Deze werkwijze gebruikt zebravisembryo's efficiënt testen vasculaire invasieve vermogen van kankercellen. Fluorescerende kankercellen worden geïnjecteerd in de precardiac sinus of dooierzak ontwikkelende embryo's. cel kanker vasculaire invasie en extravasatie wordt beoordeeld via fluorescentie microscopie van de staart regio 24-96 uur later.
Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.
Metastatische ziekte is een belangrijke oorzaak van kankersterfte en vele mechanismen waarmee kankercel disseminatie nog worden ontdekt 1. Om een kankercel met succes uitzaaien, moet het eerst binnen te dringen door het stroma dat een primaire tumor omringt, in te voeren (intravasate) in de bloedsomloop, overleven in transit, afslag (extravasaat) uit de circulatie, en tot slot de oprichting van een microflora naar de verre orgaan met 2. Intravasation en extravasatie zijn dus cruciale stappen in de metastatische cascade, maar toch elke kankercel is niet inherent bedreven in het verstoren en het migreren door middel van endotheliale kruispunten 3. In feite zijn er een aantal unieke selectiedruk die kankercel vasculaire invasie omringen en de werkwijze kan verder worden beïnvloed door verschillende endogene en exogene factoren 4. Daarom, technieken die het agressieve gedrag van vergevorderde kanker sonde vaak gericht op vascular invasieve vermogen als middel om metastatische verspreiding te voorspellen.
Verschillende modelsystemen bestaan om de studie van kankercel vasculaire invasie in vitro te vergemakkelijken. De meest gebruikte in vitro assays omvatten hetzij transwell systemen kankercelmigratie beoordelen via een endotheelbarrière 5 of elektrische cel-substraat Impedantie Sensing (ECIS) technologie om de real-time verstoring van een intacte endotheliale monolaag van kankercellen 6 volgen. Deze tests meestal niet over de vloeistofdynamica en stromale factoren die anders zouden beïnvloeden kankercel bijlage bij een endotheliale muur. Dit probleem is enigszins omzeild door perfusable vasculaire netwerken die voortvloeien uit de 3D-cultuur van endotheel met ondersteunende stromale cellen, en deze 3D-microfluïdische systemen vertegenwoordigen nu de voorhoede van de huidige in vitro opties 7,8. Toch zijn deze benaderingen laat de robuuste micromilieu van een functionele vaatstelselen derhalve slechts gedeeltelijk substituut voor in vivo modellen.
De meest gebruikte in vivo model van vasculaire invasie van de muis, waarin experimentele metastase testen gewoonlijk uitgevoerd omdat dat dit op relatief korte tijdschaal en die in het algemeen indicatief voor metastatische vermogen 9. Deze testen omvatten directe injectie van kankercellen in het verkeer en daarmee het model van de eindfase van de metastase, namelijk extravasatie en kankercel kolonisatie van organen. De experimentele metastase testen verschillen, afhankelijk van de plaats van injectie kankercel en de organen uiteindelijk geanalyseerd. In het eerste assay soort worden kankercellen geïnjecteerd in de staartader van muizen en kankercellen zaaien in de longen wordt bewaakt 10,11. De tweede test omvat het uitvoeren van intracardiale injectie metastatische zaaien tegen het bot micro 12-14 leiden, maar ook de hersenen 15. In de derde proef, kanker cells worden geïnjecteerd in de milt om kolonisatie mogelijk van de lever 16 terwijl de vierde afgifteroute in de halsslagader verricht kankercellen naar de hersenen 17,18. Ongeacht de kankercel levering methode, orgel kolonisatie is de geaccepteerde experimentele eindpunt en wordt meestal bepaald via luminescentie, histologie, of PCR-gebaseerde technieken. Ondanks het fysiologische voordelen van het uitvoeren van experimentele metastase testen bij een murine gastheer deze experimenten moeten nog weken tot maanden in beslag en analyseren.
De zebravis (Danio rerio) model is onlangs naar voren gekomen als een nieuw systeem kankervooruitgang 19,20 bestuderen, en maakt de beoordeling van kankercel vasculaire invasie in een functionele vaatstelsel gedurende een veel kortere tijdschaal vergelijking met muizen 21-24. De methode maakt gebruik van een transparante zebravis stam die het endotheel is gemarkeerd met een groene koraalrif fluorescent eiwit reporter aangedreven door de kdrl promoter, de zebravis receptor voor vasculaire endotheelgroeifactor 25. In de test worden kankercellen gemerkt met een fluorescerende marker en geïnjecteerd in de precardiac sinus van 2-dagen oude embryo's. Ergens tussen 48-96 uur na de injectie kankercellen die uit het vaatstelsel en in het caudale gebied van embryo zijn binnengedrongen kan efficiënt in een fluorescentiemicroscoop scoorde. Hier de techniek passen we een panel van veelgebruikte humane borstkankercellijnen tot grote verschillen in hun vasculaire invasieve vermogen aantonen. Verder tonen we aan dat het veranderen van de plaats van injectie het embryo dooierzak maakt de studie van heterogene cel interacties, kanker celpopulaties verschillend kunnen worden gelabeld met fluorescente kleurstoffen en geïnjecteerd in zebravisembryo's ontbreekt fluorescerende vasculatuur. In dit laatste assay kankercellen die de dooier zijn binnengedrongen en intravasated in de vasculature gescoord in het caudale gebied 24 tot 48 uur na injectie. Vanwege de effectiviteit en het gemak van dit model, worden zebravis toenemende mate toegepast om de vasculaire invasieve vermogen van kankercellen snel testen onder een fysiologische omgeving.
Deze techniek maakt gebruik van de zebravis model om de vasculaire invasieve vermogen van kankercellen (zie figuur 1) efficiënt testen. Hier pasten we de techniek om een panel van borstkankercellijnen teneinde een basislijn waarop andere onderzoekers vervolgens hun studies bouwen verschaffen (zie tabel 1, figuren 2-3). De waarneming dat MDA-MB-231-cellen gemakkelijk binnengevallen in de caudale regio van de zebravis embryo's zou deze cellijn ideaal voor het testen …
The authors have nothing to disclose.
We thank Peter Johnson of the Georgetown University Microscopy Core for assistance with imaging the zebrafish embryos. The Microscopy & Imaging Shared Resource and the Zebrafish Shared Resource are partially supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. This work was also supported by NIH/NCI CA71508 (AW) and CA177466 (AW).
0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
100mm Dishes | Corning Incorporated | 3160-100 | |
5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass | Fisher Brand | 13-678-20B | |
60 mm Dish | Corning Incorporated | 3160-60 | |
Agarose, Low Melting | Fisher | BP165-25 | |
Agarose, Molecular Grade | Bioline | BIO-41026 | |
Capillary Glass, Standard, 1.2MM x 0.68MM, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
David Kopf 700C Vertical Pipette Puller | Hofstra Group | 3600 | |
DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
Electrode Storage Jar, 1.0MM | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) | Fluka | A5040 | |
Eyelash Brush | Ted Pella, Inc | 113 | |
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
Fisherbrand Transfer Pipettes | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
Gel Loading Pipet Tips | Fisher Brand | 02-707-181 | |
Glass Bottom Dishes (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
Glass Depression Slide | VWR | 470005-634 | |
Instant Ocean Salt, Sea Salt | Pentair | IS50 | |
Latex Rubber Bulbs, 2mL, Pack of 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
Micromanipulator | Narishige | ||
Eclipse E600 | Nikon | ||
PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
Penicillin-G Potassium | Fisher Biotech | BP914-100 | |
Petri Plates, 100mm x 15mm | Fisher Brand | FB0875713 | |
Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
Streptomycin Sulfate | Fisher Biotech | BP910-50 | |
Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
Zebrafish | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |