Introduction
Fluorescensmikroskopi har länge använts för att studera effekterna av transgener i zebrafisk CNS, särskilt deras effekter på utvecklingen 1. Högupplöst mikroskopi har gjort en detaljerad kartläggning av de cellulära processer i hjärnans utveckling, muskel generation, och många andra utvecklings evenemang 2. Studera död en enskild cell har varit mer utmanande, främst på grund av de tekniska svårigheterna att inducera selektiv celldöd under normal avbildningsförfaranden. Kombinationen av encelliga upplösning avbildning och välriktade ablation tekniker gör det möjligt att utreda omedelbara cellulära svar på stress och skador, liksom de därav följande cell-cell interaktioner. Att förstå dessa processer är kritisk, särskilt för neurodegenerativa sjukdomar såsom motorneuronsjukdom (MND), där neuron-Glia interaktioner har visat sig bidra till utvecklingenav sjukdomen 3.
MND, eller amyotrofisk lateralskleros (ALS), är en förödande neurodegenerativ sjukdom som påverkar motoriska neuroner i hjärnstammen, motoriska cortex och ryggmärgen. Förlust av dessa neuroner leder till muskel förlust, och patienter dör inom 3 - 5 år efter diagnos 4. Motoriska nervceller i ryggmärgen länk till muskelfibrer och spelar en viktig roll när det gäller att underlätta muskelsammandragning. Fel i detta meddelande eller död av dessa nervceller gradvis försvagar musklerna och påverkar patientens förmåga att svälja, gå, tala och andas. Visualisera döden av en motorneuron och de kortsiktiga konsekvenser i ett levande djur ger ett utmärkt tillfälle att bättre förstå de dynamiska processer som ingår i normal cell homeostas och sjukdom.
Zebrafisk har dykt upp som en attraktiv modell för att studera neurodegenerativa sjukdomar 1. Dettaberor på de fördelar som denna modellorganism, såsom yttre befruktning, kort utvecklings tid, optisk access till nervsystemet och enkel genmodifiering. Dessutom, förmågan att enkelt generera föreningen transgen zebrafisk möjliggör multipla märkningsstrategier olika celltyper. Genetisk ablation metoder för att döda specifika celltyper tillåter ganska bred störning, men saknar den fina kontroll av inrikta sig på enskilda celler 5. Laserassisterade tekniker, å andra sidan, ge fina temporal och spatial kontroll och har använts för olika djurmodeller. Medan de flesta metoder använder specialutrustning, såsom pulsad laser 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 eller två-photon uppställningar 13, andraforskargrupper har nyligen dragit nytta av en UV-laser i konventionella konfokala mikroskop 14.
Den teknik som beskrivs här kombinerar hög upplösning konfokalmikroskopi med en UV-laser-medierad metod för att orsaka cellulär stress eller död i ett dosberoende sätt i valda motomeuroner. Det bygger på användning av den allmänt installerat 405-nm laser, har testats med framgång i cellodling och i levande djur, och gör det möjligt att detalj karakterisering av cellulära interaktioner, såsom microglial clearance efter nervcellsdöd.
Protocol
OBS: Design, uppförande och rapportering av djurförsök måste ta hänsyn till gällande riktlinjer 15. Sådant arbete måste godkännas i förväg av den lokala djurskyddsmyndigheten (i vårt fall, Animal etikkommitté Macquarie University).
1. Förbered zebrafisk för montering och UV-cell Ablation
- Generera zebrafisk (Danio rerio) som uttrycker fluorescerande proteiner.
- För att uttrycka fluorescerande proteiner av intresse i zebrafisk, utföra plasmiden injektioner i en cell skede av zebrafisk ägg (som beskrivs på annat håll 16) eller använd fluorescerande transgena linjerna. Att märka flera celltyper, skapa sammansatta transgena zebrafisk linjer genom att korsa etablerade transgena linjer som är relevanta för frågan om intresse. Placera en hane och en hona zebrafisk på vardera sidan av en falsk botten par parning tank på kvällen och ta bort avdelaren med uppkomsten av ljusnästa morgon (som beskrivs på annat håll 17). Håll zebrafisk vid 28 ° C och hantera dem i enlighet med de fastställda protokoll 17, 18.
- Samla embryon efter en lyckad lek genom ansträngande tanken vatten som innehåller embryon genom en plast tesil. Skölj äggen med systemvattnet och överföra dem till ägget vatten i en petriskål.
- Undersök dem under ett ljusmikroskop för att bestämma befruktning. Store befruktade ägg i en petriskål och placera dem i en inkubator vid 28 ° C 18.
- Valfritt: Utför en mikroinjektion för att märka specifika cellpopulationer.
OBS: Detta är en alternativ metod som gör det möjligt att uttryck och visualisering av proteiner, utan behovet av att höja stabila transgena linjerna. Denna metod är också fördelaktigt när proteinet av intresse är giftigt och förbjuder genereringen av en stabil transgena linjer.- Injicera plasmidkonstruktioner in i en-cellstadiet av zebrafiskembryon, såsom beskrivs på annan plats 19, 20, 21.
OBS: Denna metod resulterar i mosaiken expression av proteinet av intresse. Proteinet av intresse drivs från en promotor val (t.ex. islet1 22 -3mnx1 23, 24, träffade 25, eller MPEG1 26) flankerad av Tol2 inverterade upprepningar 20.
- Injicera plasmidkonstruktioner in i en-cellstadiet av zebrafiskembryon, såsom beskrivs på annan plats 19, 20, 21.
- Åldras fisken till den önskade storleken.
- Höj fisken till 3-5 dagar efter befruktningen (DPF) och placera dem under ett fluorescerande mikroskop. Sikta de djur för lämplig fluorofor uttryck och välj ljust märkt fisk. Separera lämplig larver i en annan skål med ägg vatten för inbäddning sentr på (butik i en 28 ° C inkubator).
Valfria: Embryon kan placeras i en 0,2 mM 1-fenyl-2-thioures (PTU) Ringers lösning vid 24 h efter befruktning (HPF) för att hämma bildningen av pigmentering. Man måste vara försiktig med PTU, eftersom det är giftigt och kan ha negativa fysiologiska, genetiska, eller morfologiska effekter. - För studier i ett tidigt utvecklingsstadium (<2 dpf), dechorionate embryona manuellt med vassa pincett. Dechorionate stort antal embryon enzymatiskt genom tillsats av pronas (2 mg / ml) till ägget vatten och inkubera dem i 10 min vid 28 ° C.
- Passera embryona med jämna mellanrum genom en plast pasteurpipett för att underlätta dechorionation. Avsluta processen när majoriteten av embryona har kommit fram ur chorions genom att tvätta dem flera gånger med ägg vatten.
- Höj fisken till 3-5 dagar efter befruktningen (DPF) och placera dem under ett fluorescerande mikroskop. Sikta de djur för lämplig fluorofor uttryck och välj ljust märkt fisk. Separera lämplig larver i en annan skål med ägg vatten för inbäddning sentr på (butik i en 28 ° C inkubator).
- Bered lösningar för zebrafisk inbäddning i agaros.
- Förbereda en anestesilösning genom att tillsätta 4 g / L MS222 (tricaine stamlösning, pH 7,0)droppvis till en petriskål med ägg vatten. En dos av 50 mg / L är ett rekommenderat startpunkt (Figur 1A).
- Förbered ett lager av lågsmältande agaros (0,8-1,5%) i ägg vatten och delprov den i 1,5-ml mikrocentrifugrör. Placeras en alikvot i en förvärmd värmeblock (38-40 ° C) och låt den jämvikt till den inställda temperaturen (~ 30 min; Figur 1B).
- Valfritt: För längre sikt imaging (> 4 h), förbereda en liten agaros cirkel inom 35 mm glasbotten petriskål och låt det att ställa in (Kompletterande Figur 1).
OBS: Denna extra steg var effektiv i att undvika varje förflyttning av hela agarosen droppe med zebrafisk över längre tidsramar.- För att göra detta, att placera ~ 300 mikroliter av agaros längs den inre cirkeln av glas nedre skålen förbereda en donut-formad cirkel med en liten öppning i mitten där du vill placera fisken (steg 1.5.3, Kompletterande Figur 1) .
- Montera zebrafisk i agaros för mikroskopi.
- Välj 1-3 av pre-screening fisk för ablation och söva larver genom att överföra dem (med hjälp av en pipett) i en skål med anestesi lösning (steg 1.4.1, Figur 1C, ca 5 min).
OBS: Fisken bedövas när de visar en ytlig opercular rörelse och en minskad hjärtfrekvens och inte längre visa en touch-framkallade flyktsvar (TEER, underlåtenhet att simma iväg bollen efter försiktigt vidröra sin svans med en borste). Säkerställa en lämplig anestesi för etisk behandling av fisken och för att förhindra ryckningar vid överföring till agaros eller exponering för fluorescerande ljus. - Efter anestesi bekräftas, suga upp en larv med användning av en justerbar pipett (med en cut-off 200-mikroliter spets satt till ~ 30 | il) och låt den sjunka till botten av spetsen. Överför larven i förvärmd agaros (steg 1.4.2) genom att släppa en droppe av vätskan medlarv i agarosen (försök att minimera mängden ägg vatten går in i agaros, Figur 1D).
- Suga upp fisken omgiven av agaros. Fördela det snabbt i den tidigare beredda glasbotten 35-mm skål.
- Använd en dissektion mikroskop och en vanlig pensel (lång liner, storlek 1) att placera djuret i agarosen på sidan (huvud till vänster) så att kropp och svans är platta (Figur 1E). Om man arbetar med flera fisk, rikta all fisk i skålen så att de är lätt att hitta med hjälp av konfokalmikroskop senare.
OBS: Snabbt utföra denna procedur för positionering och inriktning (det kan kräva lite övning, som agarosen börjar genast efter exponering för kallare temperaturer). - Låt agaros-inbäddade fisk för 10-15 min tills agarosen är inställd ordentligt. Noggrant fylla på 35-mm petriskål med ~ 2 ml ägg vatten innehållande tricaine (figur 1F).
- Välj 1-3 av pre-screening fisk för ablation och söva larver genom att överföra dem (med hjälp av en pipett) i en skål med anestesi lösning (steg 1.4.1, Figur 1C, ca 5 min).
2. Ställ in konfokalmikroskop och Imaging parametrar
- Placera petriskål med den inbäddade larven på konfokalmikroskop scenen och fokusera på ryggsidan av djuret ryggmärgen (med ljusa fält). Undersök djuret under lämplig förstoring (40X) och fluorescerande inställning och visualisera strukturen av intresse (t.ex. fluorescensintensiteten hos de märkta nervceller eller microglial rörelse) för att bekräfta att alla imaging parametrar som behövs för efterföljande ablation (Figur 2). Vi använder rutinmässigt 40X mål att utföra vår tid förfaller studier.
- Valfritt: Om du vill utföra en time-lapse studie i flera timmar, är det lämpligt att spela in en enda eller ett fåtal tidpunkter före ablation att etablera ostörda fysiologiska responsen av cellen och dess omgivning (t.ex. microglial rörelse för att etablera baslinje hastighet och rörlighet).
- Bestämma tjockleken av structure av intresse för UV-laser ablation.
- Använda Z-Drive, kontrollera toppen och botten av strukturen av intresse (t.ex. cell soma) genom att manuellt fokus upp och ner. Anteckna z-planet som skall avlägsnas (t ex i mitten av cellen).
OBS: Av erfarenhet, denna metod var mest effektiva genom att rikta ryggmärgs nervceller som ljust märkta (en hög signal-brusförhållande som möjliggör enkel tidsförlopp visualisering efter ablation, t.ex., figur 4) och genom ablation i mitten av cell soma. Cellkärnan fluorescens kan vara en fördel för att säkerställa korrekt inriktning och hög ablation effektivitet.
- Använda Z-Drive, kontrollera toppen och botten av strukturen av intresse (t.ex. cell soma) genom att manuellt fokus upp och ner. Anteckna z-planet som skall avlägsnas (t ex i mitten av cellen).
3. Utför Riktade Laser Ablation av enskilda celler i zebrafisk Spinal Cord
OBS: För denna ablation och visualisering tillvägagångssätt var en konfokalmikroskop (Leica SP5) används. Ablationsproceduren med hjälp av en 405-nm diod för cellspecifika destBRÅK specificeras beroende på mjukvaran (Leica Application Suite, v2.7.3.9723). Dock kommer någon konventionell konfokalmikroskop som är utrustad med en 405 nm laser och en FRAP (fluorescens återhämtning efter fotoblekning) eller blekmedel modul tillåter utförandet av samma cell manipulationer, men potentiellt med något olika inställningar, parametrar och namn.
- Starta FRAP guiden genom att klicka på rullgardinsmenyn längst upp i programmenyn (Figur 3A, ett och två). Observera ett nytt fönster med olika steg som gör att inrättandet av de specifika parametrarna för laser ablation (Figur 3B, 3).
- Bestäm bildparametrar för ablation strategi genom att välja format, skanningshastighet (Figur 3B, 4), och i genomsnitt (figur 3B, 5). Ett bildformat av 1024 x 1024 vid en skanningshastighet på 400 Hz och en linjegenomsnitt av fyra var mest tillämplig.
OBS: Det finns i allmänhet ingen anledning att ändra den spektrala upptäckt (såsom excitation eller utsläppsparametrar), såsom de har fastställts i det tidigare förvärvet.- Om z-planet för ablation inte har redan valts (som beskrivs i steg 2,4.) Genom att trycka på "Live" och fokusera genom provet tills den fluorescerande struktur eller önskade z-plan som kommer som skall avlägsnas är i fokus.
- När den allmänna bildparametrar ställs in, få tillgång till "Bleach" steg (figur 3C, 6) för att styra specifika ablation komponenter.
ANMÄRKNING: En kombination av laserintensiteten (figur 3C, 8), skanningshastigheten och medelvärdes som har ställts in i steg 3,2 (Figur 3B, 4 och 5), liksom antalet upprepningar som kommer att ställas in i steg 3,5 (Figur 3E,12), kommer att avgöra den totala uppehållstiden för UV-laser vid ROI, och därför, blekningseffektiviteten.- Koppla in 405 nm lasern genom att aktivera det för blekningsförfarandet (figur 3C, 8).
OBS: De flesta framgång med ovannämnda inställningar uppnåddes med 405 nm laser intensiteter mellan 60 - 80% i vår experimentuppställning. Var medveten om att denna laser uteffekt är instrumentspecifika och kommer att skilja sig för varje konfokala setup. - Använd "zooma in" alternativet (Figur 3C, 7) för att maximera blekintensitet vid den valda ROI genom att minska scanningsfältet, därför maximera uppehållstiden. Alternativt kan du använda "Bleach punkten" alternativet av mjukvaran val för denna process.
- Koppla in 405 nm lasern genom att aktivera det för blekningsförfarandet (figur 3C, 8).
- Markera en eller flera ROI (Figur 3D, 10) för ablation genom att använda något av ritverktygen i bilden förvärvet vindow (Figur 3D, 9). Rikta den axonkägla, till exempel, med den cirkulära ritverktyget av ca 4-8 | j, m.
OBS! Ablation området är justerbar från en enda pixel till ett större område, beroende på applikation. - Efter upprättandet av ROI, välj "Time Course" -knappen (Figur 3E, 11) och bekräfta antalet cykler ROI kommer att skannas / ablation (Figur 3E, 12). Välja "Pre-Bleach" och "Post-Bleach" ramar såsom önskas för att möjliggöra en översikt över hela bilden strax före och omedelbart efter blekningsprocessen.
- Efter att ha konstaterat alla nödvändiga ablation parametrar trycker "Kör Experiment" (Figur 3E, 13) och övervaka effektivitet ablation.
OBS: I vår FRAP inställning, en enda bild kommer att tas före och efter FRAP cykeln med lämplig laser excitation (t.ex. 488 nm excitation för EGFP-uttryckande celler). Dessa pre- och post ablation bilder möjliggöra en snabb bedömning av hur tillfredsställande ROI blektes och hur effektivt de valda ablation parametrar var. - Upprepa processen genom att justera laserintensiteten (figur 3C, 8), skanningshastighet och medelvärdes (Figur 3B, 4 och 5), och upprepningar (figur 3E, 12) i det fall den valda ROI visar fortfarande hög fluorescensintensitet efter avslutad FRAP cykel.
4. Utför uppföljningsförfarande, inklusive fisk "Rescue" eller kassering
- Om experimentet är terminalen, avliva djuret med en överdos av tricaine. Ta bort ägg vatten och ersätta den med anestesi stamlösning under 10 minuter. För att säkerställa dödshjälp, kolla under mikroskop för upphörande av hjärtslag.
- Frivillig:Om experimentet är inte terminalen, ta bort fisken försiktigt från agarosen med fin pincett och en borste. Placera fisken med färskt ägg vatten och låt det att återhämta sig under observation i 15 min. Om normal simbeteende återgår, återgår fisken till inkubatorn.
- Avyttra transgena djur enligt institutets godkända GMO avfallet.
Representative Results
Den här beskrivna metoden gör det möjligt att ablation av motoriska nervceller i den zebrafisk ryggmärgen med användning av FRAP modulen av en kommersiell konfokalmikroskop. Transgena zebrafisklinjer som uttrycker ett grönt fluorescerande protein i neuroner under kontroll av specifika promotorer, såsom - 3mnx1, islet1, eller Met, användes. Uttrycket av GFP drivs av motorn neuron-promotorn (såsom -3mnx1 eller träffade) medger hög upplösning visualisering av cellkroppar, de huvudsakliga axoner, och de perifera grenar som sträcker sig till musklerna (Figur 4 och Video 1).
Nervceller i ryggmärgen av 3- till 5 dagar gammal fisk har framgångsrikt ablation, med en total uppehållstid av 60 - 80 s vid en lasereffekt av ~ 70% och de allmänna inställningar som beskrivs i steg 3. Framgångsrik ablation är uppnås när fluorescensen bleknar omedelbart efter ablationoch aldrig återupptar (Figur 5, C och D). Försök till ablation med andra laserlinjer (t.ex. 488 nm laserlinjen) inte leda till permanent blekning, och fluorescens återställdes inom korta tidsramar. Viktigt är denna teknik visade kännetecknen för apoptotisk celldöd i UV-ablation neuroner, såsom förekomsten av Annexin V, konsekventa morfologiska förändringar av Somal degeneration och axonal blåsbildning av avlägsnad neuron 27.
Specificiteten av denna strategi bekräftas i försöken att använda photoconvertible fluoroforen Kaede (som växlar dess utsläpp från grönt till rött efter exponering för UV-ljus), där en enda riktad neuron omvandlades (Figur 5, A och B) utan tecken på cellulär förstörelse under flera timmar. Användning av en högre lasereffekt leder istället to utrotning av de riktade neuron (ingen photoconversion eller återuppträdande av fluorescens) och fotoomvandling (utan död) av cellerna i omedelbar närhet (~ 20 | im) och ablation stället (figur 5, C och D).
En viktig fördel med denna laser-inducerad ablation teknik är dosberoende av inflygningen. Till målceller med olika intensitet, flera skikt av finjustering finns genom att justera lasereffekten (figur 3C, 8), skanningshastighet och linjemedelvärdes (Figur 3B, 4 och 5), storleken på ROI som skall avlägsnas (Figur 3D, 10), och upprepningar (Figur 3E, 12). Notably, kan också utnyttjas denna metod för att tillämpa cellulär stress till individuella celler i stället för att inducera celldöd. Till exempel har finjustering varitganska värdefullt att bedöma cellulära processer under död av en neuron. Motoriska nervceller med långa axonala projektioner som vävnad avlägsnats med lägre UV-laser intensiteter visade karakteristiska "blåsbildning" (bildning och fragmentering av cell vesiklar), som inleddes i riktade soma och fortsatte längs axonet över tid (40-90 min; Figur 4 , 3D-renderade film av detta ablation i Video 1). Följaktligen modulering av olika laserablation parametrar och därmed nivån av inducerad cellulär stress och tidsförloppet för döden ger forskarna en hög nivå av experimentell flexibilitet.
Figur 1: inbäddning av zebrafisk för levande avbildning. (AF) Bädda förfarande för levande avbildning: (A) Tricaine tillsätts ägg vatten att bedöva zebrafisk en TA startdos hastighet av 50 mg / L. (B) lågsmältande agaros (0,8-1,5%) bereds och värms upp till 38-40 ° C. (C) med hjälp av en pipett, är det avskärmade och utvalda zebrafisk överförs till en skål med tricaine lösning. Efter framgångsrik sedering (grunt opercular rörelse, minskad hjärtfrekvens, brist på en touch-evoked respons), en fisk överförs till den förvärmda agaros (D). Minimera mängden ägg vatten som överförs i agarosen att förhindra efterföljande utspädning. (E) Ta en droppe agaros (~ 30-50 mikroliter) innehåller zebrafisk på en glasbotten 35-mm skål. Utför detta under en dissektion mikroskop och använda en borste för att försiktigt anpassa zebrafisk till dess föredragna orientering. Vänta 10-15 minuter, tills agarosen är inställd, och lägga till ~ 2 ml tricaine lösning på skålen (F).ank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Visualisering av neuroner och mikroglia i ryggmärgen av en 3-DPF zebrafisk. Visualisering av mikroglia och neuroner i ryggmärgen av en 3 dagar gammal transgen zebrafisk som uttrycker (A) GFP-positiva neuroner (islet1: GFP) och (B) mCherry-positiva mikroglia (MPEG1: GAL4, UAS: mCherry). (C) Sammansatt bild av neuron och mikroglia kanal tillsammans med den ljusa fält bild. Den schematiska insatsen i (C) visar den orientering av fisken och skisserar det presenterade området. Skalstreck = 30 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Steg i processen av UV-laser ablation (som beskrivs i protokollet, steg 3). Åtgärder för att kontrollera FRAP programmodul i konfokala programvaran (Leica Application Suite). (A) Start FRAP modulen som ett verktyg för att utföra UV-laser ablation. (B) Ställa in z-planet för ablation och andra FRAP inställningar som format, hastighet och medelvärdes, som kommer att avgöra uppehållstid av lasern. (C) Kontroll av laserintensiteten och "zooma in" för att maximera blekningseffektiviteten. (D) Selektion av en eller flera regioner av intresse (ROI) som kommer att avlägsnas. (E) Ställa tidsförloppet för blekning bestämmer blekningscykler och den totala tiden laser uppehållstid på ROI. Klicka henne e för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Antero degeneration av en UV-avlägsnade neuron. Time-lapse avbildning av neurodegeneration av en UV-borttagen spinal neuron. (AF) UV-bestrålning av en enda spinal neuron (uppfyllda: GAL4, UAS: EGFP, A, cirkel) resulterade i soma av neuron krymper och avrundning upp över tiden (AC), följt av axonal fragmentering (CF, pilspetsar) . Axonal degeneration började vid soma (platsen för ablation) och fortskred antero mot den distala änden av axonet tills slutligen, den fluorescens i soma försvunnit och hela axon visade "blebbing" (DF). Skalstrecken = 20 | im. 3D-renderade time-lapse film av detta ablation visas i Video 1.es / ftp_upload / 54.983 / 54983fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Bekräftelse av effekten av encelliga UV-bestrålning med användning av en photoconvertible fluorofor (Kaede) i en motorneuron. Validering av encelliga UV-bestrålning genom aktivering av photoconvertible fluoroforen Kaede i en neuron. (AD) UV-bestrålning av neuroner märkta med Kaede. (A) Photoconversion av en enda neuron (cirkel) med en lasereffekt av 30% under 10 s ledde till photoconversion av Kaede (från grönt till rött) i endast den riktade enskilda neuron (B). Observera att de konverterade cellen överlevde under flera timmar och visade inga synliga tecken på försämring, såsom blåsbildning eller avrundning. Ablation av en enda neuron (C ; cirkel) med en högre lasereffekt (95% i 10 s) resulterade i omedelbar försvinnandet av detta neuron (D) och efterföljande fotoomvandling av Kaede i ett litet antal omgivande neuroner inom en radie av ca 20 ^ m. Skalstrecken = 20 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: 3D-yta rendering (Imaris) av UV ablation neuron visas i figur 4.
Time-lapse video av neuron visas i figur 4 är ytan återges med hjälp av ett visualiseringsprogram (Imaris, Bitplane). Det framhävs att krympningsprocessen av ablationsbehandlade soma, följt av axonal fragmentering anterogradely mot den distala änden av cellen.euron_ablation-3D_rendered.mov "target =" _ blank "> Klicka här för att ladda ner filen.
Kompletterande Figur 1: Valfri agaros rösterna för lång tid avbildning.
För att undvika förflyttning av fisken och agarosen under långtids förvärv förbereda en donut formad cirkel av agaros längs kanterna i mitten av glasbotten 35 mm skål (A). Låt agarosen uppsättning för ~ 10 minuter och överfördes fisk i den inre cirkeln med en droppe agaros (B). Försök att minimera mängden agaros för inbäddning (borsta överskott agaros till utsidan efter orientering av fisk). Klicka här för att ladda ner filen.
Discussion
Laserablation Approaches
Laser-assisted ablation tekniker möjliggör exakt inriktning av enskilda eller små grupper av celler. Kombinera denna teknik med hög upplösning mikroskopi och genetiska manipulationer i djurmodeller såsom zebrafisk tillåter forskare att systematiskt undersöka ödet för en enskild cell och samspelet efter skada.
UV (405 nm) laserablation Protokollet som beskrivs här beskrivs hur enskilda celler kan understrykas eller dödas selektivt (i en dosberoende sätt), medan grann neuroner, glia och axoner lämnas oskadda. Vi har framgångsrikt utnyttjat denna metod i cellodlingsexperiment och beskriver här detaljerad strategi för zebrafisk ryggmärgen. Vi visar genomförandet av denna strategi i zebrafisk ryggmärgen genom att selektivt betona en enskild neuron i ett nätverk av andra celler (Figur 5, A och
Tidigare, specialiserade lasersystem, såsom pulsad-kvävelaser eller två-fotonlasersystem, erfordrades för att inducera vävnadsskada och motorisk nerv transections 10, 11, 12, 13. Dessa lasersystem har framgångsrikt används för att orsaka cellskada, såsom trombos i artärer och vener 6, akut njursvikt 7, hjärtskada 8 och studera kalciumvågor och microglial svar efter hjärnskada 9. Dessutom Soustelle och kollegor använde en konventionell konfokala setup (351 nm och 364 nm UV-lasrar) för att inducera skador på epitel- och gliaceller i Drosophila 14 </ Sup>.
Betydelsen av Zebrafish modeller för att förstå ALS (och andra sjukdomar hos människor)
Zebrafisk är ett vanligt modellorganism, särskilt för utvecklingsstudier 28, 29, 30. Medan de har vissa begränsningar, är deras potential att modellera sjukdomar hos människan och ge en förståelse för patogena molekylära mekanismer enorm. Zebrafisk modeller har väletablerad för studier av MND och har lett till viktiga molekylära insikter 31, 32, 33, 34. Transgena zebrafisk linjer kan snabbt genereras (4 - 5 månader) och låt den selektiva spårning av en viss celltyp, egenskaper som gör dem ett värdefullt tillskott till nuvarande djurmodeller av ALS. Zebrafisk embryon / larver är optiskt transparenta och erbjuder unika erfamentala fördelar som tillåter långtids levande-imaging vid encelliga nivå i hjärnan eller ryggmärgen, som inte lätt kan uppnås i gnagarmodeller (eller hos människa). När de kombineras med molekylära tekniker, såsom encelliga ablation, ger detta en unik experimentplattform för att studera exakta molekylära mekanismer in vivo.
Motomeuroner kan selektivt riktad Använda UV Laser Ablation
Spinal nervceller i zebrafisk börjar utvecklas inom 10 timmar efter födseln och är etablerade efter ca 48 h 35, 36. Den snabba utvecklingen gör visualisering av dessa neuroner i korta tidsramar och med hög genomströmning. Motoriska nervceller ge den viktigaste länken mellan hjärnan och musklerna och i ALS, påverkas i motor cortex (övre motoriska nervceller), hjärnstammen och ryggmärgen (lägre motoriska nervceller). Förlust av dessa neuroner leder oundvikligen till muscle atrofi och svaghet. Motoriska nervceller i ryggmärgen hos zebrafisk kan identifieras genom sina olika prognoser och genom användning av motorneuronspecifika promotorer som -3MNX1. Inriktning cell soma sådana utskjutande nervceller avslöjade antero degeneration längs axonal projektion över tiden (Figur 4 och Video 1). Encelliga upplösning avbildning av spinal motoriska nervceller dessutom bekräftat fosfatidylserin translokation och åtföljande Annexin V-märkning efter laserablation (se figur 4 och kompletterande Video 3 i Reference 27). Även om vi rapporterar aktiveringen av Annexin V i döende nervceller efter vår UV-laser ablation tillvägagångssätt, kan vi inte vara säkra på att den kaskad av död som utlöses under denna påskyndade processen exakt matchar nervcellsdöd som inträffar under neurodegeneration eller normal cell homeostas.
Medan denna ablation tillvägagångssätt är mycket reproducerbaroch specifika, olika inbäddningsrestriktioner strategier kan också påverka effektiviteten av UV ablation. I vår erfarenhet var det mest framgångsrika för att minimera lager av agaros vi inbäddade vår fisk i. Tjockare skikt av inbäddningsmedium med ett extra lager av ägg vatten kan minska UV kraften slutligen mottas av cellen på grund av dämpning och spridnings effekter som uppstår längs med strålbanan.
I framtiden kommer korsning av olika transgena fisk linjer möjliggör visualisering av den omedelbara och kortsiktiga (upp till 12 h) svaren från andra drabbade celler, såsom glia, till laserinducerad cellförstöring. Till exempel har astrocyternas och icke-cell autonom toxicitet i neurodegenerativa sjukdomar såsom ALS varit i forskningsrampljuset och är starkt inblandad i sjukdomsframkallande egenskaper hos sporadisk och familjär ALS 37, 38. Men mekanismerna bakom gliaceller toxicitet och selektivitetmot motoriska nervceller fortfarande oklara. Vi och andra nyligen tog fördel av denna metod för att studera omvälvning av döende nervceller av mikroglia och visualiseras clearance av neuronala rester 27, 39, 40.
Kombinera ablation teknik med hög upplösning mikroskopi och markörer för neuroinflammation kommer att tillåta forskare i framtiden att öka förståelsen av encelliga funktion och sammankopplade cellsystem. Karakterisering av dessa processer i ett in vivo inställning är kritisk inte bara i utvecklings inställningar utan även i modeller av neurodegenerativa sjukdomar, däribland MND, där cellulära interaktioner kan försämras 3, 41.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | Dissolve in egg water with tricaine (0.02%) at 0.8 - 1.5% | |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| Harvard standard wall Borosilicate with filament Capillary Glass | World Precision Instruments, Inc. | GC100F-10 (short) GC100F-15 (long) |
Pull to a resistance of 2 - 7 MΩ |
| Egg water | 0.6 g Instant Ocean sea salt, 4 mL of 1 mg/mL methylene blue in 10 L deionized water | ||
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Heat block | Select BioProducts | Digital block heater (SBD110_) | |
| Microinjection apparatus | World Precision Instruments, Inc. | Microinjection was performed by hand under a steromicroscope (Leica) with a loaded glass needle and a Picospritzer II (General Valve corporation) | |
| Stereoscope | Leica | Bright field illumination microscopy was performed on a Leica M165FC stereo dissection microscope (Leica) | |
| Microscope | Leica | SP5 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
References
- Becker, T. S., Rinkwitz, S. Zebrafish as a genomics model for human neurological and polygenic disorders. Dev Neurobiol. 72 (3), 415-428 (2012).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annu Rev Neurosci. 32, 435-506 (2009).
- Philips, T., Robberecht, W. Neuroinflammation in amyotrophic lateral sclerosis: role of glial activation in motor neuron disease. Lancet Neurol. 10 (3), 253-263 (2011).
- Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nat Rev Neurosci. 14 (4), 248-264 (2013).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
- Jagadeeswaran, P., Paris, R., Rao, P. Laser-induced thrombosis in zebrafish larvae: a novel genetic screening method for thrombosis. Methods Mol Med. 129, 187-195 (2006).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. (54), e2845 (2011).
- Matrone, G., et al. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).
- Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia. Dev Cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).
- Lewis, G. M., Kucenas, S. Motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish. J Vis Exp. (76), (2013).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).
- Villegas, R., et al. Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types. Neural Dev. 7, 19 (2012).
- O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Soustelle, L., Aigouy, B., Asensio, M. L., Giangrande, A. UV laser mediated cell selective destruction by confocal microscopy. Neural Dev. 3, 11 (2008).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
- Essentials of Biology 2. JoVE. , JoVE Science Education Database. Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques (2016).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).Vol.4th ed. , Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Clark, K. J., Urban, M. D., Skuster, K. J., Ekker, S. C. Transgenic zebrafish using transposable elements. Methods Cell Biol. 104, 137-149 (2011).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. J Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).
- Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev Biol. 365 (1), 290-302 (2012).
- Flanagan-Steet, H., Fox, M. A., Meyer, D., Sanes, J. R. Neuromuscular synapses can form in vivo by incorporation of initially aneural postsynaptic specializations. Development. 132 (20), 4471-4481 (2005).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front. Cell. Neurosci. , (2015).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish -- emergence of a new model vertebrate. Nat Rev Genet. 3 (9), 717-724 (2002).
- Lele, Z., Krone, P. H. The zebrafish as a model system in developmental, toxicological and transgenic research. Biotechnol Adv. 14 (1), 57-72 (1996).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Kabashi, E., et al. Gain and loss of function of ALS-related mutations of TARDBP (TDP-43) cause motor deficits in vivo. Hum Mol Genet. 19 (4), 671-683 (2010).
- Laird, A. S., et al. Progranulin is neurotrophic in vivo and protects against a mutant TDP-43 induced axonopathy. PLoS One. 5 (10), 13368 (2010).
- Lemmens, R., et al. Overexpression of mutant superoxide dismutase 1 causes a motor axonopathy in the zebrafish. Hum Mol Genet. 16 (19), 2359-2365 (2007).
- Ramesh, T., et al. A genetic model of amyotrophic lateral sclerosis in zebrafish displays phenotypic hallmarks of motoneuron disease. Dis Model Mech. 3 (9-10), 652-662 (2010).
- Hanneman, E., Trevarrow, B., Metcalfe, W. K., Kimmel, C. B., Westerfield, M. Segmental pattern of development of the hindbrain and spinal cord of the zebrafish embryo. Development. 103 (1), 49-58 (1988).
- Lewis, K. E., Eisen, J. S. From cells to circuits: development of the zebrafish spinal cord. Prog Neurobiol. 69 (6), 419-449 (2003).
- Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187 (6), 761-772 (2009).
- Philips, T., Rothstein, J. D. Glial cells in amyotrophic lateral sclerosis. Exp Neurol. 262, Pt B 111-120 (2014).
- Mazaheri, F., et al. Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia. Nat Commun. 5, 4046 (2014).
- van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment. Curr Biol. 22 (9), 830-836 (2012).
- Radford, R. A., et al. The established and emerging roles of astrocytes and microglia in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Front Cell Neurosci. 9, 414 (2015).
