Introduction
Fluorescens mikroskopi har lenge vært anvendt for å studere effektene av transgener i sebrafisk CNS, spesielt deres effekter på utvikling en. Høy oppløsning mikroskopi har gjort en detaljert kartlegging av de cellulære prosesser involvert i hjernens utvikling, muskel generasjon, og mange andre utviklings hendelser 2. Studerer død av en enkelt celle har vært mer utfordrende, hovedsakelig på grunn av de tekniske vanskelighetene med å indusere selektiv celledød under standard bilde prosedyrer. Men kombinasjonen av encellede oppløsning bildebehandling og svært målrettet ablasjon teknikker gjør at etterforskningen av umiddelbare cellulære reaksjoner på stress og skader, samt av de påfølgende celle-celle interaksjoner. Å forstå disse prosessene er kritisk, spesielt for neurodegenerative sykdommer slik som motor neuron sykdom (MND), hvor nevron-gliaceller interaksjon har blitt vist å bidra til progresjonav sykdommen 3.
MND, eller amyotrofisk lateral sklerose (ALS), er en ødeleggende nevrodegenerativ sykdom som rammer motoriske nevroner i hjernestammen, motor cortex, og ryggmargen. Tap av disse nevronene fører til muskel tap, og pasientene dør innen 3 - 5 år med diagnosen 4. Motoriske nerveceller i ryggmargen link til muskelfibre og spiller en viktig rolle i å tilrettelegge muskel sammentrekning. Unnlatelse av denne kommunikasjonen eller død av disse nevronene gradvis svekker musklene og påvirker pasientens evne til å svelge, gå, snakke og puste. Visualisering døden av en motor neuron og de kortsiktige konsekvensene i et levende dyr gir en utmerket mulighet til å bedre forstå de dynamiske prosessene som er involvert i normal celle homeostase og sykdom.
Sebrafisk har dukket opp som et attraktivt modellsystem for å studere nevrodegenerative sykdommer 1. Detteer på grunn av de fordeler som tilbys av denne modellorganisme, slik som ytre befruktning, kort utviklings tid, optisk adgang til nervesystemet, og enkel transgenesis. I tillegg muligheten til enkelt å generere forbindelse transgen sebrafisk tillater flere strategier for merking av forskjellige celletyper. Genetisk ablasjon tilnærminger til å drepe spesifikke celletyper tillate ganske bred forstyrrelse, men mangler den fine kontroll rettet mot individuelle celler 5. Laser-assistert teknikker, på den annen side gir god temporal og spatial kontroll og har vært brukt for forskjellige dyremodeller. Mens de fleste tilnærminger bruke spesialisert utstyr, for eksempel pulserende lasere 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 eller to-foton set-ups 13, annetforskningsmiljøer har nylig tatt nytte av en UV laser i konvensjonelle confocal mikroskoper 14.
Teknikken som er beskrevet her kombinerer høy oppløsning konfokal mikroskopi med en UV-laser-mediert metode til å forårsake cellulært stress eller død i en doseavhengig måte i utvalgte motoriske nevroner. Den er avhengig av bruk av den installeres vanligvis 405-nm laser, er blitt testet med hell i cellekultur og i levende dyr, og tillater detaljert karakteriseringen av cellulære interaksjoner, for eksempel microglial klaring etter neuronal død.
Protocol
MERK: Design, oppførsel, og rapportering av dyreforsøk må ta hensyn til gjeldende retningslinjer 15. Slikt arbeid må godkjennes på forhånd av den lokale dyrevernmyndighet (i vårt tilfelle, dyreetikk komité Macquarie University).
1. Forbered sebrafisk for montering og UV Cell Ablation
- Generer sebrafisk (Danio rerio) som uttrykker fluorescerende proteiner.
- For å uttrykke fluorescerende proteiner av interesse i sebrafisk, utføre plasmid injeksjoner i én celle stadium av sebrafisk egg (som beskrevet andre steder 16) eller bruke fluorescerende transgene linjer. For å merke flere celletyper, lage sammensatte transgene sebrafisk linjer ved å krysse etablerte transgene linjer relevant for spørsmålet om interesse. Plasser en mannlig og en kvinnelig sebrafisk på hver side av en falsk bunn pair parring tank i kveld og fjerne skillet med utbruddet av lysneste morgen (som beskrevet andre steder 17). Hold sebrafisk ved 28 ° C og håndtere dem i henhold til de etablerte protokoller 17, 18.
- Samle embryoene etter vellykket gyting av anstreng tanken vann som inneholder embryoene gjennom en plast te sil. Skyll eggene med systemvannet, og overføre dem til egg vann i en petriskål.
- Undersøke dem under et lysmikroskop for å bestemme befruktning. Oppbevares befruktede egg i en petriskål og legg dem i en inkubator ved 28 ° C 18.
- Valgfritt: Utfør en mikroinjeksjon å merke spesifikke cellepopulasjoner.
MERK: Dette er en alternativ metode som gjør det mulig for ekspresjon og visualisering av proteinene, uten behov for å heve stabile transgene linjer. Denne fremgangsmåte er også fordelaktig når proteinet av interesse er giftig og tillater generering av en stabil transskapte linjer.- Injisere plasmidkonstruksjoner inn i en celle-stadiet av sebrafisk embryoer, som beskrevet andre steder 19, 20, 21.
NB: Denne metoden resulterer i mosaikken ekspresjon av proteinet av interesse. Proteinet av interesse er drevet fra en formidler av valg (f.eks islet1 22, -3mnx1 23, 24, møtte 25, eller MPEG1 26) flankert av Tol2 invertert gjentar 20.
- Injisere plasmidkonstruksjoner inn i en celle-stadiet av sebrafisk embryoer, som beskrevet andre steder 19, 20, 21.
- Alder fisken til ønsket størrelse.
- Løft fisken til 3-5 dager etter befruktning (DPF) og plassere dem under en fluorescerende sammensatt mikroskop. Screen dyrene for passende fluorophore uttrykk og velg brightly merket fisk. Separer passende larvene inn i en annen tallerken med egg vann for innebygging sentr på (butikk i en 28 ° C inkubator).
Valgfritt: Embryoer kan plasseres i en 0,2 mM 1-fenyl-2-thioures (PTU) Ringer oppløsning ved 24 timer etter befruktning (HPF) for å hemme dannelsen av pigmentering. Hensyn må tas med PTU, som det er giftig og kan ha negativ fysiologiske, genetisk, eller morfologiske effekter. - For studier på et tidlig utviklingsstadium (<2 DPF), dechorionate embryoene manuelt ved hjelp av skarpe tang. Dechorionate stort antall embryoer enzymatisk ved tilsetning av pronase (2 mg / mL) for å egget vann og inkubere dem i 10 minutter ved 28 ° C.
- Pass embryoene jevne mellomrom gjennom en plast Pasteur pipette for å lette dechorionation. Avslutte prosessen når flertallet av embryoene har dukket opp fra sine chorions ved å vaske dem flere ganger med egg vann.
- Løft fisken til 3-5 dager etter befruktning (DPF) og plassere dem under en fluorescerende sammensatt mikroskop. Screen dyrene for passende fluorophore uttrykk og velg brightly merket fisk. Separer passende larvene inn i en annen tallerken med egg vann for innebygging sentr på (butikk i en 28 ° C inkubator).
- Forbered løsninger for sebrafisk forankring i agarose.
- Forbered en anestesi løsning ved å tilsette 4 g / l MS222 (Tricaine stamløsning, pH 7,0)dråpevis til en petriskål inneholdende egg vann. En dose på 50 mg / l er en anbefalt startpunkt (figur 1A).
- Forbered en aksje med lav smelte agarose (0,8 til 1,5%) i egg vann og delmengde det inn 1,5 ml Mikrosentrifugerør. Plassere en delmengde inn i en forvarmet varmeblokk (38 - 40 ° C) og la den ekvilibrere til den innstilte temperatur (~ 30 min, figur 1B).
- Valgfritt: For lengre sikt imaging (> 4 h), forberede litt agarose sirkel innenfor 35-mm glassbunn petriskål og la den til å sette (Supplementary figur 1).
MERK: Dette ekstra trinnet var effektive i å unngå enhver bevegelse av hele agarose dråpe med sebrafisk over lengre tidsrammer.- For å gjøre dette, sted ~ 300 mL av agarose langs den indre sirkelen av glassbunn rett til å forberede en smultring-formet sirkel med en liten åpning i midten der du vil plassere fisken (trinn 1.5.3; Supplerende Figur 1) .
- Monter sebrafisk i agarose for mikroskopi.
- Velg 1 - 3 av pre-screenet fisk for ablasjon og bedøve larver ved å overføre dem (ved hjelp av en overføring pipette) til en tallerken med anestesi oppløsning (trinn 1.4.1, figur 1C; ca. 5 min).
MERK: Fisken bedøves når de viser et grunt opercular bevegelse og en redusert hjertefrekvens og viser ikke lenger en touch-fremkalt fluktrespons (Teer, unnlatelse av å svømme bort etter forsiktig berøre deres hale med en børste). Sikre passende anestesi for den etiske behandling av fisken, og for å forhindre rykning ved overføring til agarose eller eksponering overfor fluoriserende lys. - Etter anestesi er bekreftet, suge opp en larve ved hjelp av en justerbar pipette (med en cut-off 200-mL spiss satt til ~ 30 ul), og la den synke til bunnen av spissen. Overfør larven inn i forvarmede agarose (trinn 1.4.2) ved å slippe ut en dråpe av væsken med seglarve inn i agarose (forsøke å minimalisere mengden av egg vann går inn i agarose, figur 1D).
- Suge opp fisken omgitt av agarose. Tilsett det raskt inn i tidligere utarbeidet med glassbunn 35-mm parabolen.
- Bruk en disseksjon mikroskop og en standard pensel (lang liner, størrelse 1) for å plassere dyret i agarose på siden (hodet til venstre) slik at kropp og hale er flat (figur 1E). Hvis du arbeider med flere fisk, justere all fisken i fatet, slik at de er lett ligger ved hjelp av konfokal mikroskop senere.
MERK: Raskt utføre denne prosedyren for posisjonering og samkjøre (det kan kreve litt øvelse, som agarose begynner å sette umiddelbart etter eksponering for kaldere temperaturer). - La agarose-embedded fisk for 10 - 15 min til agarose er satt fast. Nøye fylle opp 35-mm petriskål med ~ 2 ml egg vann som inneholder Tricaine (figur 1F).
- Velg 1 - 3 av pre-screenet fisk for ablasjon og bedøve larver ved å overføre dem (ved hjelp av en overføring pipette) til en tallerken med anestesi oppløsning (trinn 1.4.1, figur 1C; ca. 5 min).
2. Sett opp konfokalmikroskop og Imaging Parametere
- Sett petriskål sammen med den innebygde larve på det konfokale mikroskop trinnet og fokusere på ryggsiden av dyret ryggmargen (ved hjelp av lyse felt). Undersøke dyret under passende forstørrelse (40x) og fluoriserende omgivelser og visualisere strukturen av interesse (for eksempel fluorescens-intensiteten av de merkede nevroner eller microglial bevegelse) for å bekrefte at alle avbildningsparametre er behov for etterfølgende ablasjon (figur 2). Vi bruker rutinemessig 40X mål å utføre vår tid lapse studier.
- Valgfritt: Hvis du vil utføre en time-lapse studie i flere timer, er det lurt å ta en enkelt eller noen få tidspunkter før ablasjon å etablere uaffisert fysiologiske responsen av cellen og dets omgivelser (f.eks microglial bevegelse for å etablere baseline hastighet og bevegelighet).
- Bestemme tykkelsen av structure av interesse for UV laser ablasjon.
- Bruke z-stasjonen, kontrollerer toppen og bunnen av strukturen av interesse (f.eks celle soma) ved manuelt å fokusere opp og ned. Noter z-planet som skal ablateres (f.eks midten av cellen).
MERK: Av erfaring, denne metoden var mest effektiv ved å målrette ryggmargs nevroner som ble sterkt merket (en høy andel signal-til-støy som gjør det enkelt time-lapse visualisering etter ablasjon, for eksempel, figur 4) og ved ablating midten av celle soma. Cellekjernen fluorescens kan være til fordel for å sikre riktig målretting og høy ablasjon effektivitet.
- Bruke z-stasjonen, kontrollerer toppen og bunnen av strukturen av interesse (f.eks celle soma) ved manuelt å fokusere opp og ned. Noter z-planet som skal ablateres (f.eks midten av cellen).
3. Utfør Målrettet laser ablasjon av individuelle celler i Sebrafisk Spinal Cord
MERK: For denne ablasjon og visualisering tilnærming, ble en konfokal mikroskop (Leica SP5) brukes. Ablasjonsprosedyren ved hjelp av en 405-nm diode for celle-spesifikke målruction er detaljert i henhold til programvaren (Leica Application Suite, v2.7.3.9723). Imidlertid vil enhver konvensjonell konfokal mikroskop som er utstyrt med en 405-nm laser og en FRAP (fluorescens gjenoppretting etter fotobleking) eller blekemiddel modulen tillater utførelsen av de samme celle manipulasjoner, men potensielt med litt forskjellige innstillinger, parametere og navn.
- Start FRAP veiviseren ved å klikke på rullegardinmenyen øverst i programvaren menyen (figur 3A, 1 og 2). Observere et nytt vindu med ulike trinn som gjør at den er satt opp av de spesifikke parametre for laser ablasjon (figur 3B, 3).
- Bestem bildeparametere for ablasjon tilnærming ved å velge format, skannehastighet (figur 3B, 4), og i snitt (figur 3B, 5). Et bilde formatet 1024 x 1024 på en skannehastighet på 400 Hz og en linjegjennomsnitt på fire var mest aktuelt.
MERK: Det er vanligvis ikke nødvendig å endre den spektrale deteksjon (som eksitasjon eller utslippsparametre), som de har blitt bestemt i forrige oppkjøpet.- Hvis z-planet for ablasjon ikke allerede er valgt (som beskrevet i trinn 2.4.), Trykk på "live" -knappen og fokus gjennom prøven til den fluorescerende struktur eller ønsket z-planet som kommer til å bli ablated er i fokus.
- Når de generelle bildeparametere er satt, tilgang til "Bleach" trinn (Figur 3C, 6) til å kontrollere de spesifikke ablasjon komponenter.
MERK: En kombinasjon av laserintensiteten (figur 3C, 8), skannehastighet, og midlingen som er angitt i trinn 3.2 (figur 3B, 4 og 5), så vel som antall repetisjoner som vil bli satt i trinn 3,5 (Figur 3E,12), vil bestemme den totale oppholdstiden for UV-laser ved ROI, og derfor, blekeeffektiviteten.- Engasjere 405-nm laser ved å aktivere den for bleking prosedyre (Figur 3C, 8).
MERK: De fleste suksess med de nevnte innstillingene ble oppnådd med 405 nm laser intensiteter mellom 60 - 80% i vår eksperimentelle oppsett. Vær oppmerksom på at denne laseren effekt er instrumentspesifikke og vil være forskjellig for hver confocal oppsett. - Bruk "zoom inn" alternativet (figur 3C, 7) å maksimere bleking intensiteten på den valgte ROI ved å redusere skanne feltet, derfor maksimere oppholdstid. Alternativt kan du bruke "Bleach point" alternativet av programvaren av valget for denne prosessen.
- Engasjere 405-nm laser ved å aktivere den for bleking prosedyre (Figur 3C, 8).
- Velg en eller flere Rois (Figur 3D, 10) for ablasjon ved å bruke noen av tegneverktøyene i bildet oppkjøpet vindenow (Figur 3D, 9). Target axon haug, for eksempel med den sirkulære tegneverktøyet på ca 4-8 mikrometer.
MERK: ablasjon området er justerbar fra en enkelt piksel til et større område, avhengig av programmet. - Etter etablering av ROI, velg "Time Course" (figur 3E, 11) og bekrefte antall sykluser ROIs vil bli skannet / ablated (Figur 3E, 12). Velg "Pre-Bleach" og "Post-Bleach" frames som ønsket å tillate en oversikt over hele bildet like før og umiddelbart etter bleking prosessen.
- Etter å etablere alle nødvendige ablasjon parametrene, trykk "Kjør Experiment" (Figur 3E, 13) og overvåke effektiviteten av ablasjon.
MERK: I vår FRAP setup, et enkelt bilde vil bli tatt før og etter FRAP syklus med riktig laser excitation (f.eks 488 nm eksitasjon for EGFP-uttrykkende celler). Disse før og etter ablasjon bilder tillate en rask vurdering av hvordan tilfredsstillende avkastningen ble bleket og hvor effektive de valgte ablasjon parametere var. - Gjenta prosessen ved å justere laseren intensitet (figur 3C, 8), skannehastighet og gjennomsnittsberegning (figur 3B, 4 og 5), og repetisjoner (figur 3E, 12) i tilfelle den valgte ROI fremdeles viser høy fluorescensintensitet etter fullførelse av FRAP syklus.
4. Utfør Oppfølging prosedyren, inkludert fisk "Rescue" eller Avhending
- Hvis forsøket er terminal, avlive dyret med en overdose av Tricaine. Fjern egg vann og erstatte den med anestesi stamløsning i 10 min. For å sikre aktiv dødshjelp, sjekk under mikroskop for opphør av hjerteslag.
- Valgfri:Hvis forsøket er ikke terminal, fjerne fisken forsiktig fra agarose med fin pinsett og en børste. Legg fisken i ferske egg vann og la den komme under observasjon i 15 min. Hvis normal svømming oppførsel returnerer, med fisken tilbake til inkubatoren.
- Kast transgene dyr i henhold til institusjonens vedtatte GMO avfall.
Representative Results
Metoden er beskrevet her gjør at ablasjon av motoriske nerveceller i sebrafisk ryggmargen ved hjelp av FRAP modul av en kommersiell konfokalmikroskop. Transgene sebrafisk linjer som uttrykker et grønt fluorescerende protein i nerveceller under kontroll av spesifikke promotorer, slik som - 3mnx1, islet1, eller møtt, ble anvendt. Ekspresjon av GFP drives av motoren neuron promoter (for eksempel -3mnx1 eller møtt) gjør det mulig med høy oppløsning visualisering av cellelegemene, de viktigste axoner, og de ytre grener som strekker seg til muskler (figur 4 og video 1).
Nevroner i ryggmargen av 3 til 5 dager gammel fisk har blitt ablated, med en samlet oppholdstid på 60 - 80 s ved en lasereffekt på ~ 70% og de generelle innstillingene beskrevet i trinn 3. Vellykket ablasjon er oppnås når fluorescensen forsvinner straks etter ablasjonog aldri gjenopptar (figur 5, C og D). Forsøk på ablasjon med andre laserlinjer (for eksempel 488-nm laser linje) resulterte ikke i permanent fading, og fluorescens ble restaurert i løpet av korte tidsrammer. Viktigere, denne teknikken viste karakteristiske trekk ved apoptotisk celledød i UV-ablateres neuroner, slik som tilstedeværelse av Annexin V, konsistente morfologiske endringer av Somal degenerasjon, og aksonal blebbing av ablated neuron 27.
Spesifisiteten til denne tilnærmingen er bekreftet i eksperimenter ved å bruke photoconvertible fluoroforen Kaede (som veksler dens utslipp fra grønt til rødt etter eksponering for UV-lys), hvor en enkelt målrettet neuron ble omdannet (figur 5, A og B) uten tegn på celle ødeleggelse i løpet av flere timer. Bruk av en høyere laser makt i stedet fører to utryddelse av den målrettede neuron (ingen photoconversion eller gjenopptreden av fluorescens) og photoconversion (uten død) av cellene i umiddelbar nærhet (~ 20 nm) til ablasjon området (Figur 5, C og D).
En viktig fordel med denne laser-indusert ablasjon teknikk er den doseavhengigheten av tilnærmingen. For å målrette celler med forskjellige intensiteter, flere lag av fininnstilling er tilgjengelig ved å justere lasereffekten (figur 3C, 8), skannehastighet og linje gjennomsnitt (figur 3B, 4 og 5), størrelsen på ROI som skal ablateres (figur 3D, 10), og gjentakelser (figur 3E, 12). Spesielt, kan denne fremgangsmåten også benyttes til å gjelde cellulært stress til individuelle celler i stedet for å indusere celledød. For eksempel har finjustering værtganske verdifullt å vurdere cellulære prosesser i døden av en nervecelle. Motoriske nerveceller med lange aksonale anslag som ble ablasjon med lavere UV-laser intensiteter avslørte karakteristiske "blebbing" (dannelse og fragmentering av mobilnettet vesikler), som startet ved målrettet soma og fortsatte langs aksonet over tid (40-90 min; Figur 4 ; 3D gjengitt film av denne ablasjon i Video 1). Følgelig modulere de forskjellige laserablasjon parametre og dermed nivået av indusert cellulært stress og tidsforløpet for død tillater forskere en høy grad av fleksibilitet eksperimentelt.
Figur 1: Inkludering av sebrafisk for live bildebehandling. (AF) Inkludering prosedyre for live bildebehandling: (A) Tricaine tilsettes egg vann til bedøver sebrafisk en TA startdose på 50 mg / l. (B) lavtsmeltende agarose (0,8 til 1,5%) fremstilles og varme opp til 38 - 40 ° C. (C) Bruk en overføringspipetten, blir skjermet og valgt sebrafisk overført til en tallerken med Tricaine løsning. Etter vellykket sedasjon (grunne opercular bevegelse, redusert puls, mangel på en touch-fremkalt respons), en fisk overføres til den forvarmede agarose (D). Minimalisere mengden av egg vann som blir overført til agarose for å forhindre påfølgende fortynning. (E) Overfør en dråpe agarose (~ 30 - 50 mL) som inneholder sebrafisk på en glass-bottom 35-mm parabolen. Utfør dette under en disseksjon mikroskop og bruke en pensel til å forsiktig justere sebrafisk til sin foretrukne orientering. Vent 10 - 15 min, inntil agarose er satt, og legge til ~ 2 ml Tricaine løsning til parabolen (F).ank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Visualisering av nerveceller og microglia i ryggmargen av en 3-dpf sebrafisk. Visualisering av microglia og nevroner i ryggmargen på en 3-dagers gammel transgen sebrafisk uttrykke (A) GFP-positive nevroner (islet1: GFP) og (B) mCherry-positive microglia (MPEG1: GAL4, UAS: mCherry). (C) Composite bilde av nervecellen og mikroglia kanal sammen med det lyse-feltet bilde. Den skjematiske innskuddet i (C) viser orienteringen av fisken og skisserer den presenterte området. Scale bar = 30 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Trinn i prosessen med UV laser ablasjon (som beskrevet i protokollen, trinn 3). Fremgangsmåte for å kontrollere FRAP programvaremodulen i konfokal programvare (Leica Application Suite). (A) Starte FRAP modulen som et verktøy for å utføre UV laser ablasjon. (B) Sette opp z-planet for ablasjon og andre FRAP innstillinger som format, hastighet og gjennomsnitts, som vil avgjøre oppholdstiden for laseren. (C) Kontroll av laser intensitet og "zoom inn" for å maksimere bleking effektivitet. (D) Valg av ett eller flere områder av interesse (ROI) som vil bli ablated. (E) Innstilling av tidsforløpet for bleking bestemmer bleike sykluser og den generelle laser holdetid på Rois. Vennligst klikk her e for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Antero degenerasjon av en UV-ablated neuron. Time-lapse avbildning av neurodegenereringen av en UV-ablated spinal nevroner. (AF) UV-bestråling av en enkelt spinal neuron (oppfylt: GAL4, UAS: EGFP; A; sirkel) resulterte i soma av neuron krympende og avrunding opp over tid (AC), etterfulgt av aksonal fragmentering (CF; pilspisser) . Den aksonal degenerasjon, startet på soma (område av ablasjon) og kommet antero mot den distale ende av axon inntil endelig, fluorescensen i soma forsvant og det hele axon viste "blebbing» (DF). Skala barer = 20 mikrometer. 3D-rendret time-lapse film av denne ablasjon er vist i Video 1.es / ftp_upload / 54983 / 54983fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Bekreftelse av effekten av encellede UV bestråling ved hjelp av en photoconvertible fluorofor (Kaede) i en motor neuron. Validering av encellede UV-bestråling gjennom aktivering av den photoconvertible fluoroforen Kaede i et neuron. (AD) UV bestråling av nerveceller merket med Kaede. (A) Photoconversion av en enkelt neuron (sirkel) med en lasereffekt på 30% i 10 s førte til photoconversion av Kaede (fra grønn til rød) i bare det aktuelle individ nervecellen (B). Legg merke til at den konverterte cellen overlevd i flere timer og viste ingen synlige tegn på forringelse, slik som blebbing eller avrunding opp. Ablasjon av en enkelt neuron (C ; sirkel) med en høyere lasereffekt (95% til 10 s) resulterte i umiddelbar forsvinningen av den neuron (D) og påfølgende photoconversion av Kaede i et lite antall rundt neuroner innenfor et område på ca 20 um. Skala barer = 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1: 3D-overflate gjengivelse (Imaris) av UV-ablateres nervecellen som er vist i figur 4.
Time-lapse video av nervecellen avbildet i figur 4 er overflaten gjengis ved hjelp av en visualisering programvare (Imaris, bitplan). Det viser krympeprosessen av ablateres soma, etterfulgt av aksonal fragmentering anterogradely mot den ytre enden av cellen.euron_ablation-3D_rendered.mov "target =" _ blank "> Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende Figur 1: Valgfri agarose cast for lang tid imaging.
For å unngå bevegelse av fisken og agarosen under langtids anskaffelse fremstille en smultring-formet sirkel av agarose langs kantene i midten av den glassplate 35 mm skål (A). La agarose settet for ~ 10 min og overført fisk i den indre sirkel med en dråpe av agarose (B). Forsøke å minimalisere mengden av agarose for innstøping (børste overskudd agarose til utsiden etter orientering av fisken). Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Laser ablasjon tilnærminger
Laser-assistert ablasjon teknikker tillater presis målretting av individuelle eller små grupper av celler. Kombinere denne teknikken med høy oppløsning mikroskopi og genetiske manipulasjoner i dyremodeller som zebrafisk kan forskerne systematisk studere skjebnen til en enkelt celle og samspillet etter skade.
UV (405 nm) laserablasjon protokollen som er beskrevet her beskriver hvordan de enkelte celler kan bli stresset eller drepes selektivt (i en doseavhengig måte), mens nabo neuroner, gliaceller, og aksoner er igjen uskadd. Vi har med hell brukt denne tilnærmingen i cellekultur eksperimenter og beskrive her detaljert tilnærming for sebrafisk ryggmargen. Vi viser gjennomføringen av denne tilnærmingen i sebrafisk ryggmargen ved selektivt å understreke et individ nevron i et nettverk av andre celler (Figur 5, A og
Tidligere spesialiserte lasersystemer, for eksempel pulset laser-nitrogen eller to-foton lasersystemer, var nødvendig for å fremkalle vevsskade og motor nerve transections 10, 11, 12, 13. Disse lasersystemer har blitt brukt til å forårsake celleskader, slik som trombose i arterier og vener 6, akutt nyreskade 7, hjerteskade 8, og å studere kalsium bølger og microglial respons etter hjerneskade 9. Videre Soustelle og kolleger brukte en konvensjonell confocal oppsett (351 nm og 364 nm UV lasere) for å indusere skader epitelial og gliaceller i Drosophila 14 </ Sup>.
Relevansen av sebrafisk Modeller for å forstå ALS (og andre menneskelige sykdommer)
Sebrafisk er en mye brukt modellorganisme, særlig for utviklingsstudier 28, 29, 30. Mens de har visse begrensninger, deres potensial for å modellere sykdom hos mennesker, og gi en forståelse av sykdomsfremkallende molekylære mekanismer er enorm. Sebrafisk modeller har blitt godt etablert for studiet av MND og har ført til viktige molekylære innsikter 31, 32, 33, 34. Transgene sebrafisk linjer kan raskt genereres (4 - 5 måneder) og la den selektive sporing av en bestemt celletype, egenskaper som gjør dem et verdifullt tillegg til dagens dyremodeller av ALS. Sebrafisk embryo / larver er optisk transparent og tilbyr unike experimentale fordeler som tillater langvarig levende avbildning på enkelt-celle-nivået i hjernen eller ryggmargen, som ikke lett kan oppnås i gnagermodeller (eller hos mennesker). Når det kombineres med molekylære teknikker, slik som enkeltcelle ablasjon, gir dette en unik eksperimentell plattform for å studere presise molekylære mekanismer in vivo.
Motoriske nerveceller kan selektivt målrettet hjelp UV laser ablasjon
Spinal nevroner i sebrafisk begynner å utvikle seg innen 10 timer etter fødselen og er etablert etter ca 48 h 35, 36. Denne raske utviklingen tillater visualisering av disse nevronene i korte tidsrammer og med høy gjennomstrømming. Motoriske nerveceller gi viktige forbindelsen mellom hjerne og muskler, og i ALS, er berørt i motor cortex (øvre motor nevroner), hjernestammen, og ryggmargen (nedre motor nevroner). Tap av disse nevronene fører uunngåelig til muscle atrofi og svakhet. Motoriske nerveceller i ryggmargen av sebrafisk kan identifiseres ved sine distinkte anslag og ved bruk av motor-neuron spesifikke arrangører som -3MNX1. Målrette cellen soma av slike utstikk nevroner avslørte antero degenerasjon langs aksonal projeksjon over tid (figur 4 og Video 1). Enkeltcelle oppløsning avbildning av spinal motoriske nevroner i tillegg bekreftet fosfatidylserin translokasjon og påfølgende Annexin V-etiketten etter laserablasjon (se figur 4 og Supplerende Video 3 i referanse 27). Selv om vi rapportere aktivering av Annexin V i døende nevroner etter vår UV laser ablasjon tilnærming, kan vi ikke være sikre på at den kaskade av døden som utløses i løpet av denne akselerert prosessen, samsvarer med neuronal død som oppstår under nevrodegenerasjon eller normal celle homeostase.
Mens dette ablasjon tilnærmingen er svært reproduserbareog bestemte, forskjellige strategier for innebygging kan også påvirke effektiviteten av UV-ablasjon. I vår erfaring, det var mest vellykket for å minimere lag av agarose vi forankret vår fisk i. Tykkere lag med innstøpningsmediet med et ekstra lag med egg vann kan redusere UV makt slutt mottatt av cellen på grunn av demping og spredningseffekter som oppstår langs strålebanen.
I fremtiden vil kryssing av ulike transgene fiskelinjer åpner for visualisering av umiddelbar og kortsiktig (opp til 12 h) reaksjoner fra andre berørte celler, for eksempel gliaceller, til laser-indusert celle ødeleggelse. For eksempel har astrocytt og ikke-autonome celletoksisitet i neurodegenerative sykdommer slik som ALS vært i søkelyset forskning og er sterkt involvert i patogenisiteten av sporadisk og familiær ALS 37, 38. Imidlertid er mekanismene som ligger til grunn glial toksisitet og selektivitetmot motor nevroner fortsatt uklare. Vi og andre nylig tok fordel av denne tilnærmingen for å studere engulfment av døende nevroner av microglia og visualisert clearance av nevrale restene 27, 39, 40.
Kombinere ablasjon teknikk med høy oppløsning mikroskopi og markører for nevroinflammasjon vil tillate forskere i fremtiden for å utvide forståelsen av enkeltcellefunksjon og sammenhengende cellesystemer. Karakterisering av disse prosesser i et in vivo miljø er kritisk, ikke bare i utviklingsmessige innstillinger, men også i modeller av neurodegenerative sykdommer, inkludert MND, hvor cellulære interaksjoner kan bli svekket 3, 41.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | Dissolve in egg water with tricaine (0.02%) at 0.8 - 1.5% | |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| Harvard standard wall Borosilicate with filament Capillary Glass | World Precision Instruments, Inc. | GC100F-10 (short) GC100F-15 (long) |
Pull to a resistance of 2 - 7 MΩ |
| Egg water | 0.6 g Instant Ocean sea salt, 4 mL of 1 mg/mL methylene blue in 10 L deionized water | ||
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Heat block | Select BioProducts | Digital block heater (SBD110_) | |
| Microinjection apparatus | World Precision Instruments, Inc. | Microinjection was performed by hand under a steromicroscope (Leica) with a loaded glass needle and a Picospritzer II (General Valve corporation) | |
| Stereoscope | Leica | Bright field illumination microscopy was performed on a Leica M165FC stereo dissection microscope (Leica) | |
| Microscope | Leica | SP5 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
References
- Becker, T. S., Rinkwitz, S. Zebrafish as a genomics model for human neurological and polygenic disorders. Dev Neurobiol. 72 (3), 415-428 (2012).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annu Rev Neurosci. 32, 435-506 (2009).
- Philips, T., Robberecht, W. Neuroinflammation in amyotrophic lateral sclerosis: role of glial activation in motor neuron disease. Lancet Neurol. 10 (3), 253-263 (2011).
- Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nat Rev Neurosci. 14 (4), 248-264 (2013).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
- Jagadeeswaran, P., Paris, R., Rao, P. Laser-induced thrombosis in zebrafish larvae: a novel genetic screening method for thrombosis. Methods Mol Med. 129, 187-195 (2006).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. (54), e2845 (2011).
- Matrone, G., et al. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).
- Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia. Dev Cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).
- Lewis, G. M., Kucenas, S. Motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish. J Vis Exp. (76), (2013).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).
- Villegas, R., et al. Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types. Neural Dev. 7, 19 (2012).
- O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Soustelle, L., Aigouy, B., Asensio, M. L., Giangrande, A. UV laser mediated cell selective destruction by confocal microscopy. Neural Dev. 3, 11 (2008).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
- Essentials of Biology 2. JoVE. , JoVE Science Education Database. Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques (2016).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).Vol.4th ed. , Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Clark, K. J., Urban, M. D., Skuster, K. J., Ekker, S. C. Transgenic zebrafish using transposable elements. Methods Cell Biol. 104, 137-149 (2011).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. J Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).
- Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev Biol. 365 (1), 290-302 (2012).
- Flanagan-Steet, H., Fox, M. A., Meyer, D., Sanes, J. R. Neuromuscular synapses can form in vivo by incorporation of initially aneural postsynaptic specializations. Development. 132 (20), 4471-4481 (2005).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front. Cell. Neurosci. , (2015).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish -- emergence of a new model vertebrate. Nat Rev Genet. 3 (9), 717-724 (2002).
- Lele, Z., Krone, P. H. The zebrafish as a model system in developmental, toxicological and transgenic research. Biotechnol Adv. 14 (1), 57-72 (1996).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Kabashi, E., et al. Gain and loss of function of ALS-related mutations of TARDBP (TDP-43) cause motor deficits in vivo. Hum Mol Genet. 19 (4), 671-683 (2010).
- Laird, A. S., et al. Progranulin is neurotrophic in vivo and protects against a mutant TDP-43 induced axonopathy. PLoS One. 5 (10), 13368 (2010).
- Lemmens, R., et al. Overexpression of mutant superoxide dismutase 1 causes a motor axonopathy in the zebrafish. Hum Mol Genet. 16 (19), 2359-2365 (2007).
- Ramesh, T., et al. A genetic model of amyotrophic lateral sclerosis in zebrafish displays phenotypic hallmarks of motoneuron disease. Dis Model Mech. 3 (9-10), 652-662 (2010).
- Hanneman, E., Trevarrow, B., Metcalfe, W. K., Kimmel, C. B., Westerfield, M. Segmental pattern of development of the hindbrain and spinal cord of the zebrafish embryo. Development. 103 (1), 49-58 (1988).
- Lewis, K. E., Eisen, J. S. From cells to circuits: development of the zebrafish spinal cord. Prog Neurobiol. 69 (6), 419-449 (2003).
- Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187 (6), 761-772 (2009).
- Philips, T., Rothstein, J. D. Glial cells in amyotrophic lateral sclerosis. Exp Neurol. 262, Pt B 111-120 (2014).
- Mazaheri, F., et al. Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia. Nat Commun. 5, 4046 (2014).
- van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment. Curr Biol. 22 (9), 830-836 (2012).
- Radford, R. A., et al. The established and emerging roles of astrocytes and microglia in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Front Cell Neurosci. 9, 414 (2015).
