Summary
Этот метод демонстрирует эффективный способ подготовки к репликации дефектной ретровирусных запасов кодирования человека онкоген, а в дальнейшем использоваться для индукции миелопролиферативные заболевания в мышиной модели.
Abstract
Наша лаборатория изучает человеческое миелопролиферативных заболеваний, вызванных такими как онкогены Bcr-Abl или фактор роста рецептора полученных онкогенов (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα и т.д.). Мы можем моделировать и изучать человека-подобного заболевания у нашей модели мыши, путем пересадки клеток костного мозга ранее инфицированы ретровирусом выражения онкоген интересов. Репликация-дефектных ретровируса кодирования человеческих онкогенов и маркера (GFP, ППП, ген устойчивости к антибиотику, и т.д.) производится переходных протокол трансфекции с использованием 293T клеток человеческого эпителия почечных клеточной линии преобразуется продукт гена E1A аденовирусов. 293 клетки обладают необычным свойством высокой степени transfectable кальция фосфата (КАПО 4), до 50-80% эффективности трансфекции легко достижима. Здесь мы сотрудничаем трансфекции клеток 293 с ретровирусных вектор выражения онкоген интересов и плазмиды, что выражает кляп-пол-ENV упаковки функций, таких как одного генома упаковки строит кат или PCL, в данном случае EcoPak плазмиды. Начальная трансфекции является дальнейшее совершенствование использования хлорохину. Запасы ecotropic вируса, собранная, как культура супернатанта 48 часов. после трансфекции, можно хранить при температуре -80 ° С и использовали для заражения клеточных линий с учетом трансформации и в лабораторных исследованиях, или первичные клетки, такие как мышиные клетки костного мозга, которые затем могут быть использованы для трансплантации в нашей модели мыши .
Protocol
- Вечером перед преобразованием, пластины 293T клетки в 3-5х10 6 кл / 6 см cultureplate ткани.
Примечание: Мы используем клетки 293T за их простоту трансфекции и efficacyas вирусом клеток. Эти клетки являются несовершенными в упаковке вирус, если вспомогательную плазмиду вводят.
- Первое утро, аккуратно удалите средних и заменить 4 мл 293T ячейки мед содержащий 25 мМ Хлорохин. Положить в инкубаторе в течение 1 часа.
Примечание: пластина должна быть около 80% вырожденная.
- Между тем, подготовка вирус решений смесь в течение 2 тарелки за раз, в 5 мл пробирок:
- 2 х 10 мг ретровирусных плазмиды построить
- 2 х 5 мг упаковка построить (EcoPak),
- 2 х 62 мл CaCl
- полный до 1 мл стерильной DDH 2 O
Примечание: При ретровирусных плазмида кодирует онкоген интересов и маркер, EcoPak кодирует кляп-пол-окр. Вместе с 293T клетки, они будут производить ecotropic ретровируса (RV), специфичные для клеток мыши, но не инфекционного для человеческих клеток. Оба Хлорохин и CaCl 2 было показано, что повышение эффективности трансфекции.
- Добавить 1 мл 2 раза sterileHBS каплям к смеси, мягко вортексе трубки.
- Сразу же добавить это решение до 2 тарелки, 1 мл каждый, мягко, капля за каплей.
- Положить в инкубаторе в течение 7 до 11 часов.
- В вечернее время (от 7 до 11 часов. Позже), аккуратно удалите среды, и очень аккуратно заменить 5 мл свежего 293T среды. Положить в инкубаторе до полудня, на следующий день.
Примечание: этот шаг важен, так как необходимо снять хлорохин из клеток. Если храниться в течение длительных периодов времени, хлорохин является токсичным. Решение в пластинах выглядит нечетким, в связи с очень тонкой, пылевидных осаждения трансфекции смеси.
Примечание: Очень важно сделать все средства массовой информации изменения с особой нежностью, как клетки были сенсибилизированных хлорохин, и может легко отделить от пластины.
- На следующий день, 18 до 24 часов. , прежде чем извлекать вируса (около полудня), аккуратно удалите среды, и очень нежно заменить 3 мл свежего 293T среды. Заменить в инкубаторе O / N.
- Третье утро (от 18 до 24 часов. Позже), осторожно всасывать средний форму пластин с 10 мл шприца оснащен 18 G иглу. Это супернатант содержит ретровируса.
- Изменение иглой 45 мм, шприц фильтра, переверните шприц несколько раз перемешать раствор хорошо, проходит через фильтр супернатант, и аликвоту в cryotubes
Примечание: В качестве альтернативы, если вы делаете 3 + пластин вируса, бассейн все супернатанты же вирус в 5 0 мл коническую трубку. Тщательно перемешать, затем аликвоты супернатантов содержащей ретровирус в cryotubes с помощью фильтра.
- Пробирки с вирусом полный супернатанты хранятся в -80 ° C до использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Четыре критических точек будет гарантировать успех хорошего вирусного складе:
- 293T продуцирующие клетки должны быть очень здоровым, то есть они были разделены на очень регулярно, никогда не были заросшие, и высевают на оптимизированные плотностью 3,5-5 млн в 6 см планшета для культуры ткани, так что они достигают плотности 80% пластину на утро трансфекции.
- Добавление хлорохин повышает эффективность трансфекции и последующих титр вируса, около 3 - 5-кратный, путем стабилизации клетка lysozomes и увеличения доли ДНК, которая достигает ядра. Натрий бутират (другой лизосомы стабилизатора) также используется для этой цели. Хлорохин может быть опущен, в этом случае меняется среда 7-11 часов. после трансфекции в этот момент не требуется.
- Качества ДНК является очень важным. Предпочтительный метод очистки как вектор и упаковки плазмидных ДНК в два раза очищают CsCl-бромистый этидий плавучей центрифугирования плотности. Нам нравится концентрация ДНК, чтобы быть не менее 1 мг / мл, а отношение ОП 260/280 должна быть в пределах 1.75-1.90. Qiagen-очищенную ДНК также будет работать, хотя в руках авторов, результаты не столь хороши. Важно, что совокупный объем растворов ДНК малым (<50 мкл в целом на окончательное мл), чтобы избежать неблагоприятных последствий Трис и ЭДТА (ТЕ) по осадка фосфата кальция.
- Выбор диапазона ретровирусных вектор и ведущий упаковки построить очень важны. Для устойчивых выражений в мышиных гемопоэтических стволовых клеток, вектора на основе вируса саркомы миелопролиферативные является предпочтительным. Общие основы вектор MIG Р.И., содержащие MPSV длинную последовательность повторить терминал, сайт множественного клонирования для внедрения онкоген, а ниже по течению внутренний сайт вступления рибосомы связаны с геном для улучшения зеленого флуоресцентного белка (EGFP). Для трансдукции мыши HSC, вирус с ecotropic круг хозяев является оптимальным, но такие акции нестабильны при физиологической температуре и не могут быть сосредоточены центрифугированием.
Некоторые контрольно-пропускных пунктов: При желании, когда-то собирают, 293 клетки могут быть использованы для производства белка лизатов для иммуноблоттинга проверить экспрессию белков, кодируемых ретровирусных вектор (например, ТК). Мы также используем контроль LacZ кодирования плазмиды в отдельную табличку во время трансфекции (без упаковки вектора необходимо), чтобы проверить для трансфекции efficinecy бета-гал анализа, когда мы собираем супернатанта других плит. Обратите внимание: это будет тест клеток и реагентов, но не качество плазмиды используются для вируса решений.
Перед использованием любого вируса, титр должен быть определен. Это очень важно для того, чтобы соответствовать титры различных акций вирус в тот же эксперимент, и для обеспечения эффективного трансдукции гемопоэтических стволовых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | cell-line | Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well. | ||
| 293T cell medium | DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro. | |||
| coding DNA plasmid | Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.) | |||
| EcoPak | also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env | |||
| 2x HBS | For 500 ml: 8.0 g NaCl+ 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 μ filter. Store at room temperature, with the cap on tight. | |||
| 2M CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| miliQ H2O | sterile-filtered | |||
| Chloroquine | 1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed. | |||
| 6 cm plates | for tissue culture | |||
| Incubator | for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2. | |||
| 10 cc sterile syringes | Sterile. One per virus type. | |||
| 18G needles | single use, one per virus type. | |||
| 45 um syringe filters | ||||
| 5 ml plastic tubes | Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes. | |||
| 50 ml conical tubes | ||||
| cryovials | 2 and 4 ml, for virus aliquots. | |||
All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) and kept sterile. |
||||
References
- DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system. Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).
- Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells. Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).
- Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes. Blood. 83, 43-50 (1994).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70, 5701-5705 (1996).
- Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
- Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).
- Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).
- Van Etten, R. A.
- Van Etten, R. A. Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice. Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).
