Summary
I Parkinsons sykdom (PD), substantia nigra (SNC) dopaminerge nevroner utarte, som fører til motorisk dysfunksjon. Her rapporterer vi en protokoll for dyrking av ventral midthjernen nerveceller fra en mus som uttrykker EGFP drevet av en tyrosinhydroksylase (TH) promotorsekvens, høsting individuelle fluorescerende nevroner fra kulturer, og måle deres transkriptom bruker RNA-seq.
Abstract
I Parkinsons sykdom (PD) er det utbredt neuronalt tap i hele hjernen med uttalt degenerasjon av dopaminerge neuroner i SNC, som fører til bradykinesi, stivhet og skjelving. Identifiseringen av levende dopaminerge nevroner i primær Ventralt mesencefalisk (VM) kulturer ved hjelp av en fluoriserende fargestoff gir en alternativ måte å studere den selektive sårbarhet disse nevronene uten å stole på farging av faste celler. Her kan vi isolere, distansere, og kultur mus VM nevroner i 3 uker. Deretter identifiserer dopaminerge neuroner i kulturene ved hjelp av EGFP fluorescens (drevet med en tyrosinhydroksylase (TH) promoter). Individuelle nevroner høstes inn mikrosentrifugerør bruker glass mikropipetter. Deretter lysere vi de høstede cellene, og gjennomføre cDNA syntese og transposon-mediert "tagmentation" for å fremstille enkelt-celle RNA-Seq biblioteker 1, 2,ass = "xref"> 3, 4, 5. Etter å ha passert en kvalitetskontroll sjekk, er encellede biblioteker sekvensert og påfølgende analyse er gjennomført for å måle genuttrykk. Vi rapporterer transkriptom resultater for enkelte dopaminerge og gabaergic nevroner isolert fra midthjernen kulturer. Vi rapporterer at 100% av de levende TH-EGFP celler som ble høstet og sekvensert var dopaminerge nevroner. Disse teknikkene vil ha utbredte applikasjoner i nevrovitenskap og molekylærbiologi.
Introduction
Parkinsons sykdom (PD) er en uhelbredelig, aldersrelatert nevrodegenerativ lidelse. Årsaken til denne relativt vanlig lidelse forblir dårlig forstått. Det er utbredt neuronal tap i hele hjernen, med markert neuronal degenerasjon av dopaminerge nevroner i substantia nigra (SNC), som fører til diagnostiske kliniske funksjoner i bradykinesi, rigiditet og tremor.
Primære blandede kulturer inneholder SNC dopaminerge nevroner er spesielt relevant for Parkinsons sykdom. Ventral tegmentale Area (VTA) dopaminerge nevroner har vært innblandet i belønning og avhengighet. Ventral mesencefalisk (VM) primær blandede embryonale kulturer inneholde både SNC og VTA dopaminerge (DA) nevroner og gabaergic nevroner. VM primærkulturer kan være nyttig for nevrobeskyttelse analyser og for å klargjøre den selektive sårbarheten av dopaminerge neuroner. Det er ingen pålitelig måte å identifisere dopaminerge celler i kultur basert på morfologi. Hanre vi utvikler teknikker for å identifisere og høste enkelt dopaminerge nevroner, og konstruere encellede, high-yield RNA sekvensering biblioteker.
Vi rapporterer representative RNA transkriptom data for enkelt dopaminerge og gabaergic nevroner isolert fra midthjernen kulturer. Denne protokollen kan brukes til nevro, nevrodegenerasjon, og farmakologiske analyser for å studere effekten av ulike behandlinger på DA / GABA transkriptom. Fordi dopaminerge nevroner representerer et lite mindretall av nevroner uttrykt i primær VM kulturer, vil evnen til å pålitelig identifisere disse nevronene i levende kulturer muliggjøre en utvidet spekter av encellede studier. Disse nye teknikkene vil lette fremskritt i forståelsen av mekanismene som finner sted på cellenivå, og kan ha anvendelser andre steder innen nevro og molekylærbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle forsøkene ble utført i samsvar med retningslinjene for omsorg og bruk av dyr som tilbys av National Institutes of Health, og protokoller ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved California Institute of Technology.
1. Utledning av Primary Dopaminerge cellekulturer fra Embryonic Mouse Brain
- Løsninger og dyrkingsmedium
- Utarbeidelse av Ascorbic Acid lagerløsning
- Vei ut 352 mg askorbinsyre. Legg sterilt H2O til en endelig samlet volum på 20 ml. Sted i 37 ° C vannbad for å oppløse. Filtrer gjennom 0,2 mikrometer sprøytespissen og butikk i 500 mL alikvoter ved -20 ° C.
- Utarbeidelse av Papain lagerløsning
- Fortynn papain til 15 enheter / ml i 1x Hanks'-balanserte saltløsning (HBSS). Pipetter opp og ned 5 ganger for å bland godt. Forbered på dagen for disseksjon.
- Utarbeidelse av DNase lagerløsning
- Vei opp 20 mg DNase. Legg sterilt H2O til et totalt sluttvolum på 20 ml. Steril filter med 0,2 mikrometer sprøyte filter tips. Oppbevares ved -20 ° C i 1 ml porsjoner.
- Utarbeidelse av stoppløsning
- Fortynn 5 ml donor equine hesteserum til 10% i 45 ml 1 x HBSS. Steril filter med 0,2 mikrometer sprøyte filter tips. Oppbevar ved 4 ° C.
- Fremstilling av 4% bovint serumalbumin (BSA) forrådsoppløsning
- Vei opp 2 g av BSA og tilsett 1 x fosfatbufret saltløsning (PBS) til et totalt sluttvolum på 45 ml. Filter sterilisere med 0,2 mikrometer sprøytefilter tips. Oppbevar ved 4 ° C.
- Utarbeidelse av Plating Medium
- Til 494 ml medium, tilsett 1,25 ml dyrkningsmedium som inneholder L-alanyl-L-glutamin (en stabilisert kilde for L-glutamin) og 5 ml av donorhesteserum. Filter sterilisere med 0,2 mikrometer sprøyte filter tips. Oppbevar ved 4 ° C.
- Fremstilling av cellekulturmedium
- Into 196 ml plating medium, tilsett 4 ml B27 og 200 mL askorbinsyre. Filter sterilisere med 0,2 mikrometer filter. Oppbevar løsningen ved 4 ° C og bruk innen en uke.
- Utarbeidelse av 4% Paraformaldehyde (PFA) Solution
Forsiktig: Generelle forholdsregler for å bruke paraformaldehyde er som følger: Bruk en avtrekkshette, unngå hud- og øyekontakt, unngå innånding av damp, holde seg borte fra varme eller åpen flamme. Bruk egnet personlig verneutstyr. PFA kan gi allergi og eksem, derfor vaske hendene grundig etter håndtering.- Tilsett 10 ml av 16% PFA til 30 ml av 1 x PBS, pH 7,4.
- Fremstilling av 0,1% Triton X-100
- Pipetter 1 ml Triton X-100 i 9 ml 1 x PBS for å lage en 10% løsning. Pipetter langsomt å tillate viskøs løsning for å fylle pipette. Varm i 37 ° C vannbad til disløse. Lagre 10% lager ved 4 ° C.
- Fortynn 10% lager til 0,01% (for eksempel ved å utføre 2 serielle fortynninger 1:10: fortynne 1 ml 10% oppløsning i 9 ml 1 x PBS for å lage 1% oppløsning, 1 ml 1% oppløsning i 9 ml 1 x PBS for å lage 0,1% oppløsning).
- Fremstilling av 10% og 1% esel serum
- Tilsett 1 ml esel serum til 9 ml av 1 x PBS i en 10% løsning. Tilsett 0,5 ml esel serum til 49,5 ml av 1 x PBS, pH 7,4, for en 1% oppløsning.
- Utarbeidelse av 1x PBS
- Fortynn 10x PBS til 1 x ved tilsetning av 50 ml til 450 ml H2O Juster pH til oppløsningen til pH 7,4 ved hjelp av et pH-meter.
- Utarbeidelse av Ascorbic Acid lagerløsning
- Belegg kulturen Retter
- Poly-L-Ornithine Coating
- Coat bare 10 mm diameter glassbunn i sentrum av alle de 35 mm skåler med 120 mL poly-L-Ornithine å bruke steril teknikk. Inkuber i 1 time ved 37 ° C. Bruk støvsuger vifte til å suge poly-Lornithine. Skyll rettene to ganger med steril H 2 O.
- Laminin Coating (lager-konsentrasjon på 1 mg / mL)
- Fortynn 20 mL laminin med 2 ml sterilt H2O (sluttkonsentrasjon 0,01 mg / ml).
- Belegge bare de 10 mm diameter glassbunn i midten av alle rettene med 120 ul av laminin fortynnet til 0.01 mg / mL ved å bruke steril teknikk, og inkuberes i 1 time eller O / N ved 37 ° C før bruk.
- Poly-L-Ornithine Coating
- mus Dissection
MERK: Metodene i denne disseksjon er utformet for minimal eksponering av celler, som de er overført fra foster sekker til kulturen inkubatoren. Levedyktigheten av cellene blir bevart ved å fjerne bare en del av hjernen for disseksjon av midthjernen. Isolering av mellomhjernen forløper raskere, uten behov for å dissekere hele hjernen for å få tilgang til området. Se Tabell of Materials for musestamme brukt i denne studien. - Spray buken av avlives mus med 70% etanol. Ta tak i huden på nedre del av magen ved hjelp av pinsett med 2 x 3 tenner og åpne bukhulen ved hjelp sløv blad kirurgisk saks. Lag to kutt bevegelige sideveis og proksimalt på hver side. Brett over bukveggen ved hjelp av pinsett for å avsløre bukhulen.
MERK: Livmoren er nå utsatt. Utsette pleurahulen og etablering av pneumothorax sikrer også at dyret ikke gjenopprette. - Skjær begge ender av livmorhorn for å skille livmoren. Plasser i en petriskål i en steril hette.
- Ved hjelp av rett-tip pinsett i hver hånd åpne embryo sac og fjerne fosteret. Raskt halshogge ved å knipe hodet mot halsen med pinsett. Stabilisere hodet med tang godt plassert på snuten slik at dorsalflaten er tilgjengelig.
- Ved hjelp av pinsett holdt i den andre hand, klemme laget av huden og hodeskallen like før ryggen av mesencephalon. Skrelle tilbake huden og hodeskallen caudally langs midtlinjen. Plasser tang rundt ryggen med en spiss mellom hjernebarken og mesencephalon og den andre over lillehjernen.
- Knip og fjerne hele midthjernen, etterlater forhjernen på rostral side og lillehjernen på hale side. Plasser i en petriskål med kaldt HBSS under et dissekere mikroskop.
- Gjenta prosedyren for de resterende embryoer.
- Under dissekere mikroskop, flip over hjernen segment slik at ventral side er nå tilgjengelig. Det er nå 4 kvadranter synlig. Fjern alle hjernehinnene og blodkar ved forsiktig å ta tak i hjernehinnene og trekke oppover bort fra hjernen.
- Bruk pinsett for å stabilisere hjerne segment, mens separering av midthjernen. Plasser en tong av tang i ventrikkelen omtrent på midten av segmentet. Gjør det første snev dorsally, peker infor fatet, deretter medialt på hver side. Ta de to nederste kvadranter ved å gjøre side kutt på begge sider.
MERK: vev av interesse er i ventral dårligere delen, som vises tett. Denne regionen inneholder både VTA og SNC. - Trim og kast den vev som er mindre tett: Dette inkluderer den overlegne og underlegne colliculi. Plasser det dissekerte vev som inneholder både VTA og SNC i frisk HBSS på et separat område av petriskålen.
MERK: I denne fasen av mus hjernens utvikling (E14), er regionen av interesse i ventral midthjernen atskilt med en ventrikkel fra zona incerta og andre hypothalamus cellegrupper. Den mer langstrakt struktur av det fremkallende embryonale musehjerne tillater at forskjellen mellom disse områdene, som er plassert tettere sammen i den voksne mus hjernen. - Gjenta for alle de gjenværende hjerne segmenter.
- Etter at alle hjerne segmentene er dissekert Bruk pinsett og en nr 11 skalpell til kvartal each midthjernen seksjon i stykker med omtrent lik størrelse.
- Enzymatisk behandling av cellene
- Bruk en vid boring P1000 pipette til å ta opp alle kvartehjernen segmenter i HBSS og plassere dem i en 15 ml konisk tube. La segmentene faller til bunnen av røret og fjern HBSS som har blitt tatt opp med kvarte stykker.
- Legg 500 mL av papain løsning til røret og legger inn i et 37 ° C vannbad i 15 min. Resuspender celler ved finger flicking røret etter 7,5 min.
- Ved hjelp av en vid boring P1000 spiss, pipettes bare midthjernen segmentene i en 1 ml alikvot av deoksyribonuklease I (DNase) løsning. Tillate segmentene fikk sette seg på bunnen av røret.
- Ved hjelp av en vid boring P1000 spissen, overføre bare midthjernen segmentene til en 15 ml tube inneholder 1 ml kaldt stopp løsning for å skylle. La segmentene faller til bunnen av røret, og gjenta skylle viderece mer.
- Mekanisk Utgnidning cellesuspensjon
- Bytt siste skylling med 1 ml frisk stopp løsning og pipette opp og ned 7x med en P1000 pipette tips til triturer celler. Unngå overdreven finmaling å minimere cellelyse.
- Underlag cellesuspensjonen ved langsomt å pipettere 200 pl av 4% BSA-oppløsning inn i bunnen av røret. trekke forsiktig pipette for å unngå å forstyrre cellesuspensjonen lag. Etter sentrifugering ved 280 x g i 6 minutter, aspirer supernatanten med P1000 og resuspender cellene i 1 ml av pletteringsmedium.
- Utfør celletall ved hjelp av en hemocytometer. Fortynn cellesuspensjonen til 1000 celler / mL, med pletteringsmedium.
- Ved hjelp av et vakuum aspirator, aspirer laminin fra belagt retter, i grupper på maksimalt tre retter. Plate 120 mL (1,2 x 10 5 celler / parabol (78,5 mm 2
- Etter 1 time, tilsett forsiktig 3 ml kulturmedium til en uanriket område av kulturskålen for å minimalisere ødeleggelse av celler.
- Utfør en halv til full medium endring på cellekultur retter på 3 dager intervaller i 3 uker.
2. Høsting Cultured-dopaminerge nevroner for RNA sekvense
MERK: En oversikt over celle innhøsting og encellede RNA-sekvensering protokollen er gitt i Figur 1.
- Fremgangsmåte for å utføre før dagen av forsøket
- Ren borosilikatglass kapillarrør ved sonikering i 100% etanol i 15 minutter og deretter på nytt i destillert H2O i 15 min. Tapp av rør og stek over natten i en ovn ved 200 ° C for å inaktivere RNase.
- Bruk nyåpnetRNase-fri pipettespisser for å fremstille en stamoppløsning av 10x reaksjonsbuffer ved blanding av 19 pl av lyseringsbuffer 10x fra sekvenserings-settet med 1 mL av RNase-inhibitor oppløsning (20 pl totalt volum) i et mikrosentrifugerør. Spinn ned blandingen kort ved hjelp av en mikrosentrifuge og holde på is.
- Tilsett 2 ul av 10 x reaksjonsbuffer til hver av de enkelte 0,2 ml PCR-rør (som brukes til å samle inn de høstede neuroner). Merk rørene med riktige kodene identifiserer nevroner som skal høstes og lagre frosset ved 4 ° C.
- Fremgangsmåte for å utføre den dagen eksperimentet
- Fabrikasjon av høsting Pipettes.
- Trekk diameter mikropipetter stor-spissen (2-8 mikrometer) fra bakt kapillarrøret bruker en microelectrode avtrekker og glass-belagt oppvarming filament av en microforge. Sett avtrekker for å danne mikropipetter med en lang taper. Bruk en microforge utstyrt med en kalibrert okulartrådkorset og en høyeffekts objective å bryte tuppen av mikropipette til den ønskede størrelse spiss (10 - 20 um).
- Fest mikropipette inn i microforge pipette holder og montere holderen på microforge. Bringe spissen av mikropipette i fokus over glassbelagt varmefilament ved hjelp av den mekaniske manipulator av den microforge og slå på strømmen til filamentet for å varme det opp. Trykk pipettespissen til oppvarmet filament. Slå av strømmen når pipettespissen har smeltet til riktig diameter.
MERK. Stenge av strømmen vil føre filamentet til å bevege seg brått nedover og løsner fra pipettespissen, som produserer en stor, åpen-tippet pipette med den ønskede diameter. - Oppbevar de ferdig mikropipetter i en lukket boks inntil nødvendig.
- Høsting av nerveceller.
MERK. Dyrkede neuroner ble høstet etter en modifisert versjon av en tidligere publisert protokoll 6.- grundig clean alle overflater av celle innhøsting rom som kommer i kontakt med kulturer retter og samling rør ved hjelp av flytende desinfeksjonsmiddel og vann etterfulgt av en vannskylling. Tørk ned desinfiserte flater med 80% etanol og deretter en RNase-inhibitor-tilført tørk.
- Fylle to isolerte beholdere med is, en med vanlig (vann) is og en annen med tørris. Plasser 0,2 ml PCR samling rør fylt tidligere med 2 mL av 10x reaksjonsbuffer på vanlig is.
- Fjern kulturen fatet inneholder nerveceller fra inkubatoren, avløp kulturmediet fra fatet, skyll med 2 ml RNase-fritt Dulbeccos PBS (DPBS) og erstatte med en ml DPBS for høsting.
- Identifisere fluorescerende, TH-positive nevroner i de primære midthjernen kulturer ved hjelp av en invertert, epifluorescence mikroskop utstyrt med en 40X fase objektiv, en Hg lampe, og en GFP filtersett.
- Plasser pipetten over cellen soma ved hjelp av en motorisert eller manuell micromanipulator. Aspirer neuron i glasset mikropipette ved hjelp av et lett sug tilføres gjennom munnen gjennom plastrøret er festet til sideporten mikropipette holderen. Fjern umiddelbart mikropipette inneholder cellen fra bade løsning.
- Plassere pipettespissen inne i et 0,2 ml PCR-rør samling som inneholder reaksjonsbuffer, og bryter spissen mot siden av røret nær bunnen. Drive ut det gjenværende fluid (0,5 til 1,5 ul) fra det ødelagte spissen av mikropipette ved å anbringe en steril 21 G sprøytespissen på baksiden av mikropipette og påføring av ytre trykk.
- Sentrifuger samling rør i 5 s bruker en stasjonær mikro-sentrifuge og fryse det i tørris. Oppbevar prøverør inneholder enkeltceller ved -80 ° C. Vanligvis blir 5 cellene høstet per matrett i løpet av 1 time ved omgivelsestemperatur.
- Fabrikasjon av høsting Pipettes.
3. Single-celle RNA-Seq Library Generation
- <li> Generering av første cDNA
- Bring nedenfor reagenser på is til PCR kabinettet. Fremstille en første kjede masterblanding pluss 10% ved å kombinere følgende reagenser ved romtemperatur i en PCR-kabinett: 2 ul 5x første tråd buffer, 0,25 ul DTT (100 mM), 1 ul dNTP-blanding (10 mM), 1 pl oligonukleotid ( 12 uM), 0,25 ul RNase-inhibitor, og 1 pl revers transkriptase (100 enheter). Dette er revers transkriptase konsentrat-blanding (5,5 ul totalvolum per reaksjon).
- Ta prøvene fra -80 C på tørris og bringe til PCR kabinettet. Legg til følgende i enkeltcelleprøve: 1 mL 3 'primer 1 og 1 mL kvantifisert RNA toppene. Ta prøvene på en chiller blokk til en hot-lokk thermocycler forhåndsinnstilt på 72 ° C.
- Inkuber rørene i thermocycler i 3 minutter ved 72 ° C, og deretter sette prøvene på en PCR-kjøler rack.Legg 5,5 mL av master mix (fra trinn 3.1.1) til hver reaksjon rør og bland ved å pipettere forsiktig. Spinn 0,2 mL rør i 5 s og inkuberes i en termosykler som følger: 42 ° C i 90 min, 70 ° C i 10 min. Hold ved 4 ° C.
- Rensing av amplifisert First Strand cDNA.
MERK: PCR-forsterket cDNA blir renset ved immobilisering på magnetiske kuler. Bruk en magnetisk separasjon enhet for 0,2 ml rør.- Alikvot de magnetiske kuler i 1,5 ml rør. Før hver bruk, ta perle porsjoner til romtemperatur i minst 30 min og bland godt til å spre. Vortex magnetiske kuler til jevnt blandet.
- Legg 25 ul av magnetiske kuler for hver prøve. Bland ved pipettering hele volumet opp og ned minst 10x for å blande godt. Inkuber ved RT i 8 minutter for å la cDNA bindes til kulene.
- Utarbeidelse av PCR Master Mix
- Forbered ds-cDNA PCR Master Mix for alle reaksjoner med en additional 10% ved blanding av 5 ul 10 x PCR-buffer, 2 pl dNTP-blanding (10 mM), 2 pl PCR-primer 2 (12 uM), 2 pl 50x 2-polymerase blanding, og 39 ul nuklease fritt vann (50 pl totalt volum / reaksjon).
- Forsterkning av First Strand
- Plassere prøvene og magnetiske kuler på den magnetiske separasjonsanordningen ≥5 min, inntil væsken kommer helt klar, og det er ingen perler igjen i supernatanten.
- Å holde prøvene på separasjonsanordningen, pipette supernatanten og kasser. Spin prøvene i 5 s for å samle opp væsken fra den siden av røret. Plassere prøvene på magnetisk separasjonsanordning i 30 sekunder, og deretter fjerne alle gjenværende supernatanten med en P10 pipette.
- Tilsett 50 ul av PCR masterblanding til hvert rør inneholdende DNA bundet til kulene fra det foregående trinnet. Plasser røret på en forvarmet termosykler (95 ° C) med en oppvarmet lokk. Påbegynne termiske sykluser ved hjelp av følgende progrm: 95 ° C i 1 minutt, 26 sykluser med 95 ° C i 15 s, 65 ° C i 30 s, 68 ° C i 6 min. Deretter 72 ° C 10 min. Hold ved 4 ° C.
MERK: Ta kontakt med sekvensebrukerveiledning for mer informasjon og for å optimalisere prøve innstillinger.
- Rensing av amplifisert dobbeltkjedet cDNA
- Legg 90 mL av perler til hver prøve. Bland ved pipettering hele volumet opp og ned minst 10x for å blande godt. Inkuber ved RT i 8 minutter for å la cDNA bindes til kulene. Plassere prøvene pluss perler på den magnetiske separasjonsanordning for ≥5 min, inntil væsken kommer helt klar, og det er ingen perler igjen i supernatanten.
- Mens prøvene er på den magnetiske separasjonsenheten, fjern supernatanten og kast. Holde prøvene på den magnetiske separasjonsinnretningen. Legg 140 mL av rykende 85% etanol til hver prøve uten å forstyrre perlene. Vent i 30 sek. Pipette av supernatanten. cDNA vil forbli bundet til beads under vaskeprosessen.
- Gjenta etanol vask en gang til.
- I korthet spinne prøvene for å samle opp væsken fra den siden av røret. Plassere prøvene på magnetisk separasjonsanordning i 30 sekunder, og deretter fjerne alle gjenværende etanol med en pipette. Plassere prøvene ved romtemperatur i 2 - 2,5 minutter inntil pelleten er tørr og ikke lenger skinnende (dvs. før eren vises).
MERK: Tørk pellet bare inntil det er bare tørt. Den pellet vil se matt uten glans. Hvis pellet er ikke tørr, vil etanol forbli i prøvebrønner, noe som vil redusere den forsterkede cDNA utvinningsgraden og avkastningen. Dersom pelleten er over tørt, vil det være sprekker i pelleten. Det vil ta lengre tid enn 2 min å rehydrere og kan redusere forsterket cDNA utvinning og yield. - Når perlene er tørre, tilsett 22,5 mL av elueringsbuffer for å dekke kulen pellet. Ta ut prøver fra den magnetiske separasjonsinnretningen og blandes grundig for å resuspendere kulene. Icubate ved RT i 10 min å rehydrere.
- Spin prøvene i 5 s for å samle opp væsken fra den siden av røret. Plassere prøvene tilbake på den magnetiske separasjonsanordning for ≥1 min, inntil oppløsningen er fullstendig klar.
MERK: En liten bestand av perlene kan ikke pellet mot magneten under inkubasjon. Pipette disse unpelleted perler opp og ned for å resuspendere dem sammen med supernatanten og deretter pipette dem mot magneten, hvor resten av kulene har allerede pelletert (uten å forstyrre den eksisterende pellet). - Fortsett inkubasjonen inntil ingen kuler forblir i supernatanten. Overfør klar supernatant som inneholdt renset cDNA fra hvert rør til et nuklease-fri, med lav adhesjon rør. Merk hver tube med sample informasjon og oppbevares ved -20 ° C. Prøvene kan lagres ved -20 ° C på ubestemt tid.
- Måling av DNA-konsentrasjon og fragment størrelse
- Gjennomføre en kvalitetskontroll ved å tallfeste en 1 mL aliquot av cDNA på et fluorometer. Vurdere 1 ul (3 ng) av ds-cDNA ved bruk av en elektroforese-system (som beskrevet i 1).
- Fragmentering av DNA
MERK: Bruk en DNA prøveopparbeidelse kit.- Tilsett 20 ul av cDNA (35 ng totalt) til et rør. Legg 25 ul Tagment DNA (TD) buffer til røret inneholdende cDNA.
- Tilsett 5 mL av TDE1 (Tagment DNA Enzyme) til røret. Pipettering opp og ned 10 ganger for å blande. Bruk en frisk spiss for hver prøve. Sentrifuger ved 280 xg ved 20 ° C i 1 min.
- Plassere prøvene i en termosykler med en oppvarmet lokk og kjøre den på: 55 ° C, 5,5 min. Raskt legge 50 mL QG løsning (gel utvinning kit). Pipettering opp og ned 10 ganger for å blande. Fortsett direkte til neste trinn.
- Rensing av Fragmentert DNA
- Legg 170 mL av perler, pipette opp og ned 10 ganger for å blande. La den sitte i 10 minutter. Sett rørene på magnet. La rørene sitter på magneten i 10 min.Mens prøvene er i den magnetiske separasjonsinnretningen, pipette supernatanten og kasser.
- La røret på magneten og tilsett 200 mL av 85% etanol. La sitte i 30 s, deretter fjerne etanol. Gjenta etanol vask. Spin røret 1000 xg ved RT.
- Sette røret tilbake på magneten. Pipetter ut all gjenværende etanol. La prøvene tørke ved romtemperatur i 15 min.
- Legg 21 ul elueringsbuffer fra gelen utvinning kit. La røret sitter utenfor magneten, pipetten opp og ned 10 ganger for å blande. La røret sitter ved RT i 15 min.
- Returnere røret til magneten i 5 min. Pipetter 20 ul av oppløsning (renset DNA) inn i et nytt rør.
- Tagging og PCR Amplification av Fragmentert DNA
MERK: I dette trinnet det rensede DNA forsterkes via en begrenset-syklus PCR-programmet. PCR trinnet legger også indeks 1 (i7) og indeks 2 (i5) samt vanlige adaptere (P5 og P7) (kreves for klyngedannelse og sekvensering). Se i DNA sgod forberedelse guide for mer informasjon.- I en ny tube legge til 5 mL av indeksen 2 primere (hvit cap). Ved hjelp av en ny pipette legge til 5 mL av indeksen en primer (orange cap). Tilsett 15 ul av PCR masterblanding til hvert rør.
- Tilsett 5 ul av PCR-primeren cocktail til hvert rør. Tilsett 20 pl av renset DNA til røret. Forsiktig pipette opp og ned 3 - 5 ganger.
- Utføre PCR ved anvendelse av følgende program på en thermocycler: 72 ° C i 3 minutter, 98 ° C i 30 s, 5 sykluser med 98 ° C i 10 s, 63 ° C i 30 s, 72 ° C i 3 min. Hold ved 10 ° C. Man går umiddelbart videre til PCR opprydding eller lagre prøven ved 4 ° C i opptil 2 dager.
- Rensing av amplifiserte DNA fragmenter
- Ta med perler på RT. Forbered fersk 85% etanol. Ta prøver av PCR maskinen og spinne ned kort.
- Tilsett 30 ul av perler til røret. Forsiktig pipette blande opp og ned 10x. La røret stå ved romtemperatur i 5 minutter. Place back på magneten i 5 min. Med røret på magneten bruke en pipette for å kaste supernatanten.
- Tilsett 200 ul av 85% ethanol til hvert rør. Pipette etanol av etter 30 s. Gjenta 85% etanol vask. Pipette etanol av etter 30 s.
- Med rørene fortsatt på magneten og caps åpen, la perlene lufttørke i 15 min. Fjerne rørene fra magneten.
- Legg 32,5 ul elueringsbuffer. Forsiktig pipette opp og ned 10x. Inkuber av magnetenheten for 10 - 15 min.
- Returner rørene til magneten i 2 minutter, eller inntil den overliggende væske er fjernet. overføre nøye 30 ul av supernatanten til et nytt rør.
- Måling av DNA-konsentrasjon og fragmentstørrelse
- Gjennomføre en kvalitetskontroll ved å kvantifisere DNA konsentrasjon på 1 mL av cDNA på en fluorometer. Bestem fragmentet størrelsen av DNA ved elektroforese. Vurdere 1 ul (3 ng) av ds-cDNA.
- sekvense~~POS=TRUNC
- Ta med encellede RNA-Seq bibliotekene til en sekvense anlegget. Generere 100 bp sekvense leser på en sequencer følge en tidligere utgitt protokoll 4.
MERK: Hver sekvense bibliotek genererer> 20 millioner unikt kartlegging leser.
- Ta med encellede RNA-Seq bibliotekene til en sekvense anlegget. Generere 100 bp sekvense leser på en sequencer følge en tidligere utgitt protokoll 4.
MERK: For de følgende trinnene bruker reagenser fra kommersielle sekvense kit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her kan vi rapportere en protokoll for dyrking av ventral midthjernen nerveceller fra en mus som uttrykker EGFP drevet av en tyrosinhydroksylase promotersekvens, høsting individuelle fluorescerende neuroner fra kulturene, og måle deres RNA transkriptomet ved hjelp av RNA-seq (figur 1). Dataene viste at 100% av TH-EGFP-positive celler som ble høstet og sekvensert var dopaminerge neuroner, basert på tilstedeværelsen av de følgende tre DA-relaterte gentranskriptene, TH, dopa-dekarboksylase (DDC), og dopamintransport DAT (slc6a3). Alle de Th-EGFP-positive celler uttrykte disse tre genene som bedømt ved RNA-Seq. I hver enkelt-celle RNA-Seq bibliotek 6000 - 8000 protein-kodende gener ble påvist (figur 2). De dopaminerge neuroner robust uttrykke dopamin-relaterte transkripter i tillegg til flere nikotin acetylkolin reseptor (nAChR) underenhetene (tabell 1). Vi har observert at ingent alle cellene som var negative for TH var GABAergic; derfor har vi definert celler som GABAergic basert på tilstedeværelsen av Gad1 transkriptet som bedømt ved RNA-seq. Cellene som vi definert som GABAergiske neuroner ikke uttrykker dopamin-relaterte transkripter, men som nevnt gir uttrykk for en stor gen for GABA-syntese, Gad1. Den encellede biblioteker avslørte også lang ikke-kodende RNA, så vel som transkripter som koder for kanaler, reseptorer, nukleære proteiner, histoner, organellar proteiner, og transkripsjonsfaktorer.
Figur 1. RNA-Seq i Individual nevroner, som ble utført i vår Forsøk på primær TH-EGFP Mouse midthjernen kulturer. (1) Kultur TH-EGFP mus ventral nevroner i 3 uker. (2) Identifiser fluorescerende enkelt neuroner ved å eksitere GFP hjelp av en Hg lyskilde og FITC / GFP filter. (3) With samme 40X objektiv under fase optikk, visualisere enkeltnerveceller og riktig posisjon pipetten. (4-5) Aspirer enkelt celle i glasset mikropipette. Bildene viser en celle etter høsting: (4) Fase 40X; (5) EGFP fluorescens. (6) Lyse celler med lyseringsbuffer med oligo-dT primer ved 72 ° C. (7) cDNA syntese; 26 sykluser forsterkning. (8) Transposon-mediert "tagmentation" av cDNA. (9) cDNA kvalitetskontroll og multiplex sekvensering. (10) Påfølgende beregningsanalyse ved hjelp Tophat, mansjettknapper og Cuffdiff 7. Relativ overflod av uttrykte gener ble målt i enheter av fragmenter per kilobase av transkripsjon per million kartlagt leser (FPKM). Målet med RNA-seq er å tilveiebringe en liste av gener som blir uttrykt i en celle og deres relative overflod. Bilder (2-4) er fra dagens work, (6-10) er forandret fra en tidligere rapport 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. The Number of proteinkodende gener påvist i enkelt dopaminerge RNA-Seq Biblioteker generert fra TH-EGFP-positive celler. 6000 - 8000 protein gener ble påvist i én celle bibliotekene. FPKM: Fragmenter per kilobase av transkripsjon per million kartlagt leser (FPKM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| gener | DA enkle celler n = 10 | GABAergiske enkeltceller n = 7 |
| FPKM (Mean ± SEM) | ||
| TH | 4714 ± 764 | 1,2 ± 0,14 |
| DDC | 779 ± 167 | 0,8 ± 0,1 |
| slc6a3 / DAT | 506 ± 144 | 0,5 ± 0,04 |
| DRD2 | 14 ± 8 | 0.1 ± 0,004 |
| chrna6 (α6) | 174 ± 57 | 0.0 |
| chrna4 (α4) | 17 ± 5 | 26,4 ± 2,3 |
| chrnb2 (β2) | 9 ± 3 | 17,3 ± 1,2 |
| chrnb3 (β3) | 38 ± 13 | 0.0 |
| Gad1 | 0.0 | 959,0 ± 70,0 |
| Htr3a | 0.0 | 0.6 ± 0.01 |
| Htr3b | 0.0 | 0.0 |
Tabell 1. Dopamin relaterte og nAChR Gene transkripsjoner i dopaminerge og GABAergic Nerveceller på dag 21 i VentrMidbrain kulturer. RNA-Seq data for TH-EGFP positive og negative nevroner vises. Enkeltceller ble høstet på dag 21. kultur RNA-Seq data viser at TH-positive neuroner EGFP hadde høye nivåer av DA-relaterte gentranskriptene, inkludert tyrosin hydroksylase (TH), dopa-dekarboksylase (DDC), dopamintransport DAT (slc6a3) og nikotin acetylkolin reseptor (nAChR) subenheter inkludert α6, α4, β2 og β3. Men disse cellene hadde lave nivåer av GABAergisk markørgenet glutaminsyre-dekarboksylase 1 (Gad1) og serotonin 5-HT3-reseptor-A og B-underenhetene (Htr3A og Htr3B). Gabaergic nevroner har lav til ingen nivåerav DA-relaterte genet karakterutskrifter, chrna6, chrnb3 og Htr3A / B, men har høye nivåer av Gad1. RNA-Seq (Cuffdiff) data vises for dopamin-relatert, gabaergic, nikotinreseptorer, og serotonin transkripsjoner. FPKM: Fragmenter per kilobase av transkripsjon per million kartlagt leser (FPKM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her isolere vi enkeltceller fra en heterogen befolkning med en fluoriserende tag, deretter studere hver celle med encellede RNA-seq. Vi rapporterer at 100% av de levende TH-EGFP celler som vi høstet og sekvensert var faktisk dopaminerge nevroner, basert på tilstedeværelsen av følgende tre DA-relaterte genet transkripsjoner, TH, DDC og slc6a3. Alle de Th-EGFP-positive celler uttrykte disse tre genene som bedømt ved RNA-Seq. Dette var konkordant med elektrofysiologiske studier som viste at hver TH-EGFP celle vises også et repertoar av ionekanaler forbundet med dopaminerge nevroner 8, 9. I denne protokollen benyttet vi den GENSAT tyrosin hydroksylase-EGFP musestamme 10 som en pålitelig markør for live dopaminerge nevroner. I WT kulturer er det i dag ingen pålitelig måte å identifisere levende dopaminerge nevroner basert på deres morfologi. Til tross for vår omfattende erfaring i idengjørende og opptak fra dopaminerge nevroner, i villtype kulturer bare tre av ti av de mistenkte dopaminerge cellene høstet var dopaminerge nevroner. I tillegg observerte vi at ikke alle cellene som var negative for TH var GABAergic. Vi definerte celler som GABAergic basert på tilstedeværelsen av Gad1 transkripsjon og fraværet av DA-relaterte transkripter som bedømt ved RNA-seq.
Fordi dopaminerge nevroner representerer et lite mindretall av nevroner uttrykt i primær VM kulturer, vil evnen til å pålitelig identifisere disse nevronene i levende kulturer forbedre utvalget av tilgjengelige encellede studier. Denne protokollen kan brukes til nevro, nevrodegenerasjon, og farmakologiske analyser for å studere effekten av ulike behandlinger på dopaminerge transkriptom. I tillegg kan man bruke denne protokollen for immunhistokjemisk, elektro, BioPhotonic 11, og i prinsippet, proteomikk analyser. DeSE analyser er spesielt nyttige for Parkinsons sykdom og avhengighet forskning. Men selvfølgelig er analoge protokoller, for GENSAT mus eller lignende merket mus, kunne brukes for andre sykdomstilstander eller for celler som er sjeldne. I tillegg denne protokollen gir en ny visning av heterogenitet innenfor en gitt nevronale subtype.
I tidligere studier, etter høsting én celle vi plassert den direkte i PBS; men nå er vi plasserer høstet enkelt celle direkte inn i reaksjonsbuffer. Dette resulterer i bedre kvalitet RNA-Seq bibliotekene som vurdert av antall gener oppdaget i hvert bibliotek. En av de viktigste begrensninger av teknikken er det fluorescens-merkede celler er nødvendig. Som nevnt tidligere, er det ingen virkelig pålitelig måte å identifisere en bestemt celletype i en blandet kultur basert på morfologi. Det store utvalg av cellespesifikke fluorescerende eller Cre-uttrykkende mus linjer nå tilveiebringer hensiktsmessig merket celler i mange tilfeller. Men omsorg should tas når du velger en passende fluorescerende mus linje, som en omfattende studie av transgene mus linjer fant at TH-Cre knock-in mus linjer utviser uttalt transgene uttrykk i nondopaminergic celler 12.
I tillegg et nytt skritt som kanskje må være optimalisert i fremtidige eksperimenter er ønsket spissen størrelsen på mikropipette. Hvis senere eksperimenter inkluderer bruk av andre enn dopaminerge neuroner celletyper, kan mikropipette spissen størrelse må være optimalisert for cellen av interesse.
RNA dypt sekvensering er en mer kraftfull teknikk enn mikromatriser. RNA-Seq gir god kjøre-to-run reproduserbarhet. Det dynamiske området er detektert sammenlignes med den faktiske transkripsjon overflod i cellene. Man kan oppdage alternative spleiseformer og nye isoformer. De novo-analyse av prøver uten en referanse gen er mulig; og hvis en ny referanse gen blir oppdaget dataene kan gjen analyseres forbestemt gen (er) uten å måtte kjøre våt-arbeid eksperiment igjen 13.
For å oppsummere, rapporterer vi at 100% av de levende TH-EGFP celler som ble høstet og sekvensert var dopaminerge nevroner. Denne teknikken går andre rapporter som identifiserer akutt dissosierte eller langsiktige kultivert dopaminerge nevroner fra GENSAT mus, 14, 15 og teknikken vil ha utbredte applikasjoner i nevrovitenskap og molekylærbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Hanks-balanced Salt Solution (HBSS), 1x | Gibco | 14175-095 | |
| Donor Equine Serum | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5 mM final concentration. |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50x stock solution, 1x final concentration. |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Stored at -20 °C in 20 µL aliquots |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| Blue pipette tips P1000 | Sorenson Bioscience | Inc. 10130 | |
| 10 mm shallow Petri dish | VWR | 25384-324 | |
| 37 °C Water bath | |||
| 37 °C, 5% humidity incubator | |||
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Donkey serum | Equitech | SD-0100HI | 100% stock solution, 1% final concentration. |
| Standard Pattern surgical scissors | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Forceps - 2x3 teeth | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Forceps - Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Forceps - Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco's Phosphate-buffered solution (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
| 21 G needle | BD PrecisionGlide Needle | 305167 | 100 needles |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | model P-87 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing | Clontech | 634936 | 100 rnxs,incl Advantage2PCR Kit |
| oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) | From the SMARTer Kit | ||
| Reverse transcriptase (100 units) | SMARTcribe reverse transcriptase | From the SMARTer Kit | |
| Primer 1 | 3’ CDSIIa primer | From the SMARTer Kit | |
| Primer 2 | IS PCR primer | From the SMARTer Kit | |
| 50x 2 polymerase mix | 50x Advantage 2 polymerase mix | From the SMARTer Kit | |
| 10x PCR buffer | 10x Advantage 2 PCR buffer | From the SMARTer Kit | |
| RNA Spikes | ThermoFisher | 4456740 | |
| PCR cooler rack | IsoFreeze PCR cooler rack | ||
| DNA Sample Preparation Kit | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 Samples |
| PCR master mix | Nextera PCR master mix (NPM) | From the Nextera Kit | |
| PCR primer cocktail (PPC) | Nextera PCR primer cocktail (PPC) | From the Nextera Kit | |
| Fluorometer | The Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer kit | Agilent | 5067-4626 | 110 rxns |
| Electrophoresis system | Agilent 2100 Bioanalyzer. | G2938C | |
| Magnetic beads: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
| RNAse wipe: RNAse Zap wipes | Ambion | AM9786 | Size 100 Sheets |
| Qubit ds HS Assay Kit | Molecular probes | Q32854 | 500 assays |
| Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Glass capillary tubing | (Kimax-51, 1.5 - 1.8 mm o.d.) | ||
| Microforge | Narishige (or equivalent) | ||
| Sequencer | Illumina HiSeq instrument | ||
| GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain | MMRRC stock number: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center |
References
- Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
- Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
- Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
- Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H.
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
- Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
- Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).
