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Neuroscience

ट्रिगर सेल तनाव और मौत पारंपरिक यूवी लेजर confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Published: February 3, 2017 doi: 10.3791/54983
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine and Health Sciences, Macquarie University

Introduction

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी लंबे zebrafish सीएनएस में ट्रांसजीन, विकास 1 पर विशेष रूप से उनके प्रभाव के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी सेलुलर मस्तिष्क के विकास, मांसपेशियों पीढ़ी है, और कई अन्य विकासात्मक घटनाओं 2 में शामिल प्रक्रियाओं की एक विस्तृत मानचित्रण अनुमति दी गई है। एक व्यक्ति के सेल की मौत का अध्ययन अधिक चुनौतीपूर्ण हो गया है, मुख्य रूप से मानक इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान चयनात्मक कोशिका मृत्यु उत्प्रेरण के तकनीकी कठिनाइयों के कारण। हालांकि, एकल कोशिका संकल्प इमेजिंग और अत्यधिक लक्षित पृथक तकनीक के संयोजन तनाव और चोट करने के लिए तत्काल सेलुलर प्रतिक्रियाओं की जांच, साथ ही फलस्वरूप सेल सेल बातचीत के रूप में अनुमति देता है। इन प्रक्रियाओं को समझना महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से इस तरह के मोटर न्यूरॉन बीमारी (MND), जहां न्यूरॉन glia बातचीत प्रगति में योगदान करने के लिए दिखाया गया है के रूप में neurodegenerative रोगों के लिएरोग 3 की।

MND, या Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस (ए एल एस), एक विनाशकारी neurodegenerative रोग brainstem, मोटर प्रांतस्था, और रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन्स को प्रभावित करता है। इन न्यूरॉन्स की हानि मांसपेशियों की हानि की ओर जाता है, और रोगियों को 3 के भीतर मर जाते हैं - निदान 4 से 5 साल। मांसपेशी फाइबर करने के लिए रीढ़ की हड्डी की कड़ी में मोटर न्यूरॉन्स और मांसपेशियों के संकुचन को सुविधाजनक बनाने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इस संचार या इन न्यूरॉन्स की मौत की विफलता धीरे-धीरे मांसपेशियों को कमजोर और मरीज की, निगल करने के लिए चलते हैं, बोलते हैं, और साँस लेने की क्षमता को प्रभावित करता है। एक जीवित जानवरों में एक मोटर न्यूरॉन और छोटी अवधि के परिणामों की मौत Visualizing बेहतर सामान्य सेल homeostasis और रोग में शामिल गतिशील प्रक्रियाओं को समझने के लिए एक उत्कृष्ट अवसर प्रदान करता है।

Zebrafish neurodegenerative रोगों 1 अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है। इसऐसे बाह्य निषेचन, लघु विकास समय, तंत्रिका तंत्र के लिए ऑप्टिकल का उपयोग, और transgenesis की आसानी के रूप में, इस मॉडल जीव द्वारा की पेशकश की लाभ की वजह से है। इसके अलावा, क्षमता आसानी से यौगिक ट्रांसजेनिक zebrafish उत्पन्न करने के लिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के कई रणनीतियों लेबलिंग के लिए अनुमति देता है। जेनेटिक पृथक विशेष प्रकार की कोशिकाओं बल्कि व्यापक अशांति की अनुमति है, लेकिन अलग-अलग कोशिकाओं 5 को निशाना बनाने का ठीक नियंत्रण की कमी को मारने के लिए दृष्टिकोण। लेजर तकनीक की मदद से, दूसरे हाथ पर, ठीक अस्थायी और स्थानिक नियंत्रण प्रदान करते हैं और विभिन्न पशु मॉडल के लिए इस्तेमाल किया गया है। जबकि इस तरह के रूप में सबसे अधिक तरीकों का इस्तेमाल विशेष उपकरणों, स्पंदित लेसरों 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 या दो photon सेट-अप 13, अन्यअनुसंधान समूहों ने हाल ही में पारंपरिक confocal सूक्ष्मदर्शी 14 में एक यूवी लेजर का लाभ ले लिया है।

तकनीक यहाँ वर्णित एक यूवी लेजर की मध्यस्थता दृष्टिकोण चयनित मोटर न्यूरॉन्स में एक खुराक पर निर्भर रास्ते में सेलुलर तनाव या मौत का कारण के साथ उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोपी जोड़ती है। यह 405 एनएम लेजर आमतौर पर स्थापित के उपयोग पर निर्भर करता है, सेल संस्कृति में और रहने वाले जानवरों में सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया है, और इस तरह के neuronal मौत के बाद microglial निकासी के रूप में सेलुलर बातचीत के विस्तृत लक्षण वर्णन अनुमति देता है।

Protocol

नोट: डिजाइन, आचरण, और पशु प्रयोगों की रिपोर्टिंग मौजूदा दिशानिर्देशों 15 के खाते में रखना चाहिए। इस तरह के काम स्थानीय पशु कल्याण प्राधिकारी द्वारा अग्रिम में अनुमोदित किया जाना चाहिए (हमारे मामले में, मैक्वेरी विश्वविद्यालय के पशु आचार समिति)।

1. बढ़ते और यूवी सेल पृथक के लिए Zebrafish तैयार

  1. Zebrafish (Danio rerio) फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त उत्पन्न करता है।
    1. (के रूप में कहीं 16 वर्णित) zebrafish में ब्याज की फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए, zebrafish अंडे में से एक सेल चरण में प्लाज्मिड इंजेक्शन प्रदर्शन या फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक लाइनों का उपयोग करें। अनेक प्रकार की कोशिकाओं लेबल करने के लिए, की स्थापना की ट्रांसजेनिक लाइनों के हित के सवाल करने के लिए उचित पार करके यौगिक ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों पैदा करते हैं। एक पुरुष और एक महिला zebrafish शाम को एक झूठी नीचे जोड़ी संभोग टैंक के प्रत्येक पक्ष पर रखें और प्रकाश की शुरुआत के साथ विभक्त हटानेअगली सुबह (17 के रूप में कहीं विस्तृत)। 28 डिग्री सेल्सियस पर zebrafish रखें और स्थापित प्रोटोकॉल 17, 18 के अनुसार उन्हें संभाल।
    2. टैंक एक प्लास्टिक की चाय का झरनी के माध्यम से भ्रूण युक्त पानी के दबाव से सफल स्पॉन के बाद भ्रूण को ले लीजिए। प्रणाली पानी के साथ अंडे कुल्ला और उन्हें एक पेट्री डिश में अंडे पानी में स्थानांतरित।
    3. उन्हें एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत जांच निषेचन निर्धारित करने के लिए। स्टोर एक पेट्री डिश में निषेचित अंडे और 28 डिग्री सेल्सियस 18 पर एक मशीन में उन्हें जगह है।
  2. वैकल्पिक: विशेष सेल आबादी लेबल करने के लिए एक microinjection प्रदर्शन करना।
    नोट: यह एक वैकल्पिक तरीका है कि स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों को बढ़ाने के लिए आवश्यकता के बिना, अभिव्यक्ति और प्रोटीन के दृश्य के लिए अनुमति देता है। इस विधि को भी फायदेमंद है जब ब्याज की प्रोटीन विषैला होता है और एक स्थिर पार की पीढ़ी पर प्रतिबंध लगाता हैGenic लाइनों।
    1. के रूप में कहीं 19, 20, 21 में वर्णित है, zebrafish भ्रूण में से एक सेल चरण में प्लाज्मिड निर्माणों इंजेक्षन।
      नोट: इस विधि ब्याज की प्रोटीन की पच्चीकारी अभिव्यक्ति में यह परिणाम है। (जैसे, islet1 22, -3mnx1 23, 24, 25, या 26 MPEG1 मुलाकात) ब्याज की प्रोटीन पसंद का एक प्रमोटर से प्रेरित है Tol2 से घिरे दोहराता 20 उलटा।
  3. इच्छित आकार को मछली उम्र।
    1. 3 करने के लिए मछली उठाएँ - 5 दिन बाद निषेचन (DPF) और एक फ्लोरोसेंट यौगिक खुर्दबीन के नीचे उन्हें जगह है। उचित fluorophore अभिव्यक्ति के लिए जानवरों स्क्रीन और चमकीले लेबल मछली का चयन करें। अंडे पानी के साथ एक और डिश में उचित लार्वा अलग देर embedding के लिए(एक 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्टोर) पर आर।
      वैकल्पिक: भ्रूण रंजकता के गठन को बाधित करने के लिए एक 0.2 मिमी 1-फिनाइल-2-thioures (पीटीयू) Ringers 24 घंटे के बाद निषेचन (HPF) पर समाधान में रखा जा सकता है। केयर, पीटीयू के साथ लिया जाना चाहिए के रूप में यह विषैला होता है और प्रतिकूल शारीरिक, आनुवंशिक, या रूपात्मक प्रभाव हो सकता है।
    2. एक प्रारंभिक विकास के चरण में पढ़ाई के लिए (<2 DPF), भ्रूण मैन्युअल तेज संदंश का उपयोग Dechorionate। enzymatically अंडे पानी के लिए pronase (2 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने और 28 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए उन्हें incubating द्वारा भ्रूण की बड़ी संख्या Dechorionate।
    3. एक प्लास्टिक पाश्चर विंदुक के माध्यम से समय समय पर भ्रूण दर्रा dechorionation कम करने के लिए। प्रक्रिया समाप्त जब भ्रूण के बहुमत उनके अंडे पानी के साथ कई बार धोने से उनकी chorions से उभरा है।
  4. agarose में zebrafish embedding के लिए समाधान तैयार करें।
    1. 4 जी / एल MS222 जोड़कर एक संज्ञाहरण समाधान तैयार (tricaine शेयर समाधान, पीएच 7.0)अंडे पानी युक्त एक पेट्री डिश के लिए dropwise। 50 मिलीग्राम / एल की एक खुराक एक सिफारिश की प्रारंभिक बिंदु (चित्रा 1 ए) है।
    2. अंडे पानी में - (1.5% 0.8) और 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में यह विभाज्य कम पिघलने agarose के एक शेयर की तैयारी। एक विभाज्य एक पूर्व गर्म गर्मी ब्लॉक में रखें (38 - 40 डिग्री सेल्सियस) और यह सेट के तापमान को संतुलित करते हैं (~ 30 मिनट, चित्रा 1 बी)।
    3. वैकल्पिक: लंबी अवधि के इमेजिंग (> 4 ज) के लिए, 35 मिमी गिलास नीचे पेट्री डिश के भीतर एक छोटे agarose वृत्त तैयार है और यह (पूरक चित्रा 1) स्थापित करने के लिए अनुमति देते हैं।
      नोट: इस अतिरिक्त कदम लंबे समय के तख्ते पर zebrafish के साथ पूरे agarose बूंद के किसी भी आंदोलन से बचने में प्रभावी था।
      1. ऐसा करने के लिए, जगह ~ 300 गिलास नीचे पकवान के इनर सर्कल के साथ agarose की μL बीच में एक छोटी सी उद्घाटन जिसमें मछली के लिए जगह के साथ एक डोनट के आकार का चक्र तैयार करने के लिए (कदम 1.5.3; पूरक चित्रा 1) ।
  5. माइक्रोस्कोपी के लिए agarose में zebrafish माउंट।
    1. 1 का चयन करें - पृथक के लिए पूर्व जांच मछली के 3 और उन्हें स्थानांतरित संज्ञाहरण समाधान के साथ एक डिश में (एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग) द्वारा लार्वा anesthetize (कदम 1.4.1, चित्रा 1C, लगभग 5 मिनट)।
      नोट: मछली anesthetized हैं, जब वे एक उथले opercular आंदोलन और एक कम दिल की दर दिखाने के लिए और अब एक स्पर्श पैदा भागने प्रतिक्रिया प्रदर्शित (Teer; विफलता दूर धीरे बाद तैरना एक ब्रश के साथ उनकी पूंछ को छू के लिए)। मछली की नैतिक इलाज के लिए उचित संज्ञाहरण सुनिश्चित करें और फ्लोरोसेंट प्रकाश में agarose या जोखिम में हस्तांतरण पर हिल को रोकने के लिए।
    2. बाद संज्ञाहरण की पुष्टि की है, एक समायोज्य पिपेट (एक कट ऑफ 200 μL टिप करने के लिए ~ 30 μL सेट के साथ) का उपयोग कर एक लार्वा को चूसना और यह टिप के नीचे डूब करते हैं। साथ तरल पदार्थ की एक बूंद को रिहा द्वारा preheated agarose (कदम 1.4.2) में लार्वा स्थानांतरणagarose में लार्वा (अंडे पानी agarose में जा रहा है की मात्रा को कम करने की कोशिश, चित्रा -1)।
    3. agarose से घिरा हुआ मछली चूसना। इसे जल्दी से बांटना पहले से तैयार गिलास नीचे 35 मिमी डिश में।
    4. पक्ष पर agarose के भीतर पशु की स्थिति के लिए (बाईं ओर सिर) इतना है कि शरीर और पूंछ फ्लैट हैं (चित्रा 1E) एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप और एक मानक पेंट ब्रश (लंबे लाइनर, आकार 1) का प्रयोग करें। कई मछली के साथ काम कर रहे हैं, तो पकवान ताकि वे आसानी से बाद में confocal खुर्दबीन का उपयोग स्थित हैं में सभी मछली संरेखित।
      नोट: जल्दी से स्थिति और संरेखित की इस प्रक्रिया का प्रदर्शन (यह रूप में agarose ठंडा तापमान से संपर्क के बाद तुरंत स्थापित करने के लिए शुरू होता है, कुछ अभ्यास की आवश्यकता हो सकती)।
    5. 10 के लिए agarose एम्बेडेड मछली छोड़ दो - 15 मिनट तक agarose मजबूती से स्थापित है। ध्यान से ~ 2 अंडे के एमएल पानी युक्त tricaine (चित्रा 1F) के साथ 35 मिमी पेट्री डिश ऊपर।

2. confocal खुर्दबीन और इमेजिंग मानकों सेट अप

  1. confocal खुर्दबीन मंच पर एम्बेडेड लार्वा के साथ पेट्री डिश में रखें और जानवर रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय पक्ष पर ध्यान केंद्रित (उज्ज्वल क्षेत्र का उपयोग)। उचित बढ़ाई (40X) और फ्लोरोसेंट सेटिंग के तहत पशु की जांच करने और ब्याज की संरचना कल्पना (जैसे, लेबल न्यूरॉन्स या microglial आंदोलन के प्रतिदीप्ति तीव्रता) की पुष्टि करने के लिए कि सभी इमेजिंग पैरामीटर के रूप में बाद में पृथक (चित्रा 2) के लिए आवश्यक हैं। हम नियमित रूप से हमारे समय व्यतीत हो जाने के अध्ययन प्रदर्शन करने के लिए 40x उद्देश्य का उपयोग करें।
  2. वैकल्पिक: कई घंटे के लिए एक समय चूक अध्ययन करने के लिए, यह सेल और अपने पर्यावरण की बेफिक्र शारीरिक प्रतिक्रिया की स्थापना के लिए पृथक करने के लिए एक या कुछ समय अंक से पहले रिकॉर्ड करने के लिए सलाह दी जाती है (जैसे, microglial आंदोलन आधारभूत गति स्थापित करने के लिए और गतिशीलता)।
  3. संरचना की मोटाई निर्धारितयूवी लेजर पृथक के लिए ब्याज की Ure।
    1. जेड-ड्राइव का प्रयोग, मैन्युअल ऊपर और नीचे ध्यान केंद्रित है और ब्याज की संरचना (जैसे, सेल सोम) के ऊपर और नीचे की पुष्टि करें। नीचे नोट z विमान कि ablated किया जाएगा (जैसे, सेल के बीच में)।
      नोट: अनुभव से, इस विधि रीढ़ की हड्डी न्यूरॉन्स कि चमकीले लेबल थे (एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात है कि पृथक के बाद आसान समय व्यतीत हो जाने के दृश्य की अनुमति देता, जैसे, चित्रा 4) लक्षित करके सबसे प्रभावी था और के बीच ablating से सेल सोम। सेल नाभिक प्रतिदीप्ति सही लक्ष्य-निर्धारण और उच्च दक्षता पृथक आश्वस्त करने के लिए लाभ का हो सकता है।

3. Zebrafish रीढ़ की हड्डी में प्रदर्शन करना लक्षित व्यक्ति की कोशिकाओं के लेजर पृथक

नोट: इस पृथक और दृश्य दृष्टिकोण के लिए, एक confocal खुर्दबीन (Leica SP5) का इस्तेमाल किया गया था। पृथक प्रक्रिया सेल विशिष्ट गंतव्य के लिए एक 405 एनएम डायोड का उपयोग करगड़बड़ाहट सॉफ्टवेयर (Leica अनुप्रयोग सूट, v2.7.3.9723) के अनुसार विस्तृत है। हालांकि, किसी भी पारंपरिक confocal खुर्दबीन है कि एक 405 एनएम लेजर और एक FRAP (photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली) या ब्लीच मॉड्यूल के साथ सुसज्जित है एक ही सेल जोड़तोड़ के प्रदर्शन की अनुमति देगा, लेकिन संभावित थोड़ा अलग सेटिंग्स, मानकों, और नामों के साथ।

  1. सॉफ्टवेयर मेनू (चित्रा 3 ए, 1 और 2) के शीर्ष पर लटकती मेनू पर क्लिक करके FRAP विज़ार्ड प्रारंभ करें। कि लेजर पृथक के लिए विशिष्ट मानकों की स्थापना की अनुमति देता है विभिन्न चरणों के साथ एक नई खिड़की का निरीक्षण करें (चित्रा 3 बी, 3)।
  2. प्रारूप, स्कैन गति (चित्रा 3 बी, 4) का चयन, और औसत से पृथक दृष्टिकोण के लिए छवि मापदंडों का निर्धारण (चित्रा 3 बी, 5)। 400 हर्ट्ज और एक लाइन के स्कैन गति से 1024 x 1024 की एक छवि प्रारूप4 की औसत सबसे लागू किया गया था।
    नोट: आम तौर पर, (जैसे उत्तेजना या उत्सर्जन मानकों के रूप में) वर्णक्रम का पता लगाने को बदलने की कोई जरूरत नहीं है के रूप में वे पिछले अधिग्रहण में निर्धारित किया गया है।
    1. पृथक के लिए z विमान पहले से ही चयनित तो नहीं किया गया है (2.4 चरण में वर्णित है।), "जी" बटन दबाएँ और नमूना के माध्यम से ध्यान केंद्रित जब तक फ्लोरोसेंट संरचना या वांछित z विमान कि ablated किया जा रहा है चर्चा में।
  3. एक बार सामान्य छवि मापदंडों सेट कर रहे हैं, "ब्लीच" चरण (चित्रा -3 सी, 6) विशिष्ट पृथक घटकों को नियंत्रित करने के लिए उपयोग।
    नोट: लेजर तीव्रता का एक संयोजन (चित्रा -3 सी, 8), स्कैन गति, और औसतन कि 3.2 कदम (चित्रा 3 बी, 4 और 5), और साथ ही उस में स्थापित किया जाएगा repetitions की संख्या में स्थापित किया गया है 3.5 चरण (चित्रा 3E,12), रॉय पर यूवी लेजर के समग्र समय ध्यान केन्द्रित विरंजन दक्षता का निर्धारण करेगा, और इसलिए,।
    1. विरंजन प्रक्रिया (चित्रा -3 सी, 8) के लिए यह सक्रिय द्वारा 405 एनएम लेजर संलग्न हैं।
      नोट: - हमारे प्रयोगात्मक सेटअप में 80% ऊपर उल्लिखित सेटिंग्स के साथ सबसे अधिक सफलता 60 के बीच 405 एनएम लेजर तीव्रता के साथ हासिल की थी। ध्यान रखें कि इस लेजर बिजली उत्पादन साधन-विशिष्ट है और हर confocal स्थापना के लिए अलग होगा रहें।
    2. क्षेत्र स्कैन को कम करने, इसलिए समय ध्यान केन्द्रित अधिकतम द्वारा चुने गए रॉय पर ब्लीचिंग तीव्रता अधिकतम करने के लिए विकल्प "में ज़ूम" (चित्रा -3 सी, 7) का प्रयोग करें। वैकल्पिक रूप से, इस प्रक्रिया के लिए पसंद के सॉफ्टवेयर की "ब्लीच बिंदु" विकल्प का उपयोग करें।
  4. छवि अधिग्रहण हवा में ड्राइंग उपकरणों में से किसी का उपयोग करके पृथक के लिए एक या एकाधिक ROIs (चित्रा 3 डी, 10) का चयन करेंओउ (चित्रा 3 डी, 9)। अक्षतंतु पहाड़ी लक्ष्य, उदाहरण के लिए, लगभग 4 के परिपत्र ड्राइंग उपकरण के साथ - 8 माइक्रोन।
    ध्यान दें: पृथक क्षेत्र एक बड़े क्षेत्र के लिए एक एकल पिक्सेल, आवेदन के आधार पर से समायोज्य है।
  5. रॉय की स्थापना के बाद, "टाइम कोर्स" बटन (चित्रा 3E, 11) का चयन करें और चक्र ROIs स्कैन किया जाएगा / ablated (चित्रा 3E, 12) की संख्या की पुष्टि करें। के रूप में विरंजन की प्रक्रिया के बाद बस से पहले और तुरंत पूरी छवि के एक सिंहावलोकन की अनुमति के लिए वांछित "पूर्व ब्लीच" और "बाद ब्लीच" फ्रेम चुनें।
  6. सभी आवश्यक मानकों को पृथक, प्रेस "भागो प्रयोग" (चित्रा 3E, 13) और पृथक की दक्षता की निगरानी की स्थापना के बाद।
    नोट: हमारी FRAP सेटअप में, एक ही छवि से पहले और साथ उचित लेजर ई FRAP चक्र के बाद लिया जाएगाxcitation (जैसे, 488 एनएम EGFP व्यक्त कोशिकाओं के लिए उत्तेजना)। ये पूर्व और बाद पृथक चित्रों कैसे संतोषजनक ढंग रॉय प्रक्षालित किया गया था और कैसे प्रभावी चुना पृथक मापदंडों के थे की एक त्वरित निर्णय अनुमति देते हैं।
  7. लेजर तीव्रता का समायोजन करके प्रक्रिया को दोहराएं (चित्रा -3 सी, 8), स्कैन की गति और औसत (चित्रा 3 बी, 4 और 5), और मामले में repetitions (चित्रा 3E, 12) का चयन किया रॉय अभी भी पूरी होने के बाद उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता से पता चलता है FRAP चक्र।

4. अनुवर्ती प्रक्रिया का प्रदर्शन, मछली सहित "बचाव" या निपटान

  1. अगर प्रयोग टर्मिनल है, tricaine की अधिक मात्रा के साथ पशु euthanize। अंडे पानी निकालें और 10 मिनट के लिए संज्ञाहरण शेयर समाधान के साथ बदलें। इच्छामृत्यु सुनिश्चित करने के लिए, दिल की धड़कन की समाप्ति के लिए खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें।
  2. वैकल्पिक:प्रयोग टर्मिनल नहीं है, तो ठीक संदंश और एक ब्रश के साथ agarose से ध्यान से मछली को हटा दें। ताजा अंडे पानी में मछली की जगह है और इसे 15 मिनट के लिए निगरानी में ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं। सामान्य तैराकी व्यवहार देता है, तो इनक्यूबेटर मछली वापसी।
  3. संस्था की अनुमोदित जीएमओ अपशिष्ट धारा के अनुसार ट्रांसजेनिक जानवरों फेकें।

Representative Results

विधि यहाँ वर्णित zebrafish रीढ़ की हड्डी एक वाणिज्यिक confocal खुर्दबीन के FRAP मॉड्यूल का उपयोग करने में मोटर न्यूरॉन्स की पृथक अनुमति देता है। ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों है कि इस तरह के रूप में विशिष्ट प्रवर्तकों के नियंत्रण में न्यूरॉन्स में एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त - 3mnx1, islet1, या मुलाकात की, इस्तेमाल किया गया। (जैसे -3mnx1 या मुलाकात) GFP की अभिव्यक्ति मोटर न्यूरॉन प्रमोटर द्वारा संचालित सेल निकायों, मुख्य एक्सोन, और (4 चित्र और वीडियो 1) मांसपेशियों के लिए बढ़ा परिधीय शाखाओं के उच्च संकल्प दृश्य की अनुमति देता।

~ 70% एक लेजर शक्ति और सामान्य सेटिंग्स चरण में वर्णित में 80 3. सफल पृथक है - 3 से 5 दिन पुरानी मछली की रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स सफलतापूर्वक 60 वर्ष की एक समग्र ध्यान केन्द्रित करना समय के साथ, ablated कर दिया गया है हासिल की जब प्रतिदीप्ति पृथक के बाद तुरंत fadesऔर कभी नहीं जारी रखता है (चित्रा 5, सी और डी)। अन्य लेजर लाइनों (जैसे 488 एनएम लेजर लाइन के रूप में) के साथ पृथक से प्रयास स्थायी लुप्त होती में परिणाम नहीं था, और प्रतिदीप्ति कम समय फ्रेम के भीतर बहाल किया गया। महत्वपूर्ण बात है, इस तकनीक को इस तरह के Annexin वी की उपस्थिति, somal अध: पतन के अनुरूप रूपात्मक परिवर्तन, और ablated न्यूरॉन 27 की axonal blebbing के रूप में यूवी ablated न्यूरॉन्स में apoptotic कोशिका मृत्यु की विशेषता सुविधाओं, प्रदर्शन किया।

इस दृष्टिकोण की विशिष्टता सेलुलर के संकेत के बिना photoconvertible fluorophore Kaede (जो पराबैंगनी प्रकाश से संपर्क के बाद लाल हरे रंग से अपने उत्सर्जन के लिए स्विच), जहां एक भी निशाना बनाया न्यूरॉन परिवर्तित कर दिया गया (चित्रा 5, ए और बी) का उपयोग करते हुए प्रयोगों में पुष्टि की है कई घंटे से अधिक विनाश। एक उच्च शक्ति लेजर का उपयोग करने के बजाय टी जाता हैओ पृथक साइट (चित्रा 5, सी और डी) के करीब निकटता में कोशिकाओं (~ 20 माइक्रोन) के लक्षित न्यूरॉन (कोई photoconversion या प्रतिदीप्ति की फिर से बाहर निकलना) और photoconversion (मृत्यु के बिना) के विलुप्त होने।

इस लेजर प्रेरित पृथक तकनीक का एक महत्वपूर्ण लाभ यह दृष्टिकोण की खुराक निर्भरता है। अलग अलग तीव्रता के साथ कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए, ठीक ट्यूनिंग की कई परतों लेजर शक्ति का समायोजन करके (चित्रा -3 सी, 8), स्कैन की गति और लाइन औसतन (चित्रा 3 बी, 4 और 5), रॉय के आकार ablated जा करने के लिए उपलब्ध हैं (चित्रा 3 डी, 10), और repetitions (चित्रा 3E, 12)। विशेष रूप से, यह दृष्टिकोण भी बजाय कोशिका मृत्यु उत्प्रेरण के व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए सेलुलर तनाव लागू करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, ठीक ट्यूनिंग कर दिया गया हैकाफी एक न्यूरॉन की मौत के दौरान सेलुलर प्रक्रियाओं का आकलन करने के लिए मूल्यवान। कि कम यूवी लेजर तीव्रता के साथ ablated थे लंबे axonal अनुमानों के साथ मोटर न्यूरॉन्स विशेषता "blebbing" (गठन और सेलुलर पुटिकाओं के विखंडन) है, जो लक्षित सोमा पर शुरू हुई और समय के साथ अक्षतंतु के साथ जारी रखा (40 से पता चला - 90 मिनट, चित्रा 4 ; 3 डी वीडियो 1 में इस पृथक के फिल्म गाया)। नतीजतन, अलग अलग लेजर पृथक मापदंडों और इसलिए प्रेरित सेलुलर तनाव का स्तर और मृत्यु के समय पाठ्यक्रम नियमन शोधकर्ताओं प्रयोगात्मक लचीलेपन का एक उच्च स्तर की अनुमति देता है।

आकृति 1
चित्रा 1: लाइव इमेजिंग के लिए zebrafish के embedding। (वायुसेना) रहते इमेजिंग के लिए प्रक्रिया को एम्बेड: (ए) Tricaine अंडे पानी के लिए zebrafish एक चतनाशून्य में जोड़ा जाता है 50 मिलीग्राम / एल की टा प्रारंभिक खुराक दर। (बी) के कम पिघलने agarose (0.8 - 1.5%) तैयार किया है और 38 को गरम किया जाता है - 40 डिग्री सेल्सियस। (सी) एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करना, जांच की और चयनित zebrafish tricaine समाधान के साथ एक डिश में स्थानांतरित कर रहे हैं। सफल बेहोश करने की क्रिया के बाद, एक मछली preheated agarose (डी) में स्थानांतरित किया है (उथले opercular आंदोलन, हृदय गति, एक स्पर्श पैदा की प्रतिक्रिया की कमी के कारण कम)। अंडे पानी की मात्रा है कि बाद के कमजोर पड़ने को रोकने के लिए agarose में स्थानांतरित कर रहा है कम से कम। (- 50 μL ~ 30) एक गिलास नीचे 35 मिमी पकवान पर zebrafish युक्त (ई) agarose की एक बूंद स्थानांतरण। एक विच्छेदन खुर्दबीन के तहत इस प्रदर्शन और एक ब्रश का उपयोग धीरे अपनी पसंदीदा अभिविन्यास के लिए zebrafish संरेखित करें। 15 मिनट, जब तक agarose सेट है, और पकवान (एफ) को जोड़ने के tricaine समाधान के ~ 2 एमएल - 10 रुको।ANK "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: एक 3 DPF zebrafish की रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स की दृश्य और microglia। Microglia और एक 3 दिन पुरानी ट्रांसजेनिक Zebrafish की रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स के दृश्य व्यक्त (ए) GFP पॉजिटिव न्यूरॉन्स (islet1: GFP) और (बी) mCherry पॉजिटिव microglia (MPEG1: Gal4, यूएएस: mCherry)। (सी) एक साथ उज्ज्वल क्षेत्र छवि के साथ न्यूरॉन और microglia चैनल के समग्र छवि। (सी) में योजनाबद्ध डालने मछली का रुख दर्शाया गया है और प्रस्तुत क्षेत्र की रूपरेखा। स्केल बार = 30 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 3: यूवी लेजर पृथक करने की प्रक्रिया में कदम (प्रोटोकॉल में उल्लिखित के रूप में, चरण 3)। कदम confocal सॉफ्टवेयर (Leica अनुप्रयोग सूट) में FRAP सॉफ्टवेयर मॉड्यूल को नियंत्रित करने के। (ए) यूवी लेजर पृथक प्रदर्शन करने के लिए एक उपकरण के रूप FRAP मॉड्यूल शुरू। (बी) जो लेजर के समय ध्यान केन्द्रित करना तय करेंगे प्रारूप, गति, और औसतन तरह पृथक और अन्य FRAP सेटिंग्स, के लिए z विमान की स्थापना। (सी) लेजर तीव्रता और विकल्प "में ज़ूम" विरंजन क्षमता को अधिकतम करने का नियंत्रण। (डी) ब्याज (आरओआई) के एक या एकाधिक क्षेत्रों के चयन ablated दिया जाएगा। (ई) विरंजन के समय पाठ्यक्रम की स्थापना ब्लीच चक्र और ROIs पर समग्र लेजर ध्यान केन्द्रित करना समय निर्धारित करता है। उसकी क्लिक करें ई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 4
चित्रा 4: एक यूवी ablated न्यूरॉन के अग्रगामी अध: पतन। एक यूवी ablated रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन के neurodegeneration के समय चूक इमेजिंग। (वायुसेना) एक भी रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन की पराबैंगनी विकिरण (मुलाकात: Gal4, यूएएस: EGFP, एक; वृत्त) न्यूरॉन कम होती है और समय के साथ गोलाई (एसी) की सोमा में हुई, axonal विखंडन के द्वारा पीछा (सीएफ, तीर) । Axonal अध: पतन सोमा (पृथक के साइट) पर शुरू किया और अक्षतंतु के बाहर का अंत की ओर अग्रगामी आगे बढ़े जब तक अंत में, सोमा में प्रतिदीप्ति गायब हो गया और पूरे अक्षतंतु "blebbing" (डीएफ) दिखाया। स्केल सलाखों = 20 माइक्रोन। 3 डी गाया इस पृथक के समय चूक फिल्म 1 वीडियो में दिखाया गया है।es / ftp_upload / 54983 / 54983fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: एक मोटर न्यूरॉन में एक photoconvertible fluorophore (Kaede) का उपयोग कर एकल कोशिका पराबैंगनी विकिरण के प्रभाव की पुष्टि। एक न्यूरॉन में photoconvertible fluorophore Kaede के सक्रियण के माध्यम से एकल कोशिका पराबैंगनी विकिरण के मान्यकरण। (ई) Kaede के साथ लेबल न्यूरॉन्स की पराबैंगनी विकिरण। (ए) एक न्यूरॉन (चक्र) 10 एस के लिए 30% की एक लेजर शक्ति के साथ की photoconversion केवल लक्षित व्यक्ति के न्यूरॉन (बी) में Kaede की photoconversion (हरे रंग से लाल करने के लिए) के लिए नेतृत्व किया। ध्यान दें कि परिवर्तित सेल कई घंटे के लिए बच गया है और इस तरह के blebbing के रूप में या गोलाई गिरावट का कोई दृश्य संकेत, पता चला है। एक न्यूरॉन की पृथक (सी ; एक उच्च शक्ति लेजर (10 से 95%) के साथ वृत्त) लगभग 20 माइक्रोन के दायरे में आसपास के न्यूरॉन्स की एक छोटी संख्या में है कि न्यूरॉन (डी के तत्काल लापता होने) और Kaede के बाद photoconversion में हुई। स्केल सलाखों = 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 1
वीडियो 1: यूवी ablated न्यूरॉन 4 चित्र में सचित्र के 3 डी सतह प्रतिपादन (Imaris)।
न्यूरॉन चित्रा 4 में चित्रित के समय चूक वीडियो सतह एक दृश्य सॉफ्टवेयर (Imaris, Bitplane) का उपयोग प्रदान की गई है। यह ablated सोमा के सिकुड़ने की प्रक्रिया, anterogradely सेल के बाहर का अंत की ओर axonal विखंडन के द्वारा पीछा किया पर प्रकाश डाला गया।euron_ablation-3D_rendered.mov "लक्ष्य =" _blank "> इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: लंबे समय इमेजिंग के लिए वैकल्पिक agarose डाली।
लंबी अवधि के अधिग्रहण के दौरान मछली और agarose के आंदोलन से बचने के लिए एक डोनट गिलास नीचे 35 मिमी पकवान (ए) के बीच में किनारों के साथ agarose के आकार का चक्र तैयार करते हैं। ~ के लिए 10 मिनट के agarose सेट करते हैं और agarose (बी) की एक बूंद के साथ इनर सर्कल में मछली स्थानांतरित कर दिया। embedding के लिए agarose की मात्रा को कम (मछली orientating के बाद बाहर करने के लिए अतिरिक्त agarose ब्रश) की कोशिश करें। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

लेजर पृथक दृष्टिकोण

लेजर की मदद से पृथक तकनीक कोशिकाओं के व्यक्तिगत या छोटे समूहों की सटीक लक्ष्य-निर्धारण की अनुमति है। उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी और ऐसे zebrafish के रूप में पशु मॉडल में आनुवंशिक जोड़तोड़ के साथ इस तकनीक का मेल शोधकर्ताओं ने योजनाबद्ध तरीके से एक व्यक्ति के सेल के भाग्य और चोट के बाद बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है।

यूवी (405 एनएम) लेजर पृथक यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल रूपरेखा कैसे व्यक्ति की कोशिकाओं पर जोर दिया जा सकता है या मारे गए चुनिंदा (एक खुराक पर निर्भर ढंग से), न्यूरॉन्स, glia पड़ोसी जबकि, और एक्सोन अहानिकर छोड़ दिया जाता है। हम सफलतापूर्वक सेल संस्कृति प्रयोगों में इस दृष्टिकोण का उपयोग किया और यहां zebrafish रीढ़ की हड्डी के लिए विस्तृत दृष्टिकोण का वर्णन किया है। हम चुनिंदा अन्य कोशिकाओं (चित्रा 5, ए और के एक नेटवर्क के भीतर एक व्यक्ति न्यूरॉन पर बल देते द्वारा zebrafish रीढ़ की हड्डी में इस दृष्टिकोण के कार्यान्वयन दिखाने (चित्रा 5, सी और डी)।

इससे पहले, ऐसी स्पंदित नाइट्रोजन लेजर या दो photon लेजर प्रणाली के रूप में विशेष लेजर प्रणाली, ऊतकों को नुकसान और मोटर तंत्रिका लेनदेनों 10, 11, 12, 13 के लिए प्रेरित करने के लिए आवश्यक थे। ये लेजर प्रणाली सफलतापूर्वक ऐसी धमनियों और नसों में 6 घनास्त्रता, तीव्र गुर्दे की चोट 7, हृदय चोट 8 के रूप में सेल की क्षति, पैदा करने के लिए है, और कैल्शियम लहरों और मस्तिष्क की चोट के बाद 9 microglial प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है। इसके अलावा, Soustelle और उनके सहयोगियों ड्रोसोफिला 14 <उपकला करने और glial कोशिकाओं को नुकसान प्रेरित करने के लिए एक पारंपरिक confocal सेटअप (351 एनएम और 364 एनएम यूवी लेजर) का इस्तेमाल किया/ Sup>।

ए एल एस समझना के लिए Zebrafish मॉडल की प्रासंगिकता (और अन्य मानव रोग)

Zebrafish विशेष रूप से विकास अध्ययन 28, 29, 30 के लिए, एक व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल जीव हैं। वे कुछ सीमाएं हैं, वहीं मानव रोग मॉडल और रोगजनक आणविक तंत्र की समझ देने के लिए उनके संभावित भारी है। Zebrafish मॉडल MND के अध्ययन के लिए अच्छी तरह से स्थापित किया गया है और महत्वपूर्ण आणविक अंतर्दृष्टि 31, 32, 33, 34 के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों तेजी से उत्पन्न किया जा सकता है (4 - 5 माह) और एक विशेष सेल प्रकार, सुविधाओं है कि उन्हें ए एल एस के मौजूदा पशु मॉडल के लिए एक मूल्यवान इसके अतिरिक्त कर के चुनिंदा ट्रैकिंग अनुमति देते हैं। Zebrafish भ्रूण / लार्वा ऑप्टिकली पारदर्शी हैं और अनूठा अनुभव प्रदान करते हैंमानसिक लाभ है कि मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी है, जो आसानी से (या मानव में) कृंतक मॉडल में हासिल नहीं किया जा सकता है में एकल कोशिका के स्तर पर लंबे समय तक रहते इमेजिंग अनुमति देते हैं। जब इस तरह के एकल कोशिका पृथक रूप में आणविक तकनीक के साथ संयुक्त, इस विवो में सटीक आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए एक अनूठा मंच प्रदान करता है प्रयोगात्मक।

मोटर न्यूरॉन्स चुनिंदा यूवी लेजर पृथक का उपयोग लक्षित किया जा सकता

Zebrafish में रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स के जन्म के बाद 10 घंटे के भीतर विकसित करने के लिए शुरू करते हैं और लगभग 48 घंटे के बाद 35, 36 की स्थापना कर रहे हैं। यह तेजी से विकास कम समय फ्रेम में और उच्च throughput के साथ इन न्यूरॉन्स के दृश्य के लिए अनुमति देता है। मोटर न्यूरॉन्स मस्तिष्क और मांसपेशियों के बीच आवश्यक कड़ी प्रदान करते हैं और, ए एल एस में, मोटर प्रांतस्था (ऊपरी मोटर न्यूरॉन्स), मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी (कम मोटर न्यूरॉन्स) में प्रभावित कर रहे हैं। इन न्यूरॉन्स की हानि अनिवार्य रूप से म्यू की ओर जाता हैscle शोष और कमजोरी। Zebrafish की रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन्स उनके अलग अनुमानों से और -3MNX1 की तरह मोटर न्यूरॉन विशिष्ट प्रमोटरों के उपयोग से पहचाना जा सकता है। इस तरह पेश न्यूरॉन्स की सेल सोम लक्ष्य निर्धारण समय (चित्रा 4 और वीडियो 1) पर axonal प्रक्षेपण के साथ अग्रगामी अध: पतन का पता चला। रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन्स की एकल कोशिका संकल्प इमेजिंग अतिरिक्त लेजर पृथक (चित्रा 4 और संदर्भ 27 में पूरक वीडियो 3 देखें) के बाद phosphatidylserine स्थानान्तरण और फलस्वरूप Annexin वी लेबलिंग की पुष्टि की। हालांकि हम अपनी यूवी लेजर पृथक दृष्टिकोण के बाद न्यूरॉन्स मरने में Annexin वी के सक्रियण की रिपोर्ट है, हम निश्चित है कि मौत का झरना है कि इस त्वरित प्रक्रिया के दौरान शुरू हो रहा है वास्तव में neuronal मौत कि neurodegeneration या सामान्य सेल homeostasis के दौरान होता है मैच नहीं हो सकता है।

हालांकि इस पृथक दृष्टिकोण अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैऔर विशिष्ट, विभिन्न रणनीतियों एम्बेडिंग भी यूवी पृथक की क्षमता को प्रभावित कर सकता है। हमारे अनुभव में, यह सबसे agarose हम में हमारे मछली एम्बेडेड की परत को कम करने में सफल रहा था। अंडे पानी के एक अतिरिक्त परत के साथ मध्यम embedding क्षीणन और बिखरने प्रभाव है कि होने के कारण अंतत: सेल द्वारा प्राप्त यूवी शक्ति को कम कर सकते हैं की परतों मोटा किरण मार्ग के किनारे।

भविष्य में, अलग-अलग ट्रांसजेनिक मछली लाइनों के पार (12 घंटे तक) इस तरह के glia के रूप में अन्य प्रभावित कोशिकाओं, की प्रतिक्रियाएं, लेजर प्रेरित सेल विनाश करने के लिए तत्काल और अल्पकालिक के दृश्य के लिए अनुमति देगा। उदाहरण के लिए, astrocyte और इस तरह के ए एल एस के रूप में neurodegenerative विकारों में गैर सेल स्वायत्त विषाक्तता अनुसंधान सुर्खियों में रहे हैं और भारी छिटपुट और पारिवारिक ए एल एस 37, 38 की pathogenicity में फंसा रहे हैं। हालांकि, तंत्र glial विषाक्तता और चयनात्मकता अंतर्निहितमोटर की ओर न्यूरॉन्स अस्पष्ट रहते हैं। हम और दूसरों को हाल ही में microglia द्वारा न्यूरॉन्स मरने का घिराव अध्ययन करने के लिए इस दृष्टिकोण का फायदा उठाया और न्यूरोनल अवशेष 27, 39, 40 की निकासी कल्पना।

उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी और neuroinflammation के लिए मार्कर के साथ पृथक तकनीक का मेल भविष्य में शोधकर्ताओं ने एकल कोशिका समारोह और परस्पर सेल प्रणाली की समझ का विस्तार करने की अनुमति देगा। एक विवो सेटिंग में इन प्रक्रियाओं की विशेषता विकासात्मक सेटिंग्स में बल्कि MND, जहां सेलुलर बातचीत 3 प्रभावित हो सकता है, 41 सहित neurodegenerative रोगों के मॉडल में न केवल महत्वपूर्ण है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose low melting Fisher-Scientific Dissolve in egg water with tricaine (0.02%) at 0.8 - 1.5%
Tricaine Argent Labs MS-222 0.02%
Harvard standard wall Borosilicate with filament Capillary Glass World Precision Instruments, Inc. GC100F-10 (short)
GC100F-15 (long)		 Pull to a resistance of 2 - 7 MΩ
Egg water  0.6 g Instant Ocean sea salt, 4 mL of 1 mg/mL methylene blue in 10 L deionized water
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P7629
Pronase Sigma 10165921001
Heat block Select BioProducts Digital block heater (SBD110_)
Microinjection apparatus World Precision Instruments, Inc. Microinjection was performed by hand under a steromicroscope (Leica) with a loaded glass needle and a Picospritzer II (General Valve corporation)
Stereoscope Leica Bright field illumination microscopy was performed on a Leica M165FC stereo dissection microscope (Leica)
Microscope Leica  SP5
35 mm glass bottom dish MatTek Corporation P35G-0-20-C

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 120 यूवी लेजर पृथक कोशिका मृत्यु सेल तनाव zebrafish microglia 405 एनएम MND ए एल एस confocal
ट्रिगर सेल तनाव और मौत पारंपरिक यूवी लेजर confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग
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Morsch, M., Radford, R. A. W., Don,… More

Morsch, M., Radford, R. A. W., Don, E. K., Lee, A., Hortle, E., Cole, N. J., Chung, R. S. Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (120), e54983, doi:10.3791/54983 (2017).

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