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Neuroscience

La identificación fiable de las neuronas dopaminérgicas de estar en el mesencéfalo culturas utilizando ARN-Secuenciación y promotor impulsado TH expresión de EGFP

Published: February 10, 2017 doi: 10.3791/54981
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology (Caltech)

Summary

En la enfermedad de Parkinson (EP), Sustancia negra (SNC) se degeneran las neuronas dopaminérgicas, que conduce a la disfunción motora. Aquí se presenta un protocolo para el cultivo de las neuronas del cerebro medio ventral de un ratón expresan EGFP impulsada por una secuencia promotora tirosina hidroxilasa (TH), cosechando las neuronas fluorescentes individuales de los cultivos, y la medición de su transcriptoma utilizando ARN-ss.

Abstract

En la enfermedad de Parkinson (PD) hay una pérdida neuronal generalizado en todo el cerebro con la degeneración de las neuronas dopaminérgicas pronunciada en la SNC, que conduce a bradicinesia, rigidez y temblor. La identificación de la vida neuronas dopaminérgicas en cultivos primarios ventral mesencefálico (VM) usando un marcador fluorescente proporciona una forma alternativa para estudiar la vulnerabilidad selectiva de estas neuronas sin depender del inmunotinción de células fijadas. En este sentido, aislar, disociar, y la cultura neuronas de ratón VM durante 3 semanas. A continuación, identificar las neuronas dopaminérgicas en los cultivos utilizando eGFP fluorescencia (dirigido por un promotor tirosina hidroxilasa (TH)). Las neuronas individuales se recogen en tubos de microcentrífuga utilizando micropipetas de vidrio. A continuación, se lisan las células recogidas, y llevamos a cabo la síntesis de ADNc y "tagmentation" transposón mediada para producir bibliotecas de ARN-Seq sola celda 1, 2,culo = "xref"> 3, 4, 5. Después de pasar una revisión de control de calidad, las bibliotecas de unicelulares son secuenciados y posterior análisis se lleva a cabo para medir la expresión génica. Presentamos los resultados del transcriptoma para dopaminérgica individual y neuronas GABAérgicas en cultivos de mesencéfalo. Nos informan de que el 100% de las células TH-EGFP en vivo que fueron cosechados y secuenciados eran neuronas dopaminérgicas. Estas técnicas tienen amplias aplicaciones en la neurociencia y la biología molecular.

Introduction

La enfermedad de Parkinson (PD) es un trastorno neurodegenerativo incurable, relacionada con la edad. La causa de este trastorno relativamente común sigue siendo poco conocida. Hay una pérdida generalizada neuronal en todo el cerebro, con la degeneración neuronal pronunciada de las neuronas dopaminérgicas en la Substantia Nigra (SNC), que conduce a las características clínicas de diagnóstico de la bradicinesia, rigidez y temblor.

cultivos mixtos primarios que contienen las neuronas dopaminérgicas SNc son especialmente relevantes para la enfermedad de Parkinson. Área tegmental ventral (VTA) neuronas dopaminérgicas se han implicado en la recompensa y la adicción. Ventral mesencefálico (VM) primarias embrionarios culturas mixtas contienen tanto las neuronas dopaminérgicas Snc y VTA (DA) y las neuronas GABAérgicas. VM cultivos primarios pueden ser útiles para los ensayos de neuroprotección y para dilucidar la vulnerabilidad selectiva de las neuronas dopaminérgicas. No hay manera confiable para identificar las células dopaminérgicas en cultivo basándose en la morfología. Élre desarrollamos técnicas para identificar y cosechar las neuronas dopaminérgicas individuales, y construir una sola célula, bibliotecas de secuenciación de ARN de alto rendimiento.

Presentamos los datos de ARN del transcriptoma representativos de una sola neuronas dopaminérgicas y GABAérgicas en cultivos de mesencéfalo. Este protocolo se puede utilizar para la neuroprotección, neurodegeneración, y los ensayos farmacológicos para estudiar los efectos de diversos tratamientos sobre el transcriptoma DA / GABA. Debido a que las neuronas dopaminérgicas representan una pequeña minoría de las neuronas expresadas en cultivos primarios de VM, la capacidad de identificar de forma fiable estas neuronas en cultivos vivos permitirá una gama mejorada de los estudios de una sola célula. Estas nuevas técnicas facilitarán los avances en la comprensión de los mecanismos que tienen lugar a nivel celular y pueden tener aplicaciones en los campos de la neurociencia y la biología molecular en otro lugar.

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Protocol

NOTA: Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices para el cuidado y uso de animales proporcionados por los Institutos Nacionales de Salud, y los protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en el Instituto de Tecnología de California.

1. Derivación de Primaria cultivos celulares dopaminérgicos del cerebro de embriones de ratón

  1. Soluciones y Medio de Cultivo
    1. Preparación de ácido ascórbico de la Solución
      1. Pesar 352 mg de ácido ascórbico. Añadir H2O estéril hasta un volumen total final de 20 ml. Lugar en 37 ° C baño de agua para disolver. Se filtra a través punta de la jeringa de 0,2 micras y almacenar en 500 alícuotas a -20 ° C.
    2. Preparación de la papaína de la Solución
      1. Diluir la papaína a 15 unidades / ml en solución salina equilibrada Hanks'-1x (HBSS). Pipetear arriba y abajo 5 veces para mezclar bien. Preparar el día de la disección.
    3. Preparación de DNasa Stock Solution
      1. Pesar 20 mg de DNasa. Añadir H2O estéril hasta un volumen final total de 20 ml. filtro estéril con punta de filtro de jeringa de 0,2 micras. Almacenar a -20 ° C en alícuotas de 1 ml.
    4. Preparación de la solución de parada
      1. Diluir 5 ml de donantes de suero equino al 10% en 45 ml 1x HBSS. filtro estéril con una punta de filtro de jeringa de 0,2 micras. Almacenar a 4 ° C.
    5. Preparación de 4% albúmina de suero bovino solución madre (BSA)
      1. Pesar 2 g de BSA y añadir tamponada con fosfato 1x solución salina (PBS) hasta un volumen final total de 45 ml. Esterilizar por filtración con punta de filtro de jeringa de 0,2 micras. Almacenar a 4 ° C.
    6. Preparación del medio de baño
      1. En 494 ml de medio, añadir 1,25 ml de medios de cultivo que contiene L-alanil-L-glutamina (una fuente estabilizada de L-glutamina) y 5 ml de suero equino donante. Filtro de esterilizar con 0,2 micras jeringa filter punta. Almacenar a 4 ° C.
    7. Preparación de medio de cultivo celular
      1. En 196 ml de medio de chapado, añadir 4 ml B27 y ácido ascórbico 200 l. Filtro de esterilizar con 0,2 micras filtro. Almacenar la solución a 4 ° C y utilizar dentro de una semana.
    8. Preparación de paraformaldehído solución al 4% (PFA)
      Precaución: las precauciones generales para el uso de paraformaldehído son los siguientes: Utilice una campana de ventilación, evitar la piel y el contacto visual, evitar la inhalación del vapor, mantener lejos del calor o llamas libres. Usar ropa de protección personal adecuado. PFA puede causar sensibilización y dermatitis, por lo tanto, lavarse bien las manos después de manipular.
      1. Añadir 10 ml de 16% PFA a 30 ml de 1x PBS, pH 7,4.
    9. Preparación de 0,1% de Triton X-100
      1. Pipetear 1 ml de Triton X-100 en 9 ml de 1x PBS para hacer una solución de 10%. Pipeta lentamente para permitir que la solución viscosa para llenar punta de la pipeta. Caliente en 37 ° C baño de agua a disresolver. Almacenar el 10% de stock a 4 ° C.
      2. Diluir 10% stock a 0,01% (por ejemplo, mediante la realización de 2 diluciones 1:10 en serie: una solución diluida de 1 ml de 10% en 9 ml de 1x PBS para obtener una solución de 1%; 1 ml de solución al 1% en 9 ml de 1x PBS para hacer solución de 0,1%).
    10. Preparación de 10% y 1% de suero de burro
      1. Añadir 1 ml de suero de burro a 9 ml de PBS 1x para una solución de 10%. Añadir 0,5 ml de suero de burro a 49,5 ml de 1x PBS, pH 7,4 para una solución al 1%.
    11. Preparación de 1x PBS
      1. Diluir 10x PBS a 1x mediante la adición de 50 ml en 450 ml de H 2 O. Ajustar el pH de la solución a pH 7.4 utilizando un medidor de pH.
  2. El recubrimiento de las placas de cultivo
    1. Poli-L-ornitina Coating
      1. Escudo sólo el fondo de vidrio de diámetro 10 mm en el centro de todos los platos de 35 mm con 120 l de poli-L-ornitina utilizando una técnica estéril. Se incuba durante 1 hora a 37 ° C. Utilice un aspirador de vacío para aspirar el poli-Lornithine. Lavar los platos dos veces con H2O estéril
    2. Laminina Revestimiento (concentración madre de 1 mg / ml)
      1. Diluir 20 l laminina con 2 ml de H2O estéril (concentración final de 0,01 mg / ml).
      2. Escudo sólo el fondo de vidrio de diámetro 10 mm en el centro de todos los platos con 120 l de laminina diluida a 0,01 mg / ml utilizando una técnica estéril, y se incuba durante 1 h o O / N a 37 ° C antes de su uso.
  3. La disección del ratón
    NOTA: Los métodos en esta disección están diseñados para una exposición mínima de las células, ya que se transfieren a partir de sacos embrionarios a la incubadora de cultivo. La viabilidad de las células se conserva mediante la eliminación de sólo una parte del cerebro para la disección del cerebro medio. Aislamiento de las ganancias del cerebro medio más rápidamente sin la necesidad de diseccionar el cerebro entero para acceder a la región. Véase la Tabla de materiales para la cepa de ratón usada en este estudio. La eutanasia a un ratón embarazadas sincronizados en gestacional día 14 usando CO2.
  4. Pulverizar el abdomen del ratón sacrificado con 70% de etanol. Agarre la piel del abdomen inferior utilizando unas pinzas con 2 x 3 dientes y abrir la cavidad abdominal con tijeras quirúrgicas hoja roma. Hacer dos cortes que se mueven lateralmente y de forma proximal en cada lado. Plegar sobre la pared abdominal usando forceps para exponer la cavidad abdominal.
    NOTA: El útero está ahora expuesta. La exposición de la cavidad pleural y la creación de neumotórax también se asegura de que el animal no se recupera.
  5. Cortar en ambos extremos de la trompa uterina para separar el útero. Colocar en una placa de Petri en una campana estéril.
  6. Con unas pinzas de punta recta en cada mano abrir el saco embrionario y quitar el embrión. decapitar rápidamente apretando la cabeza en el cuello con las pinzas. Estabilizar la cabeza con las pinzas firmemente colocados en el hocico de modo que la superficie dorsal es accesible.
  7. Usando las pinzas almacenadas en otro hectáreand, pellizcar la capa de la piel y el cráneo justo antes de la cresta del mesencéfalo. Pelar la piel y el cráneo caudal a lo largo de la línea media. Colocar una pinza alrededor de la cresta con una punta entre la corteza y el mesencéfalo y el otro sobre el cerebelo.
  8. Pinch y eliminar todo el cerebro medio, dejando atrás el cerebro anterior en el lado rostral y el cerebelo en el lado caudal. Colocar en un plato Petri con HBSS fría bajo un microscopio de disección.
  9. Repita el procedimiento para los embriones restantes.
  10. Bajo el microscopio de disección, dar la vuelta sobre el segmento de cerebro, de modo que el lado ventral es ahora accesible. En la actualidad hay 4 cuadrantes visibles. Eliminar todas las meninges y la vasculatura agarrando suavemente las meninges y tirando hacia arriba fuera del cerebro.
  11. El uso de fórceps para estabilizar el segmento de cerebro, mientras que la separación del cerebro medio. Coloque una de las pinzas de fórceps en el ventrículo aproximadamente en el centro del segmento. Hacer la primera dorsal pellizco, señalando into el plato, a continuación, a cada lado medial. Tomar los dos cuadrantes inferiores, mediante cortes laterales a ambos lados.
    NOTA: El tejido de interés se encuentra en la sección inferior ventral, que aparece denso. Esta región contiene tanto el VTA y la SNC.
  12. Recortar y desechar el tejido que es menos denso: esto incluye el colículo superior e inferior. Coloque el tejido diseccionado que contiene tanto el VTA y SNC en HBSS fresco en una zona separada de la placa de Petri.
    NOTA: En esta etapa del desarrollo del cerebro de ratón (E14), la región de interés en el cerebro medio ventral está separado por un ventrículo de la zona incerta y otros grupos de células del hipotálamo. La estructura más alargada del desarrollo de cerebro de ratón embrionario permite la distinción entre estas zonas, que se encuentran más cerca juntos en el cerebro de ratón adulto.
  13. Repita este procedimiento para todos los segmentos restantes del cerebro.
  14. Después de todos los segmentos del cerebro han sido disecados, el uso de fórceps y un bisturí No. 11 a trimestre eala sección del cerebro medio ch en trozos de aproximadamente el mismo tamaño.
  • Disociar las células
    1. Tratamiento enzimático de células
      1. Utilice una punta de pipeta P1000 de gran calibre para asumir todos los segmentos del cerebro medio en cuartos en la HBSS y colocarlos en un tubo cónico de 15 ml. Deje que los segmentos se depositan en el fondo del tubo y eliminar HBSS que ha sido tomado con las piezas en cuartos.
      2. Añadir 500 l de solución de papaína al tubo y colocarlo en un baño de agua a 37 ° durante 15 minutos. Resuspender las células de los dedos chasquean el tubo después de 7,5 min.
      3. Con una punta de P1000 de gran calibre, pipetas sólo los segmentos del cerebro medio en una alícuota de 1 ml de solución de desoxirribonucleasa I (ADNasa). Permitir que los segmentos a depositan en el fondo del tubo.
      4. Con una punta de P1000 de gran calibre, transferir sólo los segmentos del cerebro medio a un tubo de 15 ml que contenía 1 ml de solución de parada fría para enjuagar. Deje que los segmentos se depositan en el fondo del tubo y repetir el aclarado ence más.
    2. La trituración mecánica de la célula de suspensión
      1. Reemplazar el último enjuague con 1 ml de solución de parada fresca y la pipeta hacia arriba y abajo 7x con una punta de pipeta P1000 para triturar las células. Evitar trituración excesivo para reducir la lisis celular.
      2. UNDERLAY la suspensión de células pipeteando lentamente 200 l de solución de BSA al 4% en la parte inferior del tubo. retirar con cuidado la punta de la pipeta para no perturbar la capa de suspensión celular. Después de centrifugación a 280 xg durante 6 min, aspirar el sobrenadante con P1000 y resuspender las células en 1 ml de medio de baño.
  • Contar y placas las células
    1. Realizar el recuento de células usando un hemocitómetro. Se diluye la suspensión celular a 1000 células / l, con el medio de baño.
    2. El uso de un aspirador de vacío, aspirar la laminina de las placas revestidas, en grupos de un máximo de tres platos. Placa 120 l (1,2 x 10 5 células / placa (78,5 mm 2
    3. Después de 1 h, se añade cuidadosamente 3 ml de medio de cultivo a una zona no cabeza de serie de la placa de cultivo para minimizar la interrupción de las células.
    4. Realizar una media de cambio de medio completo en placas de cultivo celular a intervalos de 3 semanas durante 3 d.

    • Las neuronas cultivadas 2. La captura-dopaminérgicos para la secuenciación de ARN

    NOTA: Una visión general del protocolo de células-cosecha y de una sola célula ARN-secuenciación se da en la Figura 1.

    1. Pasos a realizar antes del día del experimento
      1. Tubo capilar de vidrio de borosilicato Clean por sonicación en 100% de etanol durante 15 min y luego de nuevo en H2O destilada durante 15 min. Escurrir el tubo y hornear durante la noche en un horno a 200 ° C para inactivar la RNasa.
      2. Utilice recién abiertopuntas de pipeta libres de RNasa para preparar una solución madre de tampón 10X de reacción mediante la mezcla de 19 l de 10x tampón de lisis del kit de secuenciación con 1 l de la solución de inhibidor de RNasa (20 l de volumen total) en un tubo de microcentrífuga. Centrifugar la mezcla usando brevemente un micro-centrífuga y mantener en hielo.
      3. Añadir 2 l del tampón de reacción 10x a cada uno de los tubos de 0,2 ml de PCR individuales (utilizados para recoger las neuronas cosechadas). Etiquetar los tubos con etiquetas apropiadas que identifican las neuronas para ser cosechadas y almacenar congeladas a 4 ° C.
    2. Pasos para realizar en el día del experimento
      1. La fabricación de las pipetas de cosecha.
        1. Tire micropipetas de diámetro a gran punta (entre 2 - 8 micras) del tubo capilar al horno con un extractor de microelectrodos y el filamento de calentamiento con revestimiento de vidrio de un microforge. Ajuste el extractor para formar micropipetas con rosca larga. Use un microforge equipado con un retículo de ocular calibrado y un ob alta potenciasubjetivo para romper la punta de la micropipeta al tamaño deseado de propina (10 - 20 micras).
        2. Sujetar la micropipeta en el soporte de la pipeta microforge y montar el soporte en el microforge. Llevar la punta de la micropipeta en el foco sobre el filamento de calentamiento con revestimiento de vidrio usando el manipulador mecánico de la microforge y el interruptor de la corriente al filamento para calentarlo. Toque la punta de la pipeta para el filamento caliente. Desconectar la corriente cuando la punta de la pipeta se ha fundido con el diámetro apropiado.
          NOTA. Interrumpir la corriente hará que el filamento se desplace repentinamente hacia abajo y se desprenden de la punta de pipeta, produciendo una pipeta grande, con punta abierta con el diámetro deseado.
        3. Almacenar las micropipetas completados en una caja cerrada hasta que se necesite.
      2. La recolección de las neuronas.
        NOTA. Neuronas cultivadas se recogieron después de una versión modificada de un protocolo previamente publicado 6.
        1. minuciosamente clean todas las superficies de la sala de pilas de recolección que entran en contacto con los platos y las culturas que utilizan tubos de recogida de líquido desinfectante y agua seguido de un enjuague con agua. Limpie las superficies desinfectadas con etanol al 80% y luego una RNasa-inhibidor con infusión de limpiar.
        2. Llenar dos contenedores aislados con hielo, uno con hielo (agua) regular y otra con hielo seco. Coloque los tubos de recogida de 0,2 ml PCR llenaron previamente con 2 l de 10x tampón de reacción en el hielo regular.
        3. Retire la placa de cultivo que contiene las neuronas de la incubadora, drenar el medio de cultivo de la antena, enjuague con 2 ml de PBS de Dulbecco libre de RNasa (DPBS) y reemplazar con 1 ml de DPBS para la cosecha.
        4. Identificar, neuronas TH-positivas fluorescentes en los cultivos primarios del cerebro medio que utilizan un invertida, microscopio de epifluorescencia equipado con un objetivo de 40X fase, una lámpara de Hg, y un conjunto de filtro de GFP.
        5. Coloque la pipeta sobre el soma celular utilizando a mi motorizado o manualcromanipulator. Aspirar la neurona en la micropipeta de vidrio usando una succión suave aplicado por la boca a través del tubo de plástico conectado al puerto lateral del soporte micropipeta. Retire inmediatamente la micropipeta que contiene la célula de la solución de baño.
        6. Coloque la punta de pipeta dentro de un tampón de reacción que contiene 0,2 ml colección tubo de PCR, y romper la punta contra el lado del tubo, cerca del fondo. Expulsar el líquido restante (0,5 a 1,5 l) de la punta rota de la micropipeta mediante la colocación de una aguja G jeringa estéril 21 en la parte posterior de la micropipeta y la aplicación de una presión hacia fuera.
        7. Se centrifuga el tubo de recogida durante 5 s utilizando un ordenador de sobremesa de microcentrífuga y congelarlo en hielo seco. Almacenar los tubos de recogida que contienen las células individuales a -80 ° C. Normalmente, 5 células se recogen por plato durante un período de 1 h a temperatura ambiente.

    3. Una sola célula RNA-Seq Biblioteca Generación

      <li> Generación de la primera cadena de ADNc
      NOTA: Para los siguientes pasos utilizan reactivos del kit de secuenciación comercial.
      1. Llevar los reactivos siguientes en el hielo en el gabinete de PCR. Preparar una primera mezcla maestra hebra plus 10% mediante la combinación de los siguientes reactivos a temperatura ambiente en un armario de PCR: 2 l de 5x tampón de primera hebra, 0,25 l DTT (100 mM), 1 l de mezcla de dNTP (10 mM), 1 l de oligonucleótido ( 12 m), 0,25 l de RNasa inhibidor, y 1 l de transcriptasa inversa (100 unidades). Esta es la inversa de la transcriptasa mezcla maestra (5,5 l de volumen total por reacción).
      2. Tomar las muestras de la -80ºC en hielo seco y llevar al gabinete de PCR. Agregue lo siguiente a la muestra de células individuales: 1 l 3 'del cebador 1 y 1 l cuantificó picos de ARN. Deje que las muestras en un bloque refrigerador en un preset termociclador con tapa caliente a 72 ° C.
      3. Incubar los tubos en el termociclador durante 3 min a 72 ° C, y luego poner las muestras en un estante de refrigerador PCR.Añadir 5,5 l de la mezcla maestra (de la etapa 3.1.1) a cada tubo de reacción y se mezcla pipeteando suavemente. Girar los tubos de 0,2 l durante 5 s y se incuba en un termociclador de la siguiente manera: 42 ° C durante 90 min, 70 ° C durante 10 min. Mantener a 4 ° C.
    1. Purificación de Amplified Primera cadena de ADNc.
      NOTA: El cDNA amplificado por PCR se purifica mediante inmovilización sobre perlas magnéticas. Utilice un dispositivo de separación magnética para tubos de 0,2 mL.
      1. Alícuota de las perlas magnéticas en tubos de 1,5 mL. Antes de cada uso, trae alícuotas de perlas a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos y mezclar bien para dispersar. perlas magnéticas vórtice hasta que esté bien mezclado.
      2. Añadir 25 l de perlas magnéticas a cada muestra. Mezclar con la pipeta todo el volumen arriba y abajo al menos 10 veces para mezclar bien. Se incuba a temperatura ambiente durante 8 minutos a que se unen a las perlas de ADNc.
    2. Preparación de PCR Master Mix
      1. Preparar la mezcla maestra ds-cDNA de amplificación por PCR para todas las reacciones con una adicional 10% mediante la mezcla de tampón de 5 l 10x PCR, 2 l de la mezcla dNTP (10 mM), cebador 2 (12 mM), 2 l 50x mezcla 2 de la polimerasa, y 39 l 2 l PCR nucleasa de agua libre (50 l volumen total / reacción).
    3. La amplificación de la primera cadena de
      1. Colocar las muestras y las perlas magnéticas en el dispositivo de separación magnética ≥5 minutos, hasta que el líquido aparezca completamente claro, y no hay granos que quedan en el sobrenadante.
      2. Mantener las muestras en el dispositivo de separación, una pipeta el sobrenadante y desechar. Girar las muestras durante 5 s para recoger el líquido desde el lado del tubo. Colocar las muestras en el dispositivo de separación magnética durante 30 s, a continuación, retire todo el resto de sobrenadante con una pipeta P10.
      3. Añadir 50 l de la mezcla maestra de PCR a cada tubo que contiene el ADN unido a las perlas de la etapa anterior. Se coloca el tubo en un ciclador térmico precalentado (95 ° C) con una tapa calentada. Iniciar el ciclo térmico utilizando la siguiente program: 95 ° C durante 1 min, 26 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 65 ° C durante 30 s, 68 ° C durante 6 min. A continuación, 72 ° C 10 min. Mantener a 4 ° C.
        NOTA: Consulte el manual de usuario de secuenciación para más detalles y para optimizar los ajustes de muestra.
    4. La purificación del ADNc de hebra doble amplificado
      1. Añadir 90 l de cuentas para cada muestra. Mezclar con la pipeta todo el volumen arriba y abajo al menos 10 veces para mezclar bien. Se incuba a temperatura ambiente durante 8 minutos a que se unen a las perlas de ADNc. Colocar las muestras más cuentas en el dispositivo de separación magnética para ≥5 minutos, hasta que el líquido aparezca completamente claro, y no hay granos que quedan en el sobrenadante.
      2. Mientras que las muestras están en el dispositivo de separación magnética, eliminar el sobrenadante y desechar. Mantener las muestras en el dispositivo de separación magnética. Añadir 140 l de recién hecho etanol 85% a cada muestra sin perturbar las perlas. Espere 30 s. Pipetear el sobrenadante. ADNc permanecerá ligado a la beads durante el proceso de lavado.
      3. Repetir el lavado con etanol una vez más.
      4. Brevemente girar las muestras para recoger el líquido desde el lado del tubo. Colocar las muestras en el dispositivo de separación magnética durante 30 s, a continuación, retire todo el etanol restante con una pipeta. Colocar las muestras a temperatura ambiente durante 2 a 2,5 min hasta que el pellet es seco y ya no brillante (es decir, antes de que aparezca una grieta).
        NOTA: Secar el precipitado a que sea de solo seco. El sedimento se verá mate sin brillo. Si la pastilla no está seca, el etanol se mantendrá en los pocillos de muestra, lo que reducirá la tasa de recuperación de ADNc amplificado y el rendimiento. Si el sedimento es demasiado seco, habrá grietas en el pellet. Se necesita más tiempo de 2 minutos para rehidratar y puede reducir la recuperación de cDNA amplificado y el rendimiento.
      5. Una vez que los granos están secos, añadir 22,5 l de tampón de elución para cubrir el sedimento de perlas. Retirar las muestras desde el dispositivo de separación magnética y mezclar bien para resuspender las perlas. EnCubate a TA durante 10 min para rehidratar.
      6. Girar las muestras durante 5 s para recoger el líquido desde el lado del tubo. Colocar las muestras en el dispositivo de separación magnética para ≥1 minutos, hasta que la solución está completamente claro.
        NOTA: Una pequeña población de perlas puede no sedimentar contra el imán durante la incubación. Pipetear estas perlas unpelleted arriba y hacia abajo para volver a suspender con el sobrenadante y, a continuación pipetear ellos hacia el imán en el que el resto de las perlas ya han sedimentado (sin perturbar el sedimento existente).
      7. Continuar la incubación hasta que no los granos permanecen en el sobrenadante. Transferir el sobrenadante transparente que contiene cDNA purificado de cada tubo a un tubo de baja adhesión libre de nucleasa. Etiqueta de cada tubo con la información de la muestra y se almacena a -20 ° C. Las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C indefinidamente.
    5. Medición de la concentración de ADN y los fragmentos de tamaño
      1. Llevar a cabo un control de calidad mediante la cuantificación de un 1 l coliquot del ADNc en un fluorómetro. Evaluar 1 l (3 ng) de ds-cDNA utilizando un sistema de electroforesis (como se describe en 1).
    6. La fragmentación de ADN
      NOTA: Utilice un kit de preparación de las muestras de ADN.
      1. Añadir 20 l de cDNA (35 ng en total) para un tubo. Añadir 25 l de ADN Tagment (TD) de tampón al tubo que contiene el cDNA.
      2. Añadir 5 l de tde1 (Tagment enzima ADN) al tubo. Pipetear arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Utilice una punta nueva para cada muestra. Centrifugar a 280 xg, a 20 ° C durante 1 min.
      3. Colocar las muestras en un termociclador con una tapa calentada y dejar que funcione a: 55 ° C, 5,5 min. Rápidamente añadir 50 l solución QG (kit de extracción de gel). Pipetear arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Continuar directamente al siguiente paso.
    7. La purificación del ADN fragmentado
      1. Añadir 170 l de perlas, la pipeta hacia arriba y abajo 10 veces para mezclar. Deje reposar durante 10 minutos. Poner los tubos en el imán. Deje que los tubos se sientan en el imán durante 10 minutos.Mientras que las muestras están en el dispositivo de separación magnética, una pipeta el sobrenadante y desechar.
      2. Deje el tubo en el imán y añadir 200 l de 85% de etanol. Deje reposar durante 30 s, a continuación, eliminar el etanol. Repetir el lavado con etanol. Girar el tubo de 1.000 xg a temperatura ambiente.
      3. Poner de nuevo el tubo en el imán. Pipeta de descuento en cualquier etanol residual. Deje secar las muestras a temperatura ambiente durante 15 min.
      4. Añadir 21 l de tampón de elución del kit de extracción de gel. Deje reposar el tubo fuera del imán, la pipeta hacia arriba y abajo 10 veces para mezclar. Deje reposar el tubo a temperatura ambiente durante 15 min.
      5. Devolver el tubo para el imán de 5 min. Pipetear 20 l de solución (ADN purificado) en un nuevo tubo.
    8. Tagging y PCR La amplificación del DNA fragmentado
      NOTA: En este paso, el ADN purificado se amplifica a través de un programa de PCR de ciclo limitado. La etapa de PCR también añade índice 1 (i7) y el índice 2 (i5), así como adaptadores comunes (P5 y P7) (requerido para la generación de clúster y secuenciación). Consulte el ADN samplia guía de preparación para obtener más detalles.
      1. En un nuevo tubo de añadir 5 l de índice 2 cebadores (tapa blanca). Usando una nueva punta de pipeta añadir 5 l de índice 1 imprimación (tapa naranja). Añadir 15 l de PCR mezcla maestra a cada tubo.
      2. Añadir 5 l de PCR cóctel de imprimación a cada tubo. Añadir 20 l de ADN purificado al tubo. pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo 3 - 5 veces.
      3. Realizar PCR utilizando el programa siguiente en un termociclador: 72 ° C durante 3 min, 98 ° C durante 30 s, 5 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 63 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 3 min. Se mantiene a 10 ° C. Procederá inmediatamente a la PCR de limpieza o almacenar la muestra a 4 ° C durante un máximo de 2 d.
    9. Purificación de ADN amplificado fragmentos
      1. Llevar las cuentas a RT. Preparar fresca de etanol al 85%. Tomar muestras de máquina de PCR y centrifugar brevemente.
      2. Añadir 30 l de perlas al tubo. Suavemente pipeta de mezcla para arriba y hacia abajo 10 veces. Deje que el tubo de reposar a temperatura ambiente durante 5 min. lugar back en el imán durante 5 min. Con el tubo en el imán utilizar una pipeta para descartar el sobrenadante.
      3. Añadir 200 l de 85% de etanol a cada tubo. Pipeta de etanol después de 30 s. Repetir el lavado con etanol al 85%. Pipeta de etanol después de 30 s.
      4. Con los tubos todavía en el imán y las tapas abiertas, permitir que las perlas se sequen al aire durante 15 minutos. Retire los tubos del imán.
      5. Añadir 32,5 l de tampón de elución. pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Incubar fuera el imán durante 10 - 15 min.
      6. Devolver los tubos al imán durante 2 minutos, o hasta que el sobrenadante se haya resuelto. transferir cuidadosamente 30 l del sobrenadante a un nuevo tubo.
    10. Medición de la concentración de ADN y el fragmento Tamaño
      1. Llevar a cabo una comprobación de control de calidad mediante la cuantificación de la concentración de ADN de 1 l de la cDNA en un fluorómetro. Determinar el tamaño de los fragmentos de ADN por electroforesis. Evaluar 1 l (3 ng) de ADNc-.
    11. secuenciación
      1. Llevar las bibliotecas de ARN-Seq sola celda a una instalación de secuenciación. Generar 100 pb secuenciación lee en un secuenciador siguiendo un protocolo previamente publicado 4.
        NOTA: Cada biblioteca secuenciación genera> 20000000 única cartografía lee.

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    Representative Results

    Aquí se presenta un protocolo para el cultivo de las neuronas del cerebro medio ventral de un ratón que expresa eGFP impulsado por una secuencia de promotor de la tirosina hidroxilasa, la cosecha de las neuronas fluorescentes individuales de los cultivos, y la medición de su transcriptoma de ARN usando ARN-seq (Figura 1). Los datos mostraron que 100% de las células TH-eGFP-positivos que fueron cosechados y secuenciados eran neuronas dopaminérgicas, en base a la presencia de los siguientes tres transcripciones de genes relacionados-DA, TH, dopa descarboxilasa (DDC), y el transportador de dopamina DAT (SLC6A3). Todas las células TH-EGFP positivas expresaron estos tres genes según la evaluación de RNA-Seq. En cada biblioteca RNA-Seq una sola célula de 6.000 - 8.000 genes de codificación de proteínas se detectaron (Figura 2). Las neuronas dopaminérgicas robustamente expresan transcritos relacionados con la dopamina, además de varias subunidades del receptor nicotínico de la acetilcolina (nAChR) (Tabla 1). Hemos observado que not todas las células que fueron negativos para TH fueron GABAérgicas; Por lo tanto, hemos definido como células GABAérgicas en base a la presencia de la transcripción GAD1 según la evaluación de RNA-seq. Las células que definimos como las neuronas GABAérgicas no expresan transcritos relacionados con la dopamina, pero como se ha mencionado do expresar un gen importante para la síntesis de GABA, GAD1. Las bibliotecas de unicelulares también revelaron ARN largo no codificante, así como transcripciones de codificación de canales, receptores, proteínas nucleares, histonas, proteínas organellar, y factores de transcripción.

    Figura 1
    Figura 1. RNA-Seq en las neuronas individuales, tal como se realiza en nuestros experimentos en cultivos primarios TH-eGFP ratón mesencéfalo. (1) las neuronas ventrales Cultura TH-eGFP ratón durante 3 semanas. (2) Identificar las neuronas individuales fluorescentes mediante GFP emocionante utilizando una fuente de luz y el filtro de Hg / GFP FITC. (3) With el mismo objetivo de 40X bajo la óptica de fase, visualizar las neuronas individuales y posicionar correctamente la pipeta. (4 - 5) Aspirar la célula sola en la micropipeta de vidrio. Las imágenes muestran una célula después de la cosecha: (4) Fase de 40X; (5) EGFP fluorescencia. (6) lisar las células con tampón de lisis con oligo-dT a 72 ° C. (7) la síntesis de ADNc; 26 ciclos de amplificación. (8) transposón mediada "tagmentation" de cDNA. (9) control de calidad y secuenciación de ADNc multiplexado. (10) La posterior análisis computacional usando sombrero de copa, Gemelos y Cuffdiff 7. La abundancia relativa de los genes expresados ​​se midió en unidades de fragmentos por kilobase de transcripción por millón asignada lee (FPKM). El objetivo de ARN-ss es proporcionar una lista de genes expresados ​​en una célula y su abundancia relativa. Imágenes (2 - 4 de) son de la corriente WORk, (6 - 10) se modifica a partir de un informe anterior 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 2
    La Figura 2. El número de genes codificantes de proteínas detectadas en las Bibliotecas individual dopaminérgica RNA-Seq generadas a partir de células TH-eGFP-positivos. 6.000 - 8.000 genes de proteínas se detectaron en las bibliotecas de células individuales. FPKM: fragmentos por kilobase de transcripción por millón asignada lee (FPKM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Los genes Células individuales DA n = 10 Células individuales GABAérgicas n = 7
    FPKM (media ± SEM)
    TH 4714 ± 764 1,2 ± 0,14
    DDC 779 ± 167 0,8 ± 0,1
    SLC6A3 / DAT 506 ± 144 0,5 ± 0,04
    Drd2 14 ± 8 0,1 ± 0,004
    chrna6 (α6) 174 ± 57 0.0
    CHRNA4 (α4) 17 ± 5 26,4 ± 2,3
    chrnb2 (β2) 9 ± 3 17,3 ± 1,2
    chrnb3 (β3) 38 ± 13 0.0
    GAD1 0.0 959,0 ± 70,0
    Htr3a 0.0 0,6 ± 0,01
    Htr3b 0.0 0.0

    Tabla 1. nAChR y Gene Transcripciones en dopaminérgicas y GABAérgicas Las neuronas en el día 21 en VentrMidbrain culturas relacionados con la dopamina. se muestran los datos de RNA-Seq para TH-EGFP neuronas positivas y negativas. Las células individuales se recogieron el día de cultivo 21. Los datos de ARN-Seq mostrar que TH-EGFP neuronas positivas tenían altos niveles de transcritos de genes relacionados-DA, incluyendo la tirosina hidroxilasa (TH), dopa descarboxilasa (DDC), el transportador de dopamina DAT (SLC6A3) , y subunidades del receptor nicotínico de la acetilcolina (nAChR), incluyendo α6, α4, β2 y β3. Sin embargo, estas células tenían niveles bajos de la decarboxilasa del ácido glutámico gen marcador GABAérgicas 1 (GAD1) ​​y la serotonina 5-HT3 receptor subunidades A y B (Htr3A y Htr3B). las neuronas GABAérgicas tienen un bajo o ningún nivelde las transcripciones relacionadas con el DA de genes, chrna6, chrnb3 y Htr3A / B, pero tienen altos niveles de GAD1. datos de RNA-Seq (Cuffdiff) se muestran para las transcripciones relacionada con la dopamina, GABAérgicas, los receptores nicotínicos, y serotonina. FPKM: fragmentos por kilobase de transcripción por millón asignada lee (FPKM).

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    Discussion

    Aquí aislamos células individuales a partir de una población heterogénea utilizando una etiqueta fluorescente, a continuación, estudiar cada celda con una sola célula de ARN-ss. Nos informan de que el 100% de las células TH-EGFP en vivo que cosecharon y se secuenció eran neuronas dopaminérgicas de hecho, en base a la presencia de los siguientes tres transcripciones de genes relacionados con el DA, TH, DDC y SLC6A3. Todas las células TH-EGFP positivas expresaron estos tres genes según la evaluación de RNA-Seq. Esto es concordante con los estudios electrofisiológicos que mostraron que cada célula TH-eGFP también mostró un repertorio de canales iónicos asociados con las neuronas dopaminérgicas 8, 9. En este protocolo se utilizó el GENSAT tirosina hidroxilasa-eGFP cepa de ratón 10 como un marcador fiable de las neuronas dopaminérgicas en vivo. En las culturas WT actualmente no hay manera confiable de identificar las neuronas dopaminérgicas en vivo en función de su morfología. A pesar de nuestra amplia experiencia en la identificar y grabación de las neuronas dopaminérgicas, en los cultivos de tipo salvaje sólo tres de cada diez de las células dopaminérgicas sospechosos fueron cosechadas neuronas dopaminérgicas. Además, se observó que no todas las células que fueron negativos para TH eran GABAérgicas. Definimos como células GABAérgicas en base a la presencia de la transcripción GAD1 y la ausencia de los transcritos relacionados-DA según la evaluación de RNA-seq.

    Debido a que las neuronas dopaminérgicas representan una pequeña minoría de las neuronas expresadas en cultivos primarios de VM, la capacidad de identificar de forma fiable estas neuronas en cultivos vivos mejorará la gama de estudios de una sola célula disponibles. Este protocolo se puede utilizar para la neuroprotección, neurodegeneración, y los ensayos farmacológicos para estudiar los efectos de diversos tratamientos sobre el transcriptoma dopaminérgica. Además, se puede utilizar este protocolo de inmunohistoquímica, electrofisiológicos, biofotónica 11, y en principio, ensayos de proteómica. losLos ensayos se son especialmente útiles para la investigación de enfermedades y la adicción de Parkinson. Pero, por supuesto protocolos análogos, en ratones o ratones GENSAT etiquetados de manera similar, podrían ser utilizados para otros estados de enfermedad o para las células que son raras. Además, este protocolo da una visión que surge de la heterogeneidad dentro de un subtipo neuronal dado.

    En estudios previos, después de cosechar el unicelular lo colocamos directamente en PBS; sin embargo, ahora ponemos la célula sola cosechado directamente en el tampón de reacción. Esto da lugar a bibliotecas de ARN-Seq de mejor calidad según la evaluación de número de genes detectados en cada biblioteca. es que se precisan una de las principales limitaciones de la técnica de células etiquetadas con fluorescencia. Como se dijo anteriormente, no hay manera realmente fiable para identificar un tipo específico de célula en un cultivo mixto basado en la morfología. La amplia gama de fluorescencia específica de la célula o Cre-expresando líneas de ratón ahora proporciona células apropiadamente marcada en muchos casos. Sin embargo, sho cuidadould tener cuidado al seleccionar una línea de ratones fluorescente adecuado, como un extenso estudio de líneas de ratones transgénicos encontró que TH-Cre ronda en líneas de ratones exhiben una pronunciada expresión del transgen en las células nondopaminergic 12.

    Además, otro paso que puede necesitar ser optimizado en futuros experimentos es el tamaño de la punta deseada de la micropipeta. Si los experimentos futuros incluyen el uso de tipos de células distintas de las neuronas dopaminérgicas, puede necesitar ser optimizado para la célula de interés el tamaño de la punta de micropipeta.

    ARN secuenciación profunda es una técnica más poderosa que microarrays. RNA-Seq da una buena reproducibilidad run-to-run. El rango dinámico detectado es comparable a la abundancia de transcripción real dentro de células. Uno puede detectar formas alternativas de empalme y nuevas isoformas. El análisis de las muestras de novo y sin un gen de referencia es posible; y si se descubre un nuevo gen de referencia los datos pueden ser re-analizaron para lagen (s) específica sin tener que ejecutar el experimento húmedo trabajo de nuevo 13.

    En resumen, nos informan de que el 100% de las células TH-EGFP en vivo que fueron cosechados y secuenciados eran neuronas dopaminérgicas. Esta técnica se extiende a otros informes que identifican de forma aguda o disocian las neuronas dopaminérgicas cultivadas a largo plazo de los ratones GENSAT, 14, 15 y la técnica tendrá amplias aplicaciones de la neurociencia y la biología molecular.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Papain Worthington Biochemical Corporation  LS003126
    Hanks-balanced Salt Solution (HBSS), 1x Gibco  14175-095
    Donor Equine Serum Thermo Scientific  SH30074.03
    Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma  A7030-50G
    Medium: Neurobasal medium Gibco  21103-049
    Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX Gibco  35050-061 0.5 mM final concentration.
    L-Ascorbic acid Sigma  A7506
    B27 Gibco  17504-044 50x stock solution, 1x final concentration.
    35 mm glass bottom dishes MatTek   P35GC-1.5-10-C
    Poly-L-Ornithine Sigma  P4957
    Laminin Sigma  L2020 Stored at -20 °C in 20 µL aliquots
    Deoxyribonuclease I (DNase) Sigma  DN25
    Blue pipette tips P1000 Sorenson Bioscience  Inc. 10130
    10 mm shallow Petri dish VWR  25384-324
    37 °C Water bath
    37 °C, 5% humidity incubator
    16% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences  15710
    Triton X-100 Sigma  X100-500ML
    Donkey serum Equitech  SD-0100HI 100% stock solution, 1% final concentration.
    Standard Pattern surgical scissors Fine Science Tools 14000-14
    Forceps - 2x3 teeth Fine Science Tools 11022-14
    Forceps - Dumont #55 Fine Science Tools 11295-51
    Forceps - Dumont #5 Fine Science Tools 11252-23
    10x PBS, pH 7.4 Gibco  70011-044
    Dulbecco's Phosphate-buffered solution (DPBS) 1x Gibco 14190-144 500 mL
    21 G needle BD PrecisionGlide Needle 305167 100 needles
    Micropipette puller Sutter Instrument model P-87
    Micromanipulator  Sutter Instrument  MP-285
    Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing Clontech 634936 100 rnxs,incl Advantage2PCR Kit
    oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) From the SMARTer Kit 
    Reverse transcriptase (100 units) SMARTcribe reverse transcriptase From the SMARTer Kit 
    Primer 1 3’ CDSIIa primer  From the SMARTer Kit
    Primer 2 IS PCR primer From the SMARTer Kit
    50x 2 polymerase mix 50x Advantage 2 polymerase mix From the SMARTer Kit
    10x PCR buffer 10x Advantage 2 PCR buffer From the SMARTer Kit
    RNA Spikes ThermoFisher 4456740
    PCR cooler rack IsoFreeze PCR cooler rack
    DNA Sample Preparation Kit  (Illumina/Nextera) Nexter FC-121-1030 24 Samples
    PCR master mix Nextera PCR master mix (NPM) From the Nextera Kit 
    PCR primer cocktail (PPC)  Nextera PCR primer cocktail (PPC)  From the Nextera Kit
    Fluorometer The Qubit ThermoFisher Q33216
    HS DNA BioAnalyzer kit Agilent 5067-4626 110 rxns
    Electrophoresis system  Agilent 2100 Bioanalyzer. G2938C
    Magnetic beads: Agencourt AMPure  Beckman Coulter A63880 5 mL
    RNAse wipe: RNAse Zap wipes Ambion AM9786 Size 100 Sheets
    Qubit ds HS Assay Kit Molecular probes  Q32854 500 assays
    Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen  28704
    Glass capillary tubing (Kimax-51, 1.5 - 1.8 mm o.d.)
    Microforge Narishige (or equivalent) 
    Sequencer Illumina HiSeq instrument
    GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain  MMRRC stock number: 000292-UNC Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center

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    References

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    3. Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
    4. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
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