Этот протокол демонстрирует изоляцию мышиного островка и посев на дезаклеарном эшафоте. Осадки, поддерживаемые эшафотом, трансплантировали в эпидидимальную жировую площадку стрептозотоцина (STZ) -индуцированных диабетических мышей. Островки выживали на участке трансплантации и меняли гипергликемическое состояние.
Было доказано, что трансплантация островков эффективна при лечении диабета 1 типа. Тем не менее, нынешняя стратегия внутрипеченочной трансплантации может иметь острую реакцию цельной крови и приводить к плохому приживлению островков. Здесь мы сообщаем о надежном протоколе для трансплантации островков на внепеченочном участке трансплантации – эпидидимальной жировой подушке (EFP) – в модели диабетической мыши. Описан протокол для выделения и очистки островков с высоким выходом от мышей C57BL / 6J, а также метод трансплантации, выполняемый посевными островками на дезаклеарный каркас (DCS) и имплантация их на сайт EFP у сингенных мышей C57BL / 6J, которые были диабетическими Стрептозотоцином. Трансплантат DCS, содержащий 500 островков, перевернул гипергликемическое состояние в течение 10 дней, в то время как свободные островки без DCS требовали не менее 30 дней. Нормогликемия поддерживалась на срок до 3 месяцев, пока не был эксплантирован трансплантат. В заключение DCS усилило приживление островков в tОн внепеченочный сайт EFP, который можно легко получить и может обеспечить воспроизводимую и полезную платформу для исследования материалов лесов, а также другие параметры трансплантации, необходимые для успешного приживления островков.
Сахарный диабет 1 типа (T1D) является аутоиммунным эндокринным расстройством, в котором островковые клетки удаляются иммунной системой, что делает пациентов зависимыми от инъекции экзогенного инсулина на всю жизнь. Протокол Эдмонтона представляет собой веху в клинических исследованиях трансплантации островков; Островки вводили через портальную вену и трансплантировали на внутрипеченочном участке 1 . Однако два основных препятствия – неадекватные источники островков-доноров и плохое приживление островков – препятствуют широкому успеху трансплантации островков 2 . Как правило, островки необходимо собирать у трех доноров трупы, чтобы отменить гипергликемическое состояние одного пациента; Это связано с низким выходом процедур изоляции островков и потерями островков после трансплантации. В частности, хотя островки после трансплантации были омыты богатой кислородом кровью, прямой контакт с кровью часто вызывал мгновенную опосредованную кровью инфаркта(IBMIR), что может вызвать острую потерю островков. В долгосрочной перспективе считается, что постепенная потеря островков у пациентов объясняла снижение показателей реверсии диабета в клинических группах, которые могли достичь 90% в первый год и снизились до 30% и 10% на 2 и 5 Лет после трансплантации, соответственно 3 .
Трансплантация островков на внепеченочных участках была привлекательной стратегией для уменьшения прямого контакта островков с кровью, ограничивая трансплантацию до более определяемых мест по сравнению с внутрипеченочной инфузией. В последние годы исследования были проведены в капсулах для почек, глазных мышцах, мышцах, жировых клетках и подкожных клетках, что свидетельствует о том, что островки на этих участках способны выжить и функционировать для восстановления нормогликемии 4 . Кроме того, островки на этих участках извлекаются, что позволяет проводить биопсию или даже для дальнейших процедур замены. ВнепеченочныеПоэтому он демонстрирует большой потенциал для клинической трансплантации 5 .
Исследования на основе биоматериалов интенсивно изучались для трансплантации клеток и тканевой инженерии. Трехмерные (3D) леса обычно содержат пористые структуры и могут служить в качестве клеточных шаблонов для создания пространственной структуры / организации клеток или в качестве резервуаров для обеспечения контролируемого высвобождения биоактивных сигналов. Леса также были изготовлены из полимерных материалов, таких как поли (гликолид-L-лактид) 6 , поли (диметилсилоксана) 7 и термопластичный поли (уретан) 8 , в трансплантационные островки в EFP. Было обнаружено, что по сравнению с прямой трансплантацией островков было обнаружено, что использование подмостей уменьшает потери островков, предотвращая утечку островков во внутрибрюшинную полость 9 , 10 , обеспечивая механическую защиту и модулюЛокализуя местную воспалительную реакцию. Таким образом, строительные леса могут быть разработаны для содействия приживлению островков на участках трансплантации 7 .
В этом исследовании мы намерены продемонстрировать парадигму трансплантации островков в EFP, проводимую в моделях мышей с использованием DCS. Леса, полученные из внеклеточных матриц, в последние годы вызвали большой интерес благодаря превосходной биосовместимости и более естественным пористым структурам по сравнению с синтетическими продуктами. Здесь мы описываем надежный протокол изоляции для получения островков поджелудочной железы с высоким выходом у мышей C57BL / 6J. DCS, обработанные из бычьего перикарда, затем засевали островками, и трансплантаты были трансплантированы в EFP в сингенных диабетических моделях. Нормогликемия у мышей была достигнута в течение 10 дней и поддерживалась до 100 дней до удаления трансплантатов.
Перфузия поджелудочной железы и время переваривания являются двумя ключевыми параметрами, которые влияют на выход и качество остэка. Moskalewski впервые сообщило об использовании сырой смеси коллагеназы для переваривания поджелудочной железы поджелудочной железы морской свинки <sup class="xre…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Вэй Чжан из Guanhao Biotech за предоставление декоративных лесов. Мы благодарим Сяо-хон Пэн за полезные обсуждения. Это исследование было финансово поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (проект №31322021).
Dissecting scissor | Ningbo Medical | ||
Forceps | Ningbo Medical | ||
0.5 mm diameter wire mesh | Ningbo Medical | ||
70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
Artery hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
Microscopic hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
Hemostatic forceps | Ningbo Medical | ||
Absorbable 6-0 PGLA sutures | JINHUAN | With needle | |
Wound clip | Ningbo Medical | ||
Cotton swab | Ningbo Medical | ||
Gauze | Ningbo Medical | ||
Sterile drapes | Ningbo Medical | ||
10mL syringe | JINGHUAN | ||
1 mL syringe | JINGHUAN | ||
27G intravenous needle | JINGHUAN | 0.45×15 RWSB | |
1.5 mL Eppendorf tube | Axygen | ||
15mL conical tube | Corning | 430791 | |
50mL conical tube | Corning | 430829 | |
35mm Non-treated Peri-dishes | Corning | 430588 | |
Transwell | Corning | 3422 | |
0.22 μm filter | Pall | PN4612 | |
10 mL serological pipet | Corning | 4488 | |
Pipet filler S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
Pipette (2-20μL) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Hank’s balanced salt solution | Gibco | C14175500CP | |
Collagenase P | Roche | COLLP-RO | |
Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
FBS | Gibco | 16000-044 | |
D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
Glucose meter | Roche | ACCU-CHEK | |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Streptozotocin | Sigma | V900890 | VetecTM |
Chloral hydrate | J&K | C0073 | |
Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
Citric acid | Sigma | C2404 | |
Iodophors | Ningbo Medical | ||
C57BL/6J, 10-12 weeks old | VitalRiver | Beijing, China | |
Decellularized scaffold | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, China |