6 cellen per ml in kweekmedium B (Protocol 1); of necrotische celsuspensie bij ~ 5 x 10 6 cellen per ml in kweekmedium B (Protocol 2).
7. Remming van fagocytose met cytochalasine D (Protocol 6)
- Bereid BU.MPT responder cellen volgens protocol 3.
- Bereid de cytoskelet remmer cytochalasine D in dimethyl sulfoxide (DMSO) en 4 mg / ml (1000 X). Naar gelabelde gerechten BU.MPT responder cellen hetzij 10 uL drager (DMSO) of 10 ul van cytochalasine D tot een eindconcentratie van 4 ug / mL bereiken in 10 ml kweekmedium B.
Let op: Bij deze concentratie van cytochalasine D, fagocytose door BU.MPT cellen en een macrofaag cellijn werd geremd door ≥90% 9,10. - Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C in een bevochtigde 5% (v / v) CO2 atmosfeer.
- Volg Protocol 4 voor stimulatie van reagerende cellen met apoptotische of necrotische cellen.
- Eventueel bevestigen remming van fagocytose van dode cellen door flowcytometrie met een afzonderlijke bereiding van dode en responder cellen (of cellen daartoe bestemde), zoals eerder beschreven 9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In figuur 1 geven we een schema dat de timing en kritische stappen van de bereiding van apoptotische cellen (Protocol 1) en necrotische cellen (protocol 2) en het stimuleren van responder cellen met suspensies van apoptotische en necrotische cellen (protocol 4).
In figuur 2 geven we representatieve resultaten die het effect van apoptotische cellen op fosforylatie van de twee isovormen van de serine-threonine kinase glycogeensynthase kinase-3 (GSK-3), GSK-3α en GSK-3β. GSK-3α / β een belangrijke rol in de regulatie van cellulaire proliferatie en overleving, alsook zijn belangrijke rol bij het glucosemetabolisme. Fosforylering van GSK-3α op serine-21 en GSK-3β op serine-9 remt kinase activiteit en op zijn beurt leidt tot verminderde fosforylatie en verhoogde stabilisatie van β-catenine. p-cateninevervolgens naar de kern, wanneer dat de transcriptie van genen waarvan bekend celproliferatie stimuleren en remmen apoptose. Daarom wordt verhoogd fosforylering van GSK-3α / β geassocieerd met verhoogde proliferatie en overleving, terwijl verlaagde fosforylatie van GSK-3α / β correleert met een verminderde proliferatie en overleving.
Blootstelling van latente BU.MPT responders cellen gedurende 30 min krachtig geremd basale fosforylering van GSK-3α / β (Figuur 2A) apoptotische. Evenzo eerdere blootstelling aan apoptotische doelen voor 30 min sterk geremd daaropvolgende epidermale groeifactor (EGF) geïnduceerde fosforylatie van GSK-3α / β (Figuur 2A). Daarentegen blootstelling van BU.MPT responders op necrotische cellen had geen effect heeft op basale of EGF-geïnduceerde fosforylatie van GSK-3α / β.
en om te voorkoment fysische interactie tussen BU.MPT responders en apoptotische cellen werden BU.MPT responders gekweekt in een doorlatende ondersteuningssysteem en gescheiden van apoptotische doelen door een 0,4 um polycarbonaat membraan. Preventie van fysieke interactie tussen BU.MPT responders en apoptotische cellen schafte de mogelijkheid van apoptotische doelen om fosforylatie van GSK-3α / β (figuur 2B) remmen. Om de rol van fagocytose evalueren, gebruikten we het cytoskelet remmer cytochalasine D fagocytische opname van dode cellen voorkomen. Remming van fosforylering van GSK-3α / β reactie op apoptotische cellen opgetreden zonder fagocytose (figuur 2C). We hebben eerder aangetoond dat cytochalasine D, bij de gebruikte concentratie, remt PTEC en macrofaag fagocytose met ≥90% 9,10. Samengevat, onze resultaten tonen aan dat apoptotische cel-gemedieerde remming van de fosforylering van GSK3α / β vereist directe fysieke interactie betwe en doelstellingen en responder cellen, maar is onafhankelijk van fagocytose.
Figuur 1. Schema voor de inductie van intracellulaire signalering Evenementen in Levensvatbare Responder cellen door fysieke interactie met naburige cellen ondergaan celdood. De lijn grafieken tonen de timing en kritische gebeurtenissen in de bereiding van (A) apoptotische (Apo) cellen en (B) necrotisch (Necro) celsuspensies van BU.MPT cellen, en in de (C) stimulering van levensvatbare BU.MPT responder cellen met suspensies van apoptotische of necrotische cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
/ftp_upload/54980/54980fig2.jpg "/>
Figuur 2. Remming van fosforylering van GSK3α / β in BU.MPT Responder cellen na blootstelling aan apoptotische cellen Vereist Direct cel-cel interactie, maar is onafhankelijk van Phagocytosis. -Serum onthouden BU.MPT reagerende cellen werden voorbehandeld gedurende 2 uur onder (A, B) of vehikel (C) cytochalasine D (4 ug / ml) en vervolgens gestimuleerd gedurende 30 min zonder cellen (-), apoptotische cellen (Apo ) of necrotische cellen (NEC) in een dode cel tot cel verhouding van 1 responder: 1. De reagerende cellen werden vervolgens gewassen en geïncubeerd gedurende nog eens 15 min in afwezigheid of aanwezigheid van EGF (50 nM) vóór het oogsten. De bron van apoptotische cellen werd met staurosporine BU.MPT behandelde cellen. De bron van necrotische cellen was warmtebehandeling BU.MPT cellen. Interactie tussen dode cellen en BU.MPT responders was ofwel (A, C) onbelemmerde, die rechtstreeksdode cel-responder fysieke interactie, of (B) met scheiding van dode cellen en responders door een 0,4 um polycarbonaat membraan in een doorlaatbare ondersteuningssysteem. Dode cellen en niet-hechtende responder cellen werden verwijderd door wassen en BU.MPT responder cellysaten werden geprobed met anti-gefosforyleerd GSK3α / β antilichamen zijn. Gelijke belading werd bevestigd door peilen naar totale glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Effect op signalering evenement veronderstelling dat dit mechanisme | |||||||
| Interventie | oplosbare mediator | Receptor-gemedieerde herkenning | fagocytose | ||||
| Fixatie van apoptotische cellen * | Eliminatie | volharding | volharding | ||||
| Fysieke scheiding van apoptotische cellen en responder † | volharding | Eliminatie | Eliminatie | ||||
| Ultracentrifugeerd geconditioneerde medium van cellen die apoptose ondergaan als stimulus¶ | volharding | Eliminatie | Eliminatie | ||||
| Necrotische cellen als stimulans | Eliminatie | Eliminatie of tegengesteld gerichte respons (bijvoorbeeld remming versus stimulatie) | volharding | ||||
| Latex kralen als stimulus | Eliminatie | Eliminatie | volharding | ||||
| Farmacologische remming van fagocytose | volharding | volharding | Eliminatie | * Voorspelde resultaten veronderstellen dat fixatie niet kritisch oppervlak factoren verantwoordelijk voor receptor-gemedieerde opname en / of fagocytose wijzigt. | |||
| † Voorspelde resultaten met zich meebrengen twee veronderstellingen: ten eerste dat de oplosbare mediator is klein genoeg om door de poriën van het membraan scheiden van de apoptotische en de reagerende cellen, en ten tweede door te geven, dat een loods blaasjes of microvesicles, vaak aangeduid als apoptotische lichamen, zijn te groot om passeren de poriën van het membraan. Een rol voor blaasjes of microvesicles zou door een gebrek aan overeenstemming in de signalering waargenomen met fysische scheiding van apoptotische cellen en responder versus ultracentrifuge geconditioneerd medium worden voorgesteld. | |||||||
| ¶ Ultracentrifugatie (20.000 x g gedurende 30 min) is nodig om eventuele apoptotische lichamen te verwijderen of ander stal onoplosbaar materiaal dat de invloed is kan nabootsencts van de intacte apoptotische cel. | |||||||
Tabel 1. Identificatie van het mechanisme (s) Verantwoordelijk voor het signaleren Evenementen in levende cellen na blootstelling aan apoptotische cellen. Verschillende eenvoudige experimentele strategieën zijn bedoeld om onderscheid te maken tussen de potentiële mechanisme (n) die verantwoordelijk is voor het signaleren gebeurtenissen waargenomen na blootstelling aan apoptotische cellen. Deze mechanismen omvatten: fysische interactie van de apoptotische cellen met specifieke receptoren op de responder cellen, afgifte van oplosbare mediators van de apoptotische cellen en betrokkenheid van fagocytische machines de responder cel.
| experimenteel probleem | Beschikbare strategieën voor het minimaliseren en / of ontduiking |
| beperkt aantalapoptotische cellen per reageren cel (~ 1: 1 verhouding). | 1. Toename van het aantal apoptotische cellen, maar de apoptotische naar responder celverhouding worden bewaard <2: 1. * |
| Behoefte aan de zwaartekracht-afhankelijke afwikkeling van apoptotische cellen. | 1. Minimaliseer het volume van medium waarin apoptotische cellen gesuspendeerd. |
| 2. Centrifuge de schotel of plaat om de apoptotische cellen rijden door de schorsing van medium sneller. | |
| Ongelijke ruimtelijke verdeling van apoptotische cellen. | 1. verdelen voorzichtig de apoptotische celsuspensie druppelsgewijs met een pipet brede punt over het gehele oppervlak van de responder cel gerechten. |
| 2. Vermijd cultuur gerechten of putten met een diameter <35 mm, waarbij de meniscus effecten kan leiden tot ongelijke distributies. | |
| Heterogeniteit van de apoptotische cellen bevolking. | 1. Gebruik een sterke inductorvan apoptose. |
| 2. Na inductie, bevestig de apoptotische cellen met paraformaldehyde, en sorteer op stromingscytometrie naar een meer uniforme populatie te verkrijgen. | |
| * Bij apoptotische naar responder cel verhoudingen> 2: 1, de apoptotische cellen een confluente tapijt vormen en aanvullende apoptotische cellen direct contact met responder cellen niet langer | |
Tabel 2. Experimentele Problemen bij gebruik van een celsuspensie als Stimulus van intracellulaire signalering gebeurtenissen. Verschillende experimentele belemmeringen bij het gebruik van een celsuspensie als prikkel worden weergegeven, en strategieën voor de gedeeltelijke oplossing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij bieden hier een protocol voor het karakteriseren van de intracellulaire signalering gebeurtenissen geïnduceerd in levensvatbare cellen na blootstelling aan cellen ondergaan apoptose of andere vormen van celdood. Het protocol benadrukt de verschillende mechanismen die blootstelling aan apoptotische cellen intracellulaire signaalroutes in levensvatbare responder cellen kunnen moduleren. Deze mechanismen omvatten: de interactie (via overbrugging moleculen of oppervlak determinanten dode cel of de schuur blaasjes en microvesicles, vaak genoemd apoptotische lichamen) met specifieke receptoren op de responder cel; de afgifte van oplosbare mediators (of zelfs hun extracellulaire generatie 27); en de betrokkenheid van de fagocytische machines. Onder omstandigheden waarin aanzienlijke fagocytose plaatsvindt, een extra mechanisme te worden beschouwd is de levering van de bemiddelaars, zoals microRNA, verrijkt in de apoptotische cel of de blaasjes 21. Het belang van ons protocol, in vergelijking met other methodologieën, ligt in de zorgvuldige dissectie van de verschillende mechanismen die apoptotische cellen signaaltransductie kunnen moduleren binnen reagerende cellen. Een groot voordeel is dat de meeste technieken zijn eenvoudig en standaard celcultuur.
Terwijl het protocol is specifiek voor BU.MPT cellen, een onsterfelijk muizennier PTEC lijn, als bron van zowel dode en reagerende cellen, aanpassing van het protocol bij andere cellijnen of primaire celculturen is eenvoudig en gemakkelijk te implementeren. Bovendien, zoals in onze vorige publicaties, de bron van dode en reageren cellen nodig hebben dezelfde 9,10,19 niet noodzakelijk. Terwijl wij het gebruik van staurosporine en warmte als induceerders van apoptose en necrose beschrijven respectievelijk de wijze en triggers van celdood kan ook variëren. Terwijl de signalering gebeurtenissen geïnduceerd in BU.MPT responders na blootstelling aan apoptotische cellen zijn grotendeels onafhankelijk van de wijze van apoptose inductie, ha weve waargenomen enkele verschillen 9,10. Om deze reden adviseren wij replicating belangrijkste resultaten met verschillende triggers van apoptotische celdood. Als bijvoorbeeld sterk fagocytische cellen zoals macrofagen, worden gebruikt als responders 4,6, of indien de duur van de interactie tussen responders en dode cellen lang genoeg substantiële fagocytose optreden, dan zou men een niet-toxisch inductor of overwegen apoptose, zoals ultraviolet- of gamma-straling 4,9,10, uit te sluiten dat potentieel fagocytische levering van het toxine. Alternatieve werkwijzen voor inductie van necrose kan ook worden overwogen. Hoewel we identieke resultaten met verwarming en vriesdrogen van cellen verkregen, uitgebreide cel klonteren en vuil optreedt bij vriesdrogen maakt het gebruik hiervan problematisch.
Aantal eenvoudige strategieën kunnen maken de specifieke mechanisme verantwoordelijk voor signaleringsgebeurtenissen waargenomen na blootstelling aan apoptotische cellen (Tabel 1 ophelderen tabel 1, het effect op de waargenomen signalering gebeurtenis kan de verantwoordelijke mechanisme lokaliseren. Bijvoorbeeld, in het geval van receptor-gemedieerde opname van de apoptotische cellen, moet de signalering gebeurtenis aanhouden ondanks fixatie van de apoptotische cellen en worden geëlimineerd met vervanging van apoptotische cellen door geconditioneerd medium of latex korrels, alsmede met fysieke scheiding doden en reagerende cellen. In reactie op necrotische cellen, moet de signalering gebeurtenis worden geëlimineerd of raken tegengesteld gerichte (bijvoorbeeld remming versus stimulatie).
Er zijn verschillende gevolgen van deze beperkte dead-to-responder cel verhouding die kanleiden tot een vermindering of verduisterend van signalering evenementen. Om fysiek te communiceren met een levensvatbare responder cel, moet een apoptotische cel eerst te regelen door de kolom van de schorsing van medium. Zelfs met een minimale volumes, kan de tijd bezinken van cellen merkbaar, zolang 10 tot 20 minuten. Intracellulaire signalering gebeurtenissen zal dus niet kunnen worden gecoördineerd tussen de reagerende cellen. Vandaar dat het eerste contact tussen responder en dode cellen kan niet exact getimed, maar op een enigszins uiteenlopende tijden valt. Voor signalering gebeurtenissen die plaatsvinden op een tijdschaal korter dan vereist voor het regelen, kan dit gebrek aan synchronisatie tot een verduisteren van het signaal zodanig dat het niet meer te onderscheiden van de achtergrond. Zelfs signalen van langere duur, zo niet voldoende sterk, kan gevoelig zijn voor dit probleem.
Naast deze temporele problemen kunnen ruimtelijke zaken ook ongunstige invloed resultaten. Meniscus effecten, vooral in putten en gerechten uit de small diameter (bijvoorbeeld polystyreen weefselkweek behandelde 96 putjes clusters) of vloeistof stromen die door te krachtig pipetteren kan leiden tot een ongelijkmatige verdeling van dode cellen, waardoor een toestand van feest of honger maken tussen responder cellen. Aangezien het gemeten signaal van dat lichaam van reagerende cellen in een enkel putje of plaat, kan variatie in de vangst van dode cellen zwakkere signalen verduisteren.
Een laatste probleem is dat zij heterogeniteit van de apoptotische celpopulatie. Zelfs met een hevige mate van apoptose, zoals staurosporine, wordt een preparaat van dode cellen cellen in verschillende stadia van het stervensproces bevatten. Dit wordt relevant wanneer de sterkte van de respons op de apoptotische cel afhankelijk van de fase in het stervensproces 10,14. Omdat gemiddeld per reageren cel ontmoetingen slechts één apoptotische cellen, kan heterogeniteit in dit geval leiden tot een verzwakking van de totale gedetecteerde signalering evenement. tabel 2
Er zijn verscheidene andere experimentele problemen uniek geassocieerd met het gebruik van dode cellen als stimulus. Belangrijk is dat kweekomstandigheden beïnvloeden niet alleen de reagerende cellen, maar ook dode cellen zelf. Bijvoorbeeld, serumeiwitten, indien aanwezig, kan hechten aan het oppervlak van de dode cellen en versterken of remmen de herkenning door reagerende cellen. Bij het oplossen van een inconsistent resultaat of een resultaat dat afwijkt van het in de literatuur, dient aandacht te worden besteed aan de volgende kweekomstandigheden (voor zowel responder en dode cellen): mate van confluentie passage nummer, aanwezigheid van serum, warmte geïnactiveerd serum , en de aard en duur van de rust. Tot slot moet men zich ervan bewust dat celdood is een onverbiddelijke aspect van alle celcultuur en responder cellen worden dan ook voortdurend blootgesteld aan een laag niveau van dodecellen. Deze blootstelling kan mogelijk invloed op de experimentele reactie op een bolus van dode cellen, omdat de signalen bestudeerde worden voortdurend geïnduceerd. Signaalmodulatie kan ontstaan via de normale feedback wegen, of zelfs door selectie van een subpopulatie van reagerende cellen, vooral als de geïnduceerde signalering gebeurtenissen omvatten overleving of proliferatie.
Samengevat hebben we een protocol beschreven voor de bepaling van intracellulaire signalering gebeurtenissen in levensvatbare cellen geïnduceerd door hun fysische interactie met aangrenzende dode of stervende cellen. Hoewel de focus ligt voornamelijk op signalering gebeurtenissen geïnduceerd door receptor-gemedieerde opname van dode cellen, het protocol maakt ook de identificatie van signalering gebeurtenissen veroorzaakt door fagocytische opname of het vrijkomen van oplosbare mediators uit de dode cellen. Het gebruik van dode cellen als een stimulans introduceert een aantal unieke factoren die de detectie van intracellulaire signalering gebeurtenissen kunnen belemmeren. Bewustzijn van deze unique factoren, alsook de vele mechanismen die dode cellen moduleren intracellulaire signalering is cruciaal voor de opzet en interpretatie van experimenten op dit groeiende vakgebied. De hier beschreven protocol moet helpen bij het begrijpen van de mechanismen die dode of stervende cellen invloed op hun leven buren, zowel in gezondheid en ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1x with [4.5 g/L] glucose, ʟ-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100x | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/mL] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1x DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+- and Mg2+-free, 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10x, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 mL | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
References
- Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
- Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748 (2013).
- Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
- Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
- Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
- Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
- Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
- Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
- Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
- Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
- Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
- Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
- Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
- Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
- Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the "phoenix rising" pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13 (2010).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
- Hess, K. L., Tudor, K. -S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51 (2009).
- Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
- Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
- Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
- Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).
