Abstract
Celler dør ved apoptose, også referert til som regulert celledød, erverve flere nye aktiviteter som gjør dem i stand til å påvirke funksjonen av tilstøtende levende celler. Vitale aktiviteter, for eksempel overlevelse, proliferasjon, vekst og differensiering, er blant de mange cellulære funksjoner som moduleres av apoptotiske celler. Evnen til å gjenkjenne og reagere på apoptotiske celler synes å være en universell funksjon av alle celler, uavhengig av avstamning eller organ av opprinnelse. Men mangfoldet og kompleksiteten i respons til apoptotiske celler mandater at stor forsiktighet tas i dissekere signal hendelser og veier ansvarlige for noen bestemt utfallet. Spesielt må man skjelne mellom de mange mekanismer som apoptotiske celler kan påvirke intracellulære signalveier innenfor levedyktige responderceller, inkludert: reseptor-mediert erkjennelse av den apoptotiske cellen, frigjøring av oppløselige mediatorer ved den apoptotiske cellen, og / eller innkobling av PHAGOcytic maskiner. Her gir vi en protokoll for å identifisere intracellulære signal hendelser som induseres i levedyktige svaret celler etter deres eksponering for apoptotiske celler. En stor fordel med protokollen ligger i oppmerksomhet det lønner seg å disseksjon av den mekanismen som apoptotiske celler modulerer signaleringshendelser innenfor responderende celler. Mens protokollen er spesifikk for et betinget immortalisert musenyre proksimale rørformet cellelinje (BU.MPT celler), blir det lett tilpasses til cellelinjer som er ikke-epitelial opprinnelse og / eller som stammer fra andre kilder enn nyre organer. Bruken av døde celler som en stimulans introduserer flere unike faktorer som kan hindre påvisning av intracellulære signal hendelser. Disse problemene, samt strategier for å minimere eller omgå dem, er beskrevet i protokollen. Bruk av denne protokollen skal hjelpe vår voksende kunnskap om den brede innflytelsen som døde eller døende celler øve på sine live-naboer, både i helse og i disease.
Introduction
Apoptose, eller regulert celledød 1, bidrar på en avgjørende måte til vedlikehold og utvikling av vev. Vist enklest, apoptose tillatelser alderen, skadet, eller overflødige celler til å bli eliminert uten å skade omkringliggende vev 2,3. Bidraget av apoptose til vev homeostase, er imidlertid betydelig mer dynamisk og variert. Celler dør ved apoptose erverve flere nye aktiviteter, både utskilt og celleassosiert, noe som gjør dem i stand til å påvirke funksjonen av tilstøtende levende celler 4-10. Tidligere studier som fokuserer på evnen av apoptotiske celler for å undertrykke betennelse 11-16, men apoptotiske celler også modulerer et bredt område av cellulære funksjoner, herunder slike vitale aktiviteter som overlevelse 4,9,10, proliferasjon 4,9,10, differensiering 17, migrasjon 18, og veksten 19. Dessuten er disse effektene ikke begrenset til profesjonelt fagocytter, som makrofags, men strekker seg til nesten alle celletyper og linjene, inkludert tradisjonelt ikke-fagocyttiske celler, så som epiteliale og endoteliale celler 7,9,10,18-21.
Den spesifikke reaksjon av tilstøtende levende celler etter eksponering til apoptotiske celler er avhengig av flere faktorer som er knyttet til både levedyktige responderende celler og de apoptotiske celler selv. For eksempel, selv om eksponering av apoptotiske celler inhiberer proliferasjonen av både murine makrofager og nyre proksimale tubulære epitelceller (PTECs), disse to celletyper avviker dramatisk i deres overlevelse respons til apoptotiske celler 4,6,9,10. Apoptotiske celler fremme overlevelse av makrofager, men indusere apoptotisk død PTECs 4,6,9,10. Spesielt, kan responsen til apoptotiske celler variere selv blant svarer celler av samme avstamning, avhengig av reagerer cellens organ utstedt 10 (for eksempel nyre PTECs versus mammary epitelialceller) eller aktiveringstilstand 22 (f.eks nøytrofile). Omvendt kan apoptotiske celler fremkalle forskjellige responser i den samme celle, avhengig av arten av den apoptotiske stimulans 10,23 eller stadium av apoptose 10,14.
Gitt diverse og kompleksiteten av responsen på apoptotiske celler, må stor forsiktighet tas i dissekere signal hendelser og veier ansvarlige for noen bestemt utfallet. For det første må responser som krever direkte fysisk interaksjon mellom levedyktige og apoptotiske celler bli differensiert fra de som er utløst ved hjelp av oppløselige mediatorer frigis eller genereres av den apoptotiske cellen 3,6-10. Hvis det kreves fysisk interaksjon, og deretter en ytterligere differensiering skal utføres. Signaleringshendelser kan avhenge av reseptor-mediert anerkjennelse av apoptotisk celle, uavhengig av etterfølgende engulfment, eller på fagocytisk opptak, uavhengig av den spesifikke reseptoren som binder den apoptotiske cellen 3-7,9,10,19. I sistnevnte tilfelle, er responsen ikke er spesifikke for apoptotiske celler, og kan utløses av en hvilken som helst materiale fagocytisk 4,6.
Betydningen av disse distinksjonene kan igjen bli verdsatt av kontraster svarene av makrofager og nyre PTECs. For begge celletyper, eksponering til apoptotiske celler endrer aktiviteten av pro-overlevelse kinase Akt. Modulation er avhengig av fysisk interaksjon, ettersom skillet mellom å svare og apoptotiske celler av en 0,4 mikrometer polykarbonatmembran opphever responsen 4,9,10,19. Imidlertid er responsen av PTECs er reseptor-mediert og uavhengig av fagocytose, mens responsen av makrofager er drevet av fagocytose 4,9,10,19. Denne konklusjonen blir forsterket av det faktum at eksponering til lateksperler, en nøytral fagocytisk stimulus, har ingen innvirkning på Akt-aktivitet i PTECs, men etterligner effekten av apoptotiske celler i makrofager 4,9.
"> Selv om mindre godt studert, celler dør ved nekrose eller tilfeldig celledød 1, også modulere funksjonen til nærliggende levedyktige celler 3-10,19. Som apoptotiske celler, nekrotiske celler utøve sine effekter gjennom en rekke mekanismer, særlig lekkasje av intracellulære innholdet gjennom sin sprukket cellemembranen 3,5,6,9,24. Mange celler, inkludert PTECs og makrofager, har distinkte ikke-konkurrerende reseptorer for cellene dør ved nekrose 5,9. engasjement av disse reseptorene signalanlegg hendelser som er ofte motsatt av de som er indusert ved inngrep av reseptorene for apoptotiske celler 4-10,19. for eksempel, i PTECs, nekrotiske celler øker fosforylering av Akt, mens apoptotiske celler redusere fosforylering 9,10,19. Her beskriver vi en protokoll for å identifisere intracellulære signal hendelser indusert i levedyktige nyre PTECs gjennom reseptor-mediert anerkjennelse av tilstøtende apoptotic PTECs
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelser
Merk: I denne protokollen, to eller flere cellelinjer, eller primære cellekulturer, uavhengig utarbeidet under bestemte vilkår. Disse forberedelsene omfatter apoptotiske celler (protokoll 1), nekrotiske celler (protokoll 2), og sunne reagert celler (protokoll 3). Etter uavhengig behandling, blir apoptotiske eller nekrotiske celler tilsatt til responderceller, og det resulterende signaltransduksjon blir overvåket (Protocols 4, 5 og 6).
- Forbered kultur media og reagenser
- Fremstille 500 ml av kulturmedium A (for bruk ved dyrking av celler i henhold til permissive betingelser, se avsnitt 1.2) ved å kombinere de følgende: 1x Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 4,5 g / l glukose, 584 mg / l ʟ-glutamin, 110 mg / l natriumpyruvat, 100 enheter / ml penicillin-streptomycin, 10% (v / v) føtalt bovint serum (FBS), og 10 enheter / ml av interferon-γ (IFN-γ).
- Forbered 500 ml kulturmedium B (for bruk when serum-sultne celler under ikke-ettergivende, se kapittel 1.2) ved å utelate FBS og IFN-γ fra oppskriften dyrkingsmedium A. Å vokse celler under ikke-mottagelige forhold (før serum-sult), legge til 10% v / v FBS til dyrkingsmedium B.
- Fremstille 0,4% (v / v) paraformaldehyd, pH 7,2, i 1 x Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS) fra 4% paraformaldehyd lager for fiksering av døde celler.
Merk: Paraformaldehyde er giftig, og passende forsiktighet bør utvises i bruken.
- Kultur BU.MPT celler
- Tine fra flytende nitrogen ett hetteglass med BU.MPT celler.
Merk: BU.MPT er en mus nyre proksimal rørformet epitelcellelinje (PTEC) linje avledet fra en transgen mus som bærer en temperaturfølsom (ts) mutasjon (tsA58) av SV40 stort tumorantigen (TAg) under kontroll av muse større histocompatibility kompleks (MHC) H-2K b klasse I arrangøren 25,26. - Plate celler på sterile polystyrene vakuumgassplasma behandlet vev kultur retter (~ 5 x 10 6 celler per 100 fatet diameter mm).
- Dyrke celler under permissive betingelser i en fuktig 5% (volum / volum) CO2 atmosfære.
Merk: Tillatte forhold, som er definert som kultur på 33-37 ºC i nærvær av IFN-γ, aktiverer stabil uttrykk for tsA58-muterte TAg transgenet. Til forskjell fra primære kulturer av musenyre PTEC, som ikke overlever mer enn en enkelt passasje eller to, BU.MPT dyrket under permissive betingelser kan passeres på ubestemt tid.- Passasje celler minst tre ganger etter tining før de brukes i et eksperiment.
- For å passasje cellene, tilsett 1 ml 0,05% trypsin per 100 mm skål, og inkuber i en fuktet 5% (v / v) CO 2 atmosfæren ved 37 ºC i 5 min. Nøytralisere trypsin ved å tilsette 10 ml av medium A. Aspirer de løsnede celler, og splittet 1: 3 til 1: 5 i nye 100 mm sterilt polystyren vakuum-gassplasma behandles tissUE kultur retter. Legg medium A for å få volumet opp til totalt 10 ml per 100 mm skål.
- Passasje celler minst tre ganger etter tining før de brukes i et eksperiment.
- Som forberedelse for eksperimentell anvendelse som svarer celler, dyrke cellene til konfluens i en fuktig 5% (volum / volum) CO2 atmosfære under ikke-permissive betingelser (dvs. ved 39 ° C i fravær av IFN-γ [medium B inneholdende 10% v / v FBS]).
Merk: Under ikke-ettergivende forhold, er uttrykk for tsA58-muterte TAg transgen hemmet av> 95%, og BU.MPT cellene oppfører seg som primærkulturer av mus nyre PTEC.
- Tine fra flytende nitrogen ett hetteglass med BU.MPT celler.
2. Utarbeidelse av apoptotisk BU.MPT Cells (protokoll 1)
Merk: Denne protokollen er spesifikk for BU.MPT celler som kilde til apoptotiske celler, og staurosporin som metode for apoptose-induksjon. Alternativt kan en annen cellelinje, eller primær cellekultur, brukes som en kilde for apoptotiske celler, med apoptose indusert ved standardiserte protokollen,ls for den aktuelle celletype og fremgangsmåte for apoptose-induksjon.
- Etter passering på 100 mm diameter sterilt polystyren vakuum-gassplasma som ble behandlet vevskulturskåler, vokser BU.MPT cellene til konfluens i en fuktig 5% (v / v) CO 2 atmosfære under permissive betingelser (dvs. ved 37 ° C i dyrkingsmedium A i 10 ml pr 100 mm skål), som beskrevet i seksjon 1.2.3.
- Skyll tilhenger cellemonolaget tre ganger med dyrkingsmedium B, ved hjelp av 10 ml per skylling.
- Indusere apoptose ved å inkubere cellene i kulturmedium inneholdende B staurosporin, er en ikke-selektive protein kinase inhibitor, ved 1 mikrogram / ml i 3 timer i en fuktet 5% (v / v) CO 2 atmosfære ved 37 ° C.
- Aspirer staurosporin-inneholdende medium inneholdende "flytende" apoptotiske celler som har løsrevet fra monolaget. Sentrifuger dette mediet i 10 minutter ved 500 xg, kaste supernatanten, vask pelleten tre ganger med kulturmedium B, oglegge til pelleten tilbake til celler som er samlet i det neste trinn, 2,5.
- Løsne de gjenværende adherente celler fra trinn 2.3 og 2.4 ved tilsetning av 5 mM (ethylendiamintetraeddiksyre) EDTA i 1x Ca 2 + - og Mg 2 + -fri DPBS på 1 ml pr tallerken i 5 min. Aspirer EDTA-holdige medium som inneholdt frittliggende apoptotiske celler, og basseng frittliggende celler med "flytende" apoptotiske celler fra trinn 2,4 i en steril 15 ml polystyren sentrifugerør.
- Vask de apoptotiske celler tre ganger ved sentrifugering i 10 min ved 500 x g og resuspensjon i 10 ml 1x Ca + 2 - og Mg + 2 -fri DPBS pr vask.
- Etter den siste vaskingen, suspendere de apoptotiske celler i friskt kulturmedium B på ~ 5 x 10 6 celler pr ml før bruk for å stimulere responderceller. Alternativt, fikse vaskede apoptotiske celler i 0,4% (v / v) paraformaldehyd i 1x DPBS i 30 minutter, og vaskes deretter tre ganger med kulturmedium B, før suspensjonen i kulturmedium B.
- Som hensiktsmessig, bekrefter induksjon av apoptose ved strømningscytometri ved anvendelse av en separat fremstilling av apoptotiske celler (eller ved å reservere enkelte celler for dette formål), som tidligere beskrevet 6,9,10,15.
Merk: Tidlig apoptotiske celler har intakte cellemembraner, og vises som propidiumjodid (PI) -negative og annexin V-positive celler av redusert celle størrelse (i forhold til levedyktige celler). Sen apoptotiske celler har ikke-intakte cellemembraner, og fremstår som PI-positive og annexin V-positive celler med redusert cellestørrelse. Ved hjelp av den aktuelle protokollen, typiske preparater inneholder ~ 85% tidlig apoptotisk og ~ 15% sene apoptotiske celler. - Legg apoptotiske celler til BU.MPT responderceller (protokoll 3) ved en apoptotiske-til-responder celle-forhold på 1: 1, enten direkte eller etter fiksering av apoptotiske celler i 30 minutter med 0,4% (v / v) paraformaldehyd i 1x DPBS .
Merk: apoptotisk celle fiksering før stimulering av respondere børikke påvirke resultatet, med mindre de observerte signal hendelsene er på grunn av frigjøring av en oppløselig mediator (tabell 1).
3. Utarbeidelse av Necrotic BU.MPT Cells (protokoll 2)
Merk: Denne protokollen er spesifikk for BU.MPT celler som kilde til nekrotiske celler, og oppvarming som metode for nekrose induksjon. Alternativt kan en annen cellelinje, eller primær cellekultur, brukes som en kilde for nekrotiske celler, med nekrose indusert av standardiserte protokoller for den aktuelle celletype og fremgangsmåte for nekrose induksjon.
- Etter passering på 100 mm diameter sterilt polystyren vakuum-gassplasma som ble behandlet vevskulturskåler, vokser BU.MPT cellene til konfluens i en fuktig 5% (v / v) CO 2 atmosfære under permissive betingelser (dvs. ved 37 ° C i dyrkingsmedium A i 10 ml per parabol), som beskrevet i avsnitt 1.2.3.
- Skyll tilhenger cellemonolaget tre ganger med kulturmediet B, ved hjelp10 ml per skylling.
- Løsne cellene ved tilsetning av 5 mM EDTA i 1x Ca + 2 - og Mg + 2 -fri DPBS på 1 ml pr tallerken i 5 min. Aspirer EDTA-inneholdende medium inneholdende frigjorte celler, og legge til cellesuspensjonen til et sterilt 15 mL sentrifugerør polystyren.
- Vask cellene tre ganger ved sentrifugering i 10 min ved 500 x g og resuspensjon i 10 ml Ca + 2 - og Mg + 2 -fri DPBS pr vask.
- Etter den siste vaskingen, suspendere cellene i friskt kulturmedium B på ~ 5 x 10 6 celler pr ml.
- Induserer nekrose ved oppvarming av cellene til 70 ° C i 45 minutter i et vannbad, forsiktig virvling cellesuspensjonen hvert 10 min.
- Inkuber cellene i 2 timer i en fuktet 5% (v / v) CO 2 atmosfære ved 37 ° C. Forsiktig vortex cellesuspensjonen hvert 15 min.
- Når det passer, bekrefter induksjon av nekrose ved flowcytometri å bruke en egen utarbeidelse av necrotic-celler (eller ved å reservere enkelte celler for dette formål), som tidligere beskrevet 6,9,10,15.
Merk: nekrotiske celler har sprukket cellemembraner, og fremstå som PI-positive celler med økt cellestørrelse (i forhold til levedyktige celler). Ved hjelp av den aktuelle protokollen, typiske preparater inneholder ≥ 95% nekrotiske celler. Alternativt kan induksjon av nekrose og tap av membranintegritet bekreftes av Trypan blå farging.
4. Utarbeidelse av BU.MPT Responder Cells (protokoll 3)
Merk: Denne protokollen er spesifikk for BU.MPT celler som kilde til responder celler. Alternativt kan en annen cellelinje, eller primær cellekultur, brukes som responderceller. Forut for eksperimentell bruk, kan quiescence induseres over natten ved standardiserte protokoller i laboratoriet.
- Grow BU.MPT celler i sterile 100 mm vevskulturstudier retter under givende forholdene i kulturmediet En 10 ml pr fatet før de oppnår ~85% samløpet.
- Sug dyrkingsmedium A, og skyll cellene tre ganger med dyrkingsmedium B 10 ml per skylling. Serum-sulte cellene over natten i 18 til 24 timer i en fuktet 5% (volum / volum) CO2 atmosfære under ikke-permissive betingelser (dvs. ved 39 ° C i kulturmedium B på 10 ml pr tallerken), som beskrevet i avsnitt 1.2 0,4, for å indusere quiescence. Alternativt kan dyrke cellene i kulturmedium B pluss 10% (v / v) FBS ved 39 ° C i én dag før serum-sultet over natten celler i kulturmedium B uten FBS.
- Merk et eget vev kultur tallerken av konfluente BU.MPT celler for hver eksperimentell tilstand.
- Omfatte de følgende seks betingelser: stimulering av levedyktige BU.MPT reagerer med enten bærer eller epidermal vekstfaktor (EGF) i 15 min, etter deres eksponering i 30 minutter til enten ingen celler, apoptotiske celler, eller nekrotiske celler.
Merk: Eksponering for døde celler kan enten stimulere eller inhibere aktiviteten av en GIven signaliserer molekyl. Stimulering er best detektert over en lav grunnlinje (for eksempel fravær av EGF), mens hemming er best detektert fra et høyt nivå av (f.eks nærvær av EGF). Siden effekten av stimulering med døde celler er a priori ukjent, er det anbefalt å utføre alle studier både i fravær og nærvær av EGF.
5. Stimulering av Responder Celler med apoptotisk og nekrotiske celler (protokoll 4)
- Sug dyrkingsmedium B fra forhåndsmerkede retter av hvilende (serum-sultet) BU.MPT responder celler (protokoll 3).
Merk: Etter natten kultur under ikke-mottagelige forhold, bør BU.MPT cellene oppfører seg som primærkulturer av mus nyre PTEC. - Per 100 mm skål, tilsett 2 ml ett av følgende: dyrkingsmedium B (ingen celler); apoptotisk cellesuspensjon på ~ 5 x 10 6 celler per ml i dyrkningsmedium B (protokoll 1); eller nekrotisk cellesuspensjon på ~ 5 x 10 6 celler per ml in dyrkingsmedium B (protokoll 2).
- Fordel 2 ml suspensjon av døde celler jevnt over 100 mm fatet, og holde tid for dem å avgjøre på et minimum. For å oppnå dette, fordele døde cellesuspensjonen dråpe for dråpe med en bred spiss pipette over hele overflaten av de responder celle retter. Bruke et volum på 2 ml som et kompromiss mellom å minimere innsvingningstiden og unngå klumping av døde celler.
Merk: Bruken av en suspensjon av døde celler som en stimulans innebærer en rekke spesielle hensyn, som er beskrevet nedenfor i større detalj (tabell 2 og diskusjon). - Oppnå en død-til-responder celle-forhold på ca. 1: 1 ved tilsetning av 2 ml av døde celler ved ~ 5 x 10 6 celler pr ml til en konfluent mm skål 100, som inneholder ~ 10 x 10 6 celler. Alternativt, for å etablere den doseavhengigheten av eventuelle observerte signaleringshendelser, variere forholdet døde til responderceller kontinuerlig ved progressiv fortynning i kulture medium B av de døde cellesuspensjoner fremstilt i protokoll 1 og 2.
- Fordel 2 ml suspensjon av døde celler jevnt over 100 mm fatet, og holde tid for dem å avgjøre på et minimum. For å oppnå dette, fordele døde cellesuspensjonen dråpe for dråpe med en bred spiss pipette over hele overflaten av de responder celle retter. Bruke et volum på 2 ml som et kompromiss mellom å minimere innsvingningstiden og unngå klumping av døde celler.
- Virvle rettene, deretter inkuberes ved 37 ºC i en fuktet 5% (v / v) CO 2 atmosfære.
- Etter 30 minutter, stimulerer responderende celler med enten bærer eller 50 nM EGF, i henhold til pre-merking av kulturskålen.
- Inkuber i 15 minutter ved 37 ° C i en fuktet 5% (volum / volum) CO2 atmosfære.
- Vask bort de døde cellene ved å legge til 5 ml iskald 1x DPBS, virvlende fatet, og aspirere vaskevæsken. Gjenta tre ganger.
- Umiddelbart plassere responder celle retter på is for videre behandling.
- Forbered cellelysater
- Fremstille cellelyseringsbuffer inneholdende det følgende: 1 x Tris-bufret saltvann (TBS), 10 mM natriumpyrofosfat, 0,5% vekt / volum deoksycholat, 0,1% vekt / volum SDS, 10% glycerol og 25 mM natriumfluorid.
- Umiddelbart før cellelyse, legg til følgende i den rekkefølgen gitt i indicated konsentrasjoner: mini EDTA-fri protease inhibitor cocktail (en tablett per 10 ml lyseringsbuffer), 10% (v / v) Triton X-100, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM fenylmetansulfonylfluorid (PMSF), og 10 mM natrium orthovanadate.
- Legg 700 mL av iskald cellelyse buffer per 100 mm skål med fersk stimulerte svaret celler på is fra trinn 5.7. Skrap celler med en celleskraper, og overføre lysat til pre-avkjølt 1,5 ml mikrorør. Opprettholde rørene på is i 15 min.
- Sonikere lysater på is med 10 pulser med 20 Hz, mindre enn ett sekund hver i varighet. Unngå dannelsen av skum ved gass / væske-grenseflaten, da dette kan overopphetes prøvene. Fordype den ultralydsonden inn i mikrorør inneholder lysatene før du slår på ultralyd på, og slå av ultralyd før du tar ut sonden fra lysatene.
- Sentrifuger ved 20000 x g i 10 min ved 4 ° C, overfør supernatantene til frisk forhånd avkjølt mikrorør, Og oppbevar ved -70 ºC.
- Utføre gelelektroforese og immunblotting på supernatanter fra lysater, som tidligere beskrevet 6,9,10,15.
- Fremstille cellelyseringsbuffer inneholdende det følgende: 1 x Tris-bufret saltvann (TBS), 10 mM natriumpyrofosfat, 0,5% vekt / volum deoksycholat, 0,1% vekt / volum SDS, 10% glycerol og 25 mM natriumfluorid.
6. Forebygge direkte fysisk kontakt mellom mål og respondere Ved hjelp av en semipermeabel Polykarbonat Membrane (protokoll 5)
- Forbered BU.MPT responder celler i henhold til protokoll 3, med ett unntak; dyrke celler i sterilt polystyren vev kultur behandlet 12-brønns klynger.
- I utvalgte brønner, plassere en gjennomtrengelig støtte system som inneholder en 0,4 mikrometer polykarbonat membran for å hindre fysisk interaksjon mellom døde og responder celler. Omfatte kontrollbrønner uten en membran i samme eksperiment.
- Sug dyrkingsmedium B fra eksperimentelle brønner av serum-sultet BU.MPT responder celler.
- Følg protokoll 4 for stimulering av svaret celler med apoptotiske eller nekrotiske celler, med følgende endringer:
- Per brønn av en2-vel klynge, tilsett 0,1 ml ett av følgende: dyrkingsmedium B (ingen celler); apoptotisk cellesuspensjon på ~ 5 x 10 6 celler per ml i dyrkningsmedium B (protokoll 1); eller nekrotisk cellesuspensjon på ~ 5 x 10 6 celler per ml i dyrkningsmedium B (protokoll 2).
Merk: Som et konfluent brønn av en 12-brønns gruppen inneholder ~ 0,5 x 10 6 celler, tilsetning av 0,1 ml av døde celler på ~ 5 x 10 6 celler pr ml gir en død-til-responder celle-forhold på ca. 1: 1. - Til brønner som inneholder gjennomtrengelig støtteapparat, legge de døde cellene på toppen av 0,4 mikrometer polykarbonatmembran innenfor gjennomtrengelig støtteapparat, så det er ingen direkte fysisk interaksjon mellom døde og responder celler.
- Per brønn av en2-vel klynge, tilsett 0,1 ml ett av følgende: dyrkingsmedium B (ingen celler); apoptotisk cellesuspensjon på ~ 5 x 10 6 celler per ml i dyrkningsmedium B (protokoll 1); eller nekrotisk cellesuspensjon på ~ 5 x 10 6 celler per ml i dyrkningsmedium B (protokoll 2).
7. Hemming av Fagocytose med Cytochalasin D (Protocol 6)
- Forbered BU.MPT responder celler i henhold til protokoll 3.
- Klargjør cytoskeletal inhibitor cytokalasin D i dimetylyl-sulfoksyd (DMSO) ved 4 mg / ml (1.000 x). Legg til pre-merkede retter av BU.MPT responderceller enten 10 ul av bærer (DMSO) eller 10 ul av cytokalasin D for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 4 ug / ml i 10 ml kulturmedium B.
Merk: Ved denne konsentrasjonen av cytokalasin D, fagocytose av BU.MPT celler og en makrofagcellelinjen ble hemmet av ≥90% 9,10. - Inkuber i 2 timer ved 37 ° C i en fuktet 5% (volum / volum) CO2 atmosfære.
- Følg protokoll 4 for stimulering av svaret celler med apoptotiske eller nekrotiske celler.
- Som hensiktsmessig, bekrefte inhibering av fagocytose av døde celler ved flow cytometri ved anvendelse av en separat fremstilling av døde og responderceller (eller celler som er reservert for dette formål), som tidligere beskrevet 9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1 gir vi en skjematisk viser timing og kritiske trinn er involvert i utarbeidelsen av apoptotiske celler (protokoll 1) og nekrotiske celler (protokoll 2) og stimulering av svaret celler med suspensjoner av apoptotiske og nekrotiske celler (protokoll 4).
I figur 2, gir vi representative resultater som viser effekten av apoptotiske celler på fosforylering av de to isoformer av serin-treonin-kinase glykogensyntasekinase-3 (GSK-3), GSK-3α og GSK-3β. GSK-3α / β har en fremtredende rolle i reguleringen av cellulær proliferasjon og overlevelse, så vel som dens viktig rolle i glukosemetabolismen. Fosforylering av GSK-3α ved serin-21 og GSK-3β ved serin-9 inhiberer kinase-aktivitet og i sin tur fører til redusert fosforylering og økt stabilisering av β-catenin. p-cateninderetter translocates til kjernen, hvor den fremmer transkripsjon av gener som er kjent for å stimulere celleproliferasjon og hemme apoptose. Derfor er økt fosforylering av GSK-3α / β forbundet med økt proliferasjon og overlevelse, mens redusert fosforylering av GSK-3α / β korrelerer med redusert proliferasjon og overlevelse.
Eksponering av hvilende BU.MPT respondere til apoptotiske celler i 30 minutter inhiberte sterkt basal fosforylering av GSK-3α / β (figur 2A). På samme måte forutgående eksponering for apoptotiske mål for 30 min sterkt inhibert påfølgende epidermal vekstfaktor (EGF) -indusert fosforylering av GSK-3α / β (figur 2A). I motsetning til dette, eksponering av BU.MPT respondere til nekrotiske celler hadde noen effekt på basal eller enten EGF-indusert fosforylering av GSK-3α / β.
å foret fysisk interaksjon mellom BU.MPT respondere og apoptotiske celler, ble BU.MPT respondere dyrket i et gjennomtrengelig støtteapparat og atskilt fra apoptotiske mål av en 0,4 mikrometer polykarbonatmembran. Forebygging av fysisk interaksjon mellom BU.MPT respondere og apoptotiske celler avskaffet evne til apoptotiske mål å hemme fosforylering av GSK-3α / β (figur 2B). For å vurdere rollen til fagocytose brukte vi cytoskeletal inhibitor cytokalasin D for å hindre phagocytic opptak av døde celler. Inhibering av fosforylering av GSK-3α / β i respons til apoptotiske celler forekom i fravær av fagocytose (figur 2C). Vi har tidligere vist at cytokalasin D, ved den konsentrasjon som benyttes, inhiberer PTEC og makrofag fagocytose med ≥90% 9,10. Til sammen viser våre resultater at apoptotisk celle-mediert inhibering av fosforylering av GSK3α / β krever direkte fysisk interaksjon betwe no mål og responder celler, men er uavhengig av fagocytose.
Figur 1. Skjema for induksjon av intracellulære signal Hendelser i Levedyktige Responder celler ved fysisk interaksjon med nabocellene gjennomgår celledød. Linje grafer skildre timing og kritiske hendelser i fremstilling av (A) apoptotisk (Apo) celle og (B) nekrotisk (Necro) cellesuspensjoner av BU.MPT celler, og i (C) stimulering av levedyktig BU.MPT responder celler med suspensjoner av apoptotiske eller nekrotiske celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
/ftp_upload/54980/54980fig2.jpg "/>
Figur 2. Hemming av Fosforylering av GSK3α / β i BU.MPT Responder celler etter eksponering for apoptotiske celler krever direkte celle-celle interaksjon, men er uavhengig av Fagocytose. Serum-sultet BU.MPT responder-celler ble forbehandlet i 2 timer sammen med (A, B) eller kjøretøy (C) cytokalasin D (4 ug / ml), og deretter stimulert i 30 minutter med ingen celler (-), apoptotiske celler (Apo ), eller nekrotiske celler (NEC) ved en død celle til celle reagert forhold på 1: 1. Responder Cellene ble deretter vasket og inkubert i ytterligere 15 minutter i fravær eller i nærvær av EGF (50 nM) før høsting. Kilden for apoptotiske celler ble staurosporin-behandlede BU.MPT celler. Kilden for nekrotiske celler ble varmebehandlet BU.MPT celler. Interaksjon mellom døde celler og BU.MPT respondere var enten (A, C) uhindret, slik at direktedød celle-responder fysisk interaksjon, eller (B) med separering av døde celler og respondere med en 0,4 pm polykarbonatmembran i en permeabel støttesystem. Døde celler og ikke-adherente responder-celler ble fjernet ved vasking, og BU.MPT reagert cellelysater ble probet med anti-fosforylerte GSK3α / p-antistoffer som vist. Lik belastning ble bekreftet ved sentret for total glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Effekt på signale hendelse antar denne mekanismen | |||||||
| Innblanding | løselig mekler | Reseptor-mediert gjenkjennelse | fagocytose | ||||
| Fiksering av apoptotiske celler * | Elimination | Standhaftighet | Standhaftighet | ||||
| Fysisk separasjon av apoptotiske og responder celler † | Standhaftighet | Elimination | Elimination | ||||
| Ultrasentrifugert kondisjonert medium fra celler som gjennomgår apoptose som stimulus¶ | Standhaftighet | Elimination | Elimination | ||||
| Nekrotiske celler som stimulans | Elimination | Eliminering eller motsatt rettet respons (f.eks hemming versus stimulering) | Standhaftighet | ||||
| Latex perler som stimulans | Elimination | Elimination | Standhaftighet | ||||
| Farmakologisk hemming av fagocytose | Standhaftighet | Standhaftighet | Elimination | * Forventede resultater anta at fikseringen ikke endrer kritiske overflate determinanter som er ansvarlige for reseptor-mediert gjenkjennelse og / eller fagocytose. | |||
| † Forventede resultater medfører to forutsetninger: for det første, at det oppløselige mekleren er små nok til å passere gjennom porene i membranen som skiller den apoptotiske og responderende celler, og den andre, at eventuelle skur vesikler eller mikrovesikler, ofte betegnet apoptotiske legemer, er for store til å passere gjennom membranens porer. En rolle for vesikler eller mikrovesikler ville bli foreslått ved en manglende overensstemmelse i signaliseringshendelser som observeres med fysisk separering av apoptotiske og responderceller versus ultrasentrifugert kondisjonert medium. | |||||||
| ¶ Ultrasentrifugering (20000 x g i 30 min) er nødvendig for å fjerne eventuelle apoptotiske legemer eller annet skur uløselig materiale som kan etterligne effeCTS av det intakte apoptotiske cellen. | |||||||
Tabell 1. Identifikasjon av mekanismen (e) Ansvarlig for alarm hendelser i levende celler etter eksponering for apoptotiske celler. Flere enkle eksperimentelle strategier er gitt for å skille mellom den potensielle mekanismen (e) ansvarlig for signale hendelser observert etter eksponering for apoptotiske celler. Disse mekanismene er: fysisk interaksjon av apoptotisk celle med spesifikke reseptorer på responder celle, frigjøring av løselige mediatorer fra apoptotisk celle, og engasjement av responder cellens phagocytic maskiner.
| eksperimentell saken | Tilgjengelige strategier for reduksjon og / eller omgåelse |
| begrenset antallav apoptotiske celler pr reagerer celle (~ 1: 1 forhold). | 1. øke antallet av apoptotiske celler, men den apoptotiske-til-responder celle-forholdet bør holdes <2: 1. * |
| Behov for gravitasjon avhengig bosetting av apoptotiske celler. | 1. minimere volumet av mediet hvori apoptotiske celler suspenderes. |
| 2. Sentrifuger fatet eller tallerkenen for å drive de apoptotiske celler gjennom det suspenderende mediet raskere. | |
| Ujevn romlig fordeling av apoptotiske celler. | 1. fordele forsiktig apoptotisk cellesuspensjonen dråpe for dråpe med en bred spiss pipette over hele overflaten av de responder celle retter. |
| 2. Unngå kultur retter eller brønner med en diameter <35 mm, hvor menisk effekter kan føre til ujevne fordelinger. | |
| Heterogenitet av apoptotisk cellepopulasjon. | 1. Bruk en sterk induserav apoptose. |
| 2. Etter induksjon, fikse apoptotiske celler med paraformaldehyde, og sortere etter flowcytometri for å få en mer ensartet befolkning. | |
| celle-forhold * At apoptotisk-til-responder> 2: 1, vil de apoptotiske celler danner en konfluent teppe og ytterligere apoptotiske celler ikke lenger vil komme i direkte kontakt med responderceller | |
Tabell 2. Eksperimentell problemer forbundet med bruk av en Cellular Suspension som en stimulans av intracellulære signal Events. Flere eksperimentelle hindringer forbundet med bruk av en cellesuspensjon som en stimulans er oppført, samt strategier for deres delvis middel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi gir her en protokoll for å karakterisere den intracellulære signalhendelser som induseres i levedyktige celler etter deres eksponering for celler som gjennomgår apoptose, eller andre former for celledød. Protokollen understreker flere mekanismer som eksponering for apoptotiske celler kan modulere intracellulære signalveier innenfor levedyktige responder celler. Disse mekanismene er: samspillet (via bridging molekyler eller overflate determinanter på de døde cellen eller skur vesikler og mikrovesikler, ofte betegnet apoptotiske legemer) med spesifikke reseptorer på responder cellen; utgivelsen av løselige formidlere (eller deres ekstracellulære generasjon 27); og inngrepet mellom fagocytisk maskineri. Under omstendigheter der betydelig fagocytose forekommer, er en tilleggsmekanisme som skal behandles levering av mediatorer, slik som mikroRNA, beriket innenfor den apoptotiske cellen eller dets vesikler 21. Betydningen av vår protokoll, sammenlignet med other metoder, ligger i dens forsiktig disseksjon av flere mekanismer som apoptotiske celler kan modulere signaloverføring innen svarer celler. En stor fordel er at de fleste av teknikkene som kreves er enkle og standard til cellekultur.
Mens protokollen er spesifikk for BU.MPT celler, Immortalisert musenyre PTEC linje, som kilde til både døde og responderende celler, er tilpasning av protokollen til andre cellelinjer eller primære cellekulturer enkel og lett implementeres. Videre, som i våre tidligere publikasjoner, kilden til døde og responderende celler trenger ikke nødvendigvis være den samme 9,10,19. Mens vi beskriver bruken av staurosporin og varme som induserer apoptose og nekrose, henholdsvis modusen og utløser av celledød, kan også variere. Mens signal hendelsene indusert i BU.MPT respondere etter eksponering for apoptotiske celler er i stor grad uavhengig av hvilken modus av apoptose induksjon, ha vihar observert noen forskjeller 9,10. Av denne grunn anbefaler vi Replikere viktige resultater med flere forskjellige utløsere av apoptotisk celledød. Hvis for eksempel høyt fagocytiske celler, slik som makrofager, blir brukt som respondere 4,6, eller hvis varigheten av interaksjon mellom respondere og døde celler er lang nok for vesentlig fagocytose å forekomme, da man kan vurdere en ikke-toksisk induserer apoptose, for eksempel ultrafiolett eller gamma-bestråling 4,9,10, for å utelukke potensielle phagocytic levering av toksinet. Alternative metoder for induksjon av nekrose kan også vurderes. Selv om vi har fått identiske resultater med oppvarming og fryse-tining av celler, omfattende celleklumpdannelse og avfall som forekommer med fryse-tine gjøre bruken problematisk.
Flere enkle strategier kan bidra til å belyse den aktuelle mekanisme ansvarlig for eventuelle signal hendelser observert etter eksponering for apoptotiske celler (tabell 1 tabell 1, kan virkningen på det observerte signaleringshendelse fastslå ansvarlig mekanisme. For eksempel, i tilfelle av reseptor-mediert erkjennelse av den apoptotiske cellen, skal den signaleringshendelse vedvarer til tross for fiksering av den apoptotiske cellen, og bør fjernes med erstatning av apoptotiske celler fra kondisjonert medium eller latekskuler, samt med fysisk separasjon av døde og responderende celler. Som svar på nekrotiske celler, bør den signaleringshendelse bli eliminert eller blir motsatt rettet (for eksempel, hemming versus stimulering).
Det er flere konsekvenser av denne begrensede dead-til-responder celle-forhold som kanføre til en reduksjon eller tilsløring av signal hendelser. Å samhandle fysisk med en levedyktig celle responder, må en apoptotisk celle først slå seg ned gjennom kolonnen av suspenderingsmedium. Selv med minimale volumer, kan tiden for sedimentering av celler være vesentlig, så lenge som 10 til 20 min. Intracellulære signal hendelser vil dermed bli ukoordinert blant responderende celler. Derfor er den første kontakt mellom responder og døde celler kan ikke være nøyaktig tidsbestemt, men i stedet faller innenfor et noe rekke ganger. For signalisering hendelser som oppstår på en tidsskala som er kortere enn den som er nødvendig for bunnfelling, kan denne mangel på synkronisering føre til en forringing av signalet slik at det ikke lenger kan skjelnes fra bakgrunnen. Selv signaler om lengre varighet, om ikke kraftig nok, kan være utsatt for dette problemet.
I tillegg til disse timelige saker, kan romlige saker også ha negativ innvirkning resultater. Menisk effekter, spesielt i brønner og retter av small diameter (for eksempel polystyren vevskultur behandlede 96-brønners grupper), eller fluid-strømmer som genereres av altfor kraftig pipettering kan føre til en ujevn fordeling av døde celler, og dermed skape en tilstand av fest eller sult blant responder-celler. Siden det målte signalet stammer fra at av alle responderceller i en enkelt brønn eller plate, kan variasjoner i fangst av døde celler skjule svakere signaler.
Et siste problem er relatert til heterogeniteten av den apoptotisk cellepopulasjon. Selv med en sterk utløser av apoptose, så som staurosporin, vil en eventuell fremstilling av døde celler inneholder celler ved flere stadier av dødsprosess. Dette blir aktuelt, dersom styrken av responsen til den apoptotiske cellen avhenger av dens fase i dødsprosessen 10,14. Siden i gjennomsnitt hver celle å svare støter bare en apoptotisk celle, kan heterogeniteten i dette tilfelle føre til svekkelse av det samlede detektert signaleringshendelse. Tabell 2
Det finnes flere andre eksperimentelle bekymringer unikt forbundet med bruk av døde celler som en stimulans. Viktigere, kan dyrkningsforhold påvirker ikke bare reagerer cellene, men også de døde cellene selv. For eksempel, serumproteiner, hvis tilstede, kan feste seg til overflaten av de døde celler, og forsterke eller inhibere dets gjenkjenning ved å reagere celler. I feilsøking en inkonsekvent resultat, eller et resultat som avviker fra det som er rapportert i litteraturen, skal det legges vekt på følgende dyrkningsforhold (for både svaret og døde celler): graden av samløpet, passasje nummer, tilstedeværelse av serum, varmeinaktivering av serum og art og varighet quiescence. Til slutt, må man være klar over at celledød er en ubønnhørlig aspekt av alle cellekultur, og responderceller blir derfor kontinuerlig utsatt for et lavt nivå av dødceller. Denne eksponeringen kan potensielt påvirke den eksperimentelle svar på en bolus av døde celler, siden de aller signalene som studeres blir stadig indusert. Signalmodulasjon kan følge gjennom vanlig tilbakekoblingsveier, eller til og med ved valg av en subpopulasjon av responderceller, særlig hvis de induserte signaleringshendelser involvere overlevelse eller proliferasjon.
Oppsummert har vi beskrevet en protokoll for bestemmelse av intracellulære signalhendelser som induseres i levedyktige celler av deres fysisk interaksjon med tilstøtende døde eller døende celler. Selv om fokus er hovedsakelig på signale hendelser forårsaket av reseptor-mediert anerkjennelse av døde celler, protokollen tillater også identifikasjon av signale hendelser forårsaket av phagocytic opptak eller frigjøring av løselige mediatorer fra de døde cellene. Bruken av døde celler som en stimulans introduserer flere unike faktorer som kan hindre påvisning av intracellulære signal hendelser. Bevissthet om disse unique faktorer, samt flere mekanismer som døde celler modulerer intracellulær signalering, er kritisk til design og tolkning av eksperimenter innenfor dette voksende fagområde. Protokollen er beskrevet her bør hjelpe i å forstå de mekanismer som døde eller døende celler påvirker deres live naboer i både helse og sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1x with [4.5 g/L] glucose, ʟ-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100x | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/mL] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1x DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+- and Mg2+-free, 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10x, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 mL | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
References
- Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
- Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748 (2013).
- Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
- Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
- Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
- Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
- Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
- Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
- Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
- Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
- Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
- Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
- Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
- Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
- Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the "phoenix rising" pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13 (2010).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
- Hess, K. L., Tudor, K. -S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51 (2009).
- Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
- Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
- Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
- Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).
