Denne protokollen demonstrerer isolering av murin øl og såing på en decellularisert stillas. Stillasstøttede øyer ble transplantert i den epididymale fettpute av streptozotocin (STZ) -inducerte diabetiske mus. Islets overlevde på transplantasjonsstedet og reverserte den hyperglykemiske tilstanden.
Isletransplantasjon har blitt klinisk bevist å være effektiv ved behandling av type 1 diabetes. Imidlertid kan den nåværende intrahepatiske transplantasjonsstrategien medføre akutte helblodsreaksjoner og resultere i dårlig øyelegging. Her rapporterer vi en robust protokoll for transplantasjon av øyer på det ekstrahepatiske transplantasjonsstedet – den epididymale fettputen (EFP) – i en diabetisk musemodell. En protokoll for isolering og rensing av øyer med høye utbytter fra C57BL / 6J-mus er beskrevet, så vel som en transplantasjonsmetode utført ved seeding-øyer på en decellularisert stillas (DCS) og implanterer dem på EFP-stedet i syngene C57BL / 6J mus-gjengede diabetiker Av streptozotocin. DCS-transplantatet som inneholdt 500 øyer reverserte den hyperglykemiske tilstanden innen 10 dager, mens de frie øyene uten DCS krevde minst 30 dager. Normoglykemi ble opprettholdt i opptil 3 måneder til graftet ble eksplantert. I konklusjonen økte DCS engraftment of islets into tHan ekstrahepatiske nettsted av EFP, som lett kunne hentes, og kan gi en reproduserbar og nyttig plattform for å undersøke stillasmaterialene, samt andre transplantasjonsparametere som kreves for en vellykket holning.
Type 1 diabetes mellitus (T1D) er en autoimmun endokrin lidelse der øketsceller ablateres av immunsystemet, noe som gjør at pasientene er avhengige av injeksjon av eksogent insulin for hele livet. Edmonton-protokollen representerer en milepæl i kliniske studier av øletransplantasjon; Øyer ble infundert gjennom portalvenen og transplantert på det intrahepatiske område 1 . Imidlertid hindrer to hovedhinder – utilstrekkelige kilder til donorøyler og fattig øyekraft – den store suksessen til øletransplantasjonen 2 . Vanligvis må øyer samles fra tre cadaveric donorer for å reversere den hyperglykemiske tilstanden til en pasient; Dette skyldes det lave utbyttet av isolasjonsprosedyrer og øktapet etter transplantasjon. Spesielt, selv om post-transplantasjonsøyene ble badet i oksygenrikt blod, fremkalte direkte kontakt med blod ofte det øyeblikkelige blodmedierte inflammaTory reaksjon (IBMIR), som kan forårsake akutt tap av øyene. På lang sikt er det antatt at gradvis tap av øyer hos pasienter sto for nedgang i diabetesomslag i de kliniske gruppene, som kunne nå 90% i det første året og falt til 30% og 10% med 2 og 5 År etter transplantasjon, henholdsvis 3 .
Isletransplantasjon på ekstrahepatiske steder har vært en attraktiv strategi for å redusere direkte kontakt med øyer med blod mens de begrenser transplantasjonene til mer definerbare steder sammenlignet med intrahepatisk infusjon. Studier har blitt utført i nyrekapsel, øye, muskler, fettputer og subkutane rom de siste årene, og viser at øyer på disse områdene er i stand til å overleve og fungere for å gjenopprette normoglykemi 4 . I tillegg er øyene på disse områdene gjenvinnbare, noe som gjør det mulig for biopsi eller til og med for ytterligere utskiftingsprosedyrer. Ekstrahepatisk sDet viser derfor stort potensial for klinisk transplantasjon 5 .
Biomaterialbaserte stillaser har blitt intensivt undersøkt for celletransplantasjon og vevsteknikk. Tredimensjonale (3D) stillas inneholder vanligvis porøse strukturer og kan tjene som mobilmaler for å generere romlig struktur / organisering av celler eller som reservoarer for å gi kontrollert frigivelse av bioaktive signaler. Stillaser har også blitt fremstilt fra polymere materialer, slik som poly (glykolid-L-laktid) 6 , poly (dimetylsiloksan) 7 og termoplastisk poly (uretan) 8 , til transplantasjonsøyer i EFP. Sammenlignet med direkte transplantasjon av øyer ble bruken av stillas funnet å redusere øktapet ved å forhindre lekkasje av øyer i det intraperitoneale hulrom 9 , 10 , som gir mekanisk beskyttelse og moduLating den lokale inflammatoriske reaksjonen. Stillasene kan således bli utviklet for å fremme islet-inngrep på transplantasjonsstedene 7 .
I denne studien har vi tenkt å demonstrere et paradigme for øktransplantasjon i EFP, utført i musmodeller ved hjelp av en DCS. Stillaser avledet fra ekstracellulære matriser har tiltrukket stor interesse de siste årene på grunn av den overlegne biokompatibiliteten og mer naturlige porøse strukturer sammenlignet med syntetiske produkter. Her beskriver vi en robust isolasjonsprotokoll for å oppnå pankreasøyler med høye utbytter fra C57BL / 6J-mus. DCSer behandlet fra bovin perikardiet ble deretter sådd med øyer, og transplantatene ble transplantert til EFP i syngene diabetiske modeller. Normoglykemi hos mus ble oppnådd innen 10 dager og ble opprettholdt i opptil 100 dager, til fjerning av transplantatene.
Pancreas perfusjon og fordøyelsestid er to viktige parametere som påvirker øktutbytte og kvalitet. Moskalewski rapporterte først bruken av en rå kollagenaseblanding for å fordøye hakket marsvinpankreas 11 . Lacy et al. Rapporterte injeksjonen av enzymer i kanalsystemet for å perfeksere bukspyttkjertelen, noe som økte økningen 12 i stor grad . Den duale perfusjonen av enzym muliggjør maksimal eksponering av bukspyttkjertelenes overflateareal til enzymet,…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Wei Zhang fra Guanhao Biotech for å gi de decellulariserte stillasene. Vi takker Xiao-hong Peng for de nyttige diskusjonene. Denne undersøkelsen ble støttet økonomisk av National Natural Science Foundation of China (Prosjekt nr.31322021).
Dissecting scissor | Ningbo Medical | ||
Forceps | Ningbo Medical | ||
0.5 mm diameter wire mesh | Ningbo Medical | ||
70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
Artery hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
Microscopic hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
Hemostatic forceps | Ningbo Medical | ||
Absorbable 6-0 PGLA sutures | JINHUAN | With needle | |
Wound clip | Ningbo Medical | ||
Cotton swab | Ningbo Medical | ||
Gauze | Ningbo Medical | ||
Sterile drapes | Ningbo Medical | ||
10mL syringe | JINGHUAN | ||
1 mL syringe | JINGHUAN | ||
27G intravenous needle | JINGHUAN | 0.45×15 RWSB | |
1.5 mL Eppendorf tube | Axygen | ||
15mL conical tube | Corning | 430791 | |
50mL conical tube | Corning | 430829 | |
35mm Non-treated Peri-dishes | Corning | 430588 | |
Transwell | Corning | 3422 | |
0.22 μm filter | Pall | PN4612 | |
10 mL serological pipet | Corning | 4488 | |
Pipet filler S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
Pipette (2-20μL) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Hank’s balanced salt solution | Gibco | C14175500CP | |
Collagenase P | Roche | COLLP-RO | |
Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
FBS | Gibco | 16000-044 | |
D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
Glucose meter | Roche | ACCU-CHEK | |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Streptozotocin | Sigma | V900890 | VetecTM |
Chloral hydrate | J&K | C0073 | |
Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
Citric acid | Sigma | C2404 | |
Iodophors | Ningbo Medical | ||
C57BL/6J, 10-12 weeks old | VitalRiver | Beijing, China | |
Decellularized scaffold | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, China |