Studieren Mitochondrial Struktur und Funktion in<em> Drosophila</em> Ovarien
Summary
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.
Abstract
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.
Introduction
Die Mitochondrien sind klassisch als zelluläre Kraftwerk beschrieben, da sie die Haupt Sitze der Energieproduktion in differenzierten Zellen sind. Darüber hinaus spielen Mitochondrien eine wichtige Rolle im Stoffwechsel, Wärmeerzeugung, Lipid – Modifikation, Calcium und Redoxhomöostase, die Orchestrierung von Zellsignalprozesse, etc 1. Mitochondria auch eine aktive Rolle bei der Induktion von Zelltod 2, sowie in der Zellzyklusregulation 3 spielen. Solche Multifunktionalität ergeben sich folgende grundlegende Fragen: a) Wie Mitochondrien führen alle diese Funktionen gleichzeitig und b) gibt es spezifische mitochondriale Pools oder Subzonen, die für verschiedene Funktionen spezialisiert sind? In diesem Zusammenhang ist es wichtig, dass die multifunktionale Mitochondrien in ihrer Form, Größe und Struktur innerhalb einzelner Zellen und dass die Beharrungsform der Mitochondrien variieren zwischen Zelltypen können dynamisch sind zu beachten. Jahrzehnte der Forschung aus verschiedenen LaborOratorien legen nahe , dass die Änderung der mitochondrialen Form, Größe und Struktur, die kollektiv mitochondrialen Dynamik genannt, entscheidend ist 4,5,6 verschiedenen mitochondrialen Funktionen aufrechtzuerhalten. Diese Ergebnisse heben die Möglichkeit, dass die Mitochondrien ihre Multifunktionalität, die aufgrund ihrer strukturellen Dynamik erreichen kann.
Umfangreiche Anstrengungen unternommen werden, die mitochondriale Struktur-Funktions-Beziehung zu verstehen. Die Dynamik der mitochondrialen Struktur wird durch ihre Fähigkeit zu unterziehen Spaltung und Fusion Ereignisse miteinander in erster Linie beibehalten. Fission von großen Mitochondrien wandelt sie in kleinere mitochondrialen Elemente, während Fusion zwischen zwei kleineren Mitochondrien führt diese in ein größeres mitochondrialen Element 7. Außerdem kann transient Fusion von zwei Mitochondrien auftreten, um die Vermischung von deren Inhalt zu ermöglichen. Die Spaltung und Fusion Ereignisse der inneren und der äußeren mitochondrialen Membranen werden sorgfältig durch spec geregeltific setzt von Proteinen. Die Kernspaltung Maschinen ist dynamin-verwandtes Protein 1 (DRP1) aus, der aus dem Cytosol in die Mitochondrien durch seine Wechselwirkung mit bestimmten bona fide mitochondriale Proteine (zB Fis1 oder MFF1) eingestellt wird, während DRP1 Funktion auch reguliert werden kann durch andere Proteine auf der mitochondrialen Oberfläche 4. Obwohl DRP1 auf der äußeren Membran arbeitet, beeinflussen seine Spaltung Fähigkeiten, um die innere Membran als auch. Die Orchestrierung der Spaltung von äußeren und inneren Mitochondrienmembranen ist nicht gut verstanden. Auf der anderen Seite, die Fusion der inneren Membran wird im Kern durch die Aktivitäten der opA1 geregelt, während mitofusins die Fusion der äußeren Membran 5 regieren. Der Rest der entgegen Spaltung und Fusion Ereignisse der Mitochondrien diktieren die Steady-State-mitochondriale Form in einer Zelle. Zum Beispiel würde Unterdrückung der mitochondrialen Spaltung in vollständig und ohne Widerstand Fusion, während die Überaktivität der Mitochondrienl Spaltung würde zu einer Fragmentierung der Mitochondrien 3 führen.
Die Untersuchung der mitochondrialen Struktur-Funktions-Beziehung geht es vor allem zwei komplementäre Ansätze: a) Analyse der zellulären und organismischen Phänotypen nach genetischen Manipulation von mitochondrialen Spaltung / Fusionsproteine und b) die direkte Beurteilung der mitochondrialen Struktur und Funktion. Es ist bemerkenswert, dass genetische Analysen nicht immer die direkte Funktionalität des Moleküls an der Hand (in diesem Fall die mitochondriale Spaltung / Fusionsproteine) kann sich herausstellen, wie die Phänotypen aufgrund Nebenwirkungen auftreten können. Daher ist es von größter Bedeutung, Werkzeuge zu entwickeln und zu verwenden, um direkt mitochondriale Struktur und Funktion zu untersuchen. Bei der Beurteilung der mitochondrialen Struktur beinhaltet verschiedene Mikroskopie-Tools. Die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen fortgeschritten ist stark, die Studien der mitochondrialen Dynamik, da die mitochondriale Dynamik überwacht werden können, sowohl qualitativ als auch quantitathungsweise die entsprechenden Fluoreszenzmikroskopie Werkzeuge und Techniken unter Verwendung von 8. Die Fluoreszenzmikroskopie-basierte Werkzeuge wurden mitochondriale Struktur und Funktion in lebenden und fixierten Drosophila melanogaster Gewebe zu studieren entwickelt, die Aufklärung der Bedeutung der mitochondrialen Dynamik in vivo 9. Diese und verwandte Verfahren werden hier beschrieben, mit dem Ziel , mitochondriale Struktur studieren und Funktion in der Drosophila Ovars.
Das Drosophila Ovar besteht aus Keimbahn und somatischen Abstammungslinien, die von ihren jeweiligen adulten Stammzellen entstehen , die 10,11 in der Germarium befinden. Sechzehn – Syncytial – Keimzellen (GCs) durch somatische Follikelzellen eingekapselt erhalten (FCs) einzelne Ei Kammern zu bilden , die aus dem Germarium (Abbildung 1) entstehen. Eines der 16 GCs eine Eizelle zu werden erhalten begangen, und die restlichen 15 GCs in Nährzellen entwickeln, die das Wachstum der Eizelle Kammer unterstützen, Die Reifung der Eizelle zu erleichtern, bevor sie verlegt wird. Die Mehrzahl der FCs laufen 9 Runden von Mitosen, bevor sie den mitotischen Zellzyklus verlassen terminal mit in einer strukturierten Epithelzellschicht unterscheiden, bestehend aus vorderen Follikelzellen (AFCs) posterior Follikelzellen (PFCs) und Hauptkörperzellen (MBCs) . Die aufeinander folgenden Ei Kammern sind durch Stengel Zellen verbunden, die Zellen unterschieden, die auch von den FCs früh in der Entwicklung ableiten. Mitochondriale Form durch die DRP1 mitochondrialen Spalt Protein reguliert wird im Prozess der Differenzierung während der normalen Entwicklung des Drosophila ovarian FC Schicht 9,12 beteiligt. Die Verfahren , die in diesen Studien verwendet , um die Beteiligung von DRP1 in Drosophila Follikel Zellschicht Entwicklung zu identifizieren , werden hier beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls
Photobleaching: Vermeidung unzumutbarer Photobleichens fluoreszierenden Proben ist unbedingt erforderlich, um eine effiziente Durchführung der konfokalen Mikroskopie. Daher wird die Zeitproben durch das Okular zu lokalisieren oder Bildaufnahmeparameter über den Live-Abtastmodus eingestellt sollte Photobleichens minimiert werden minimiert.
Gewebeschäden: Da Mitochondrien betrachtet sind die Sen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge Leena Patel and Diamond Woodard for helping in the Drosophila medium preparation and Dr. Igor Chesnokov for providing access to the camera-attached stereomicroscope.
Materials
| Grace's Media (Insect Dissecting Medium) | Fisher Scientific | 30611031-2 | |
| 41 Paraformaldehyde AQ | Electronic Microscopy Sciences | 50-259-99 | |
| Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) | Life Technologies | m7514 | Reconstitute and Aliquot |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate | Sigma Aldrich | 87917-25MG | Reconstitute and Aliquot |
| MitoSox (Mito-Ros stain) | Life Technologies | m36008 | Reconstitute and Aliquot |
| PolyLysine | MP Biomedicals | ICN15017625 | |
| Fly Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Fly Conicals | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Vial Flugs | Fisher Scientific | AS273 | |
| Fly Conical Flugs | Fisher Scientific | AS 277 | |
| Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) | Fisher Scientific | AS153 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-50G | |
| Cyclin E Antibody (d-300) | Santa Cruz | sc- 33748 | |
| ATPB antibody [3D5] – Mitochondrial Marker | AbCam | ab14730 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-165-146 | |
| Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-175-144 | |
| Hoechst | Fisher Scientific | H3570 | |
| VectaShield | Fisher Scientific | H100 | |
| Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-026-252 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish | Fisher Scientific | P35G-0-14-C | |
| Active Dried Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Technologies | 11251-20 | |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Technologies | 26016-12 | |
| Minutien Pins | Fine Science Technologies | 26002-15 | |
| MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) | Bloomington Stock Center | 7194 | |
| Fly Pad | Fly stuff | 59-118 | |
| Blowgun | Fly stuff | 54-104 | |
| Blowgun needle | Flystuff | 54-119 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Analyses software | Carl Zeiss | Zen | |
| Analyses software | Open source | Image J | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono | QImaging | QIC-F-M-12-C | |
| QCapture Pro 5.1 | QImaging |
References
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