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Cancer Research

(ゼブラフィッシュにおける癌細胞の血管浸潤能をテストします doi: 10.3791/55007 Published: November 3, 2016

Summary

この方法は、効果的に癌細胞の血管の浸潤能をテストするためにゼブラフィッシュ胚を利用します。蛍光性の癌細胞は、心臓前方の洞または胚の開発の卵黄嚢に注入されます。癌細胞血管浸潤と血管外漏出は、24から96時間後に尾部領域の蛍光顕微鏡によって評価します。

Introduction

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転移性疾患は、癌死亡率および癌細胞の播種を可能にする1が発見されずに残っている多くのメカニズムの主要な原因です。正常に転移する癌細胞のためには、まず、原発腫瘍を囲む間質を介して侵入しなければならない循環系に(intravasate)を入力し、輸送中に生き残る、循環からの出口(浸出)、および最後に実行可能なコロニーを確立します遠隔臓器サイト2で。血管内および血管外漏出は、このように転移カスケードにおける重要なステップであり、まだすべての癌細胞は、内皮接合部3を介して破壊し、移行では、本質的に熟達していません。実際には、癌細胞の血管浸潤を取り囲み、プロセスはさらに、内因性及び外因性因子4の様々な影響を与えることができるユニークな選択圧のシリーズがあります。これらの理由から、進行期癌の攻撃的な行動を調べる技術は、多くの場合、Vに焦点を当てます転移拡散を予測する手段としてascular浸潤能。

様々なモデル系は、in vitroでの癌細胞の血管浸潤の研究を促進するために存在します。 インビトロアッセイにおいて最も使用され、癌細胞6によって無傷内皮単層のリアルタイム破壊を監視するために、内皮障壁5または電気細胞-基質インピーダンスセンシング(ECIS)技術を介して癌細胞の移動を評価するために、トランスウェルシステムのいずれかを含みます。これらのアッセイは、典型的には、それ以外の内皮壁に癌細胞の付着に影響を与える流体力学および間質の要因を欠いています。この問題は、やや間質細胞を支持して内皮の3D培養から生じる灌流血管ネットワークによって回避されており、これらの3Dマイクロ流体システムは現在、in vitroでの現在のオプション7,8の最前線を表します。それでも、これらのアプローチは、機能的な循環系の堅牢な微小環境を省略しますしたがって、唯一のin vivoでのモデルの一部代替インチ

最も広く血管浸潤のin vivoモデル使用されるそれらは、比較的短い時間スケール上に発生し、一般的転移能9を示しているので、実験的転移アッセイが一般的に実行されたマウスです。これらのアッセイは、循環への癌細胞の直接注入を伴う、したがって転移、臓器の血管外遊出すなわち癌細胞コロニー形成の最終段階をモデル化します。実験的転移アッセイは、癌細胞の注射部位に基づいて異なると器官は、最終的に分析しました。第1のアッセイ型では、癌細胞をマウスの尾静脈に注入され、肺の癌細胞の播種は、10,11モニターされます。第二のアッセイは、転移性骨微小環境12-14に向かって播種するだけでなく、脳15を指示するために心臓内注射を実行する必要があります。第三のアッセイでは、癌Cellsは頸動脈に第送達経路は、脳17,18に癌細胞を担持し、一方、肝臓16のコロニー形成を可能にするために、脾臓内に注入されます。かかわらず、癌細胞送達方法、臓器のコロニー形成の受け入れ実験的エンドポイントであると一般的に発光、組織学、またはPCRベースの技術を介して決定されます。マウス宿主内で実験的転移アッセイを行うの生理学的な利点にもかかわらず、これらの実験はまだ完了し、分析するために数週間から数ヶ月が必要です。

ゼブラフィッシュ( ゼブラフィッシュ )モデルは、最近、癌の進行19,20を研究するため新しいシステムとして登場し、マウス21-24と比較してはるかに短い時間スケールで機能的な循環系内の癌細胞の血管浸潤の評価が可能にしました。この方法は、その内皮は緑のサンゴのfluoのタグが付いている透明なゼブラフィッシュ系統を利用しますkdrlプロモーターによって駆動されるrescentタンパク質レポーター、血管内皮増殖因子25ゼブラフィッシュレセプター。アッセイでは、癌細胞は赤色蛍光マーカーで標識され、2日齢の胚の心臓前方の洞に注入しました。どこでも注射後48〜96時間の間に、血管系の外と胚の尾部領域に侵入した癌細胞は、蛍光顕微鏡で効率的に得点することができます。ここでは、それらの血管の浸潤能で全く差異を実証するために一般的に使用されるヒト乳癌細胞株のパネルに技術を適用します。さらに、我々は癌細胞集団は、示差蛍光色素で標識され、蛍光血管系を欠くゼブラフィッシュ胚に注入することができるように、胚の卵黄嚢に注射部位を変えることは、不均一な細胞相互作用の研究を可能にすることを示しています。この後者のアッセイでは、卵黄に侵入した癌細胞はvasculaturにintravasatedeは注射後48時間に尾部領域24で採点されます。これにより、モデルの有効性と利便性のために、ゼブラフィッシュはますます急速に生理学的な設定の下で、癌細胞の血管の侵襲能力を試験するために使用されます。

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Protocol

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倫理文:承認されたIACUCプロトコルに従ってゼブラフィッシュの胚を生成しました。これらの実験は、ジョージタウン大学動物実験委員会によって勧告に準拠して実施しました。

1.注射用胚を整理し、原液を作成します。

  1. 癌細胞の血管浸潤を評価するために必要なゼブラフィッシュの幼虫を生成します。
    1. mitfa b692; ednrb1の B140の:(grcfp kdrl)ZN1 Tgを有するにおけるクロス交配ペアワイズまたはグループを設定します。
      :ZN1; mitfaのb692; ednrb1の B140のゼブラフィッシュを、Tgは(kdrl:grcfp)交配することによって我々は、Tgは(grcfp kdrl)を生成した色素細胞を欠いている行で、内皮細胞に緑色のサンゴ礁のサンゴの蛍光タンパク質を発現ZN1 25を 、mitfa b692; ednrb1 B140、ゼブラフィッシュ国際リソースセンターで開発されました。
    2. 共同llect卵、清潔、そして翌日22未受精または変形した胚を削除します。
    3. ゼブラフィッシュの胚は受精後(2 DPF)2日間あるときに発生する、癌細胞の注射の準備ができるまで、28.5℃で胚を培養します。
  2. 注入プレートを作成します。
    1. 各プレートのためのdH 2 O中1.5%アガロースの25ミリリットルを溶かします。
    2. 100ミリメートル×15ミリメートルのペトリ皿にアガロースの12ミリリットルを注ぎ、それを硬化させます。
    3. プレートに残っているアガロースを注ぐその後、再溶融。
    4. それは、アガロースに30度の角度であり、プレートの中央に位置するようにすぐにカットガラスモールド(7.5センチx xは7.2センチメートル広い3ミリメートル)を配置します。
      注:これは急な60°の壁と30°傾斜したランプを作成します。
    5. 代わりにガラスモールドをテープやアガロース硬化しましょう。
    6. 静かにガラスモールドを除去し、アガロースを引き裂くしないように注意してください。
      注型は、4℃でのdH 2 Oに保存することができます。
  3. 魚の水(0.3グラム/ Lの海塩)で注入プレートを平衡化します。
    1. 蒸留水で2回プレートを洗浄します。
    2. 10分間シェーカー上でプレートと場所に魚の水の10ミリリットルを追加することによって、プレートを平衡化します。
    3. 魚の水でプレートをもう一度平衡化します。
  4. 魚の水22を含む皿にそれらを転送することにより、注射群に2日後に受精(DPF)の胚を分割します。
  5. 注入後に利用するグループごとに回復料理を準備します。回復皿は10ミリリットル魚の水に加え、ペニシリン(25μg/ ml)およびストレプトマイシン(50μg/ ml)を含んでいることを確認してください。
  6. 魚の水+ペニシリンおよびストレプトマイシンの50ミリリットルに緩衝トリカインストック(4 mg / mlで、10 mMトリス、pHが7)の4ミリリットルを追加することで、2倍トリカイン溶液を調製します。
  7. イマジンライブ胚を固定します取り付け麻酔媒体を生成するために、2倍トリカイン溶液10ml中に15mgの低融点アガロースを溶解グラム。
    注:マウント培地を1.5%アガロースで構成されています。
  8. マイクロインジェクションの針を引き出します。
    1. 垂直ピペットプラーにガラスキャピラリーチューブを置きます。 20ミリアンペアの電流と2コイルの発熱体を使用して長いテーパー状のピペットを引き出します。

親油性蛍光色素で標識化2.癌細胞

  1. その推奨される培養条件でがん細胞を維持します。
    注:BT-474、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468およびSK-BR-3:これらの行は、DMEM + 10%FBS中で維持しました。 HCC 1806 T-47D:これらのラインは、RPMI + 10%FBS中で維持しました。すべての細胞株は、インキュベーション中に37 O C及び5%CO 2で維持しました。
  2. 癌細胞の接着培養を解離することにより、単一細胞懸濁液を生成します。
    1. PBSを用いて最初の細胞を洗浄した後、0.05%トリプシン-EDTA溶液で処理します。
      注:トリプシン露光時間細胞株に依存するであろう。
    2. SEとのトリプシン溶液を中和細胞がデタッチした後、ラム含有細胞培養培地。
  3. 遠心分離機200×gで5分間トリプシン中和し、細胞懸濁液を、次いで、細胞計数のために、新鮮な培地中に細胞ペレットを再懸濁します。
  4. 自動化された計数器を用いて細胞懸濁液を計数し、細胞培養培地200μlに100万個の細胞を調製します。
    1. ゼブラフィッシュ胚に注入前にトリパンブルー色素排除と細胞生存率を確認します。
      注:死細胞の注入は、真の血管浸潤が反映されませんようにのみ生存細胞集団は、ゼブラフィッシュ胚に注入する必要があります。
  5. 、100倍希釈よく混ぜ、その後、37℃で20分間混合物をインキュベート:1のための癌細胞懸濁液に赤親油性色素の2μLを加えます。
    注:染料の濃度および標識時間は、各細胞株のために最適化される必要があるかもしれません。
  6. インキュベーション後、チューブに新鮮な培地の1ミリリットルを追加し、その後で5分間遠心200×gです。
  7. 癌細胞からの残留蛍光染料を洗い流します。
    1. 吸引は、細胞ペレットから上清を、200×gで5分間、新鮮な培地1ml中のペレット、及び遠心分離機を再懸濁します。
    2. 洗浄工程をもう一度繰り返します、上清を吸引新鮮な培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁した後、200×gで5分間、再び遠心します。
    3. 洗浄工程三回目を繰り返します、上清を吸引新鮮な培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁した後、200×gで5分間、再び遠心します。
  8. 上清を吸引し、新鮮な培地500μlの中に百万標識された癌細胞を含む細胞ペレットを再懸濁します。
    注:0.5mMのEDTAは、細胞凝集を防止するために、培地に添加することができます。

3.ゼブラフィッシュ胚の事前の心臓洞に癌細胞を注入

  1. 加圧空気源にマイクロインジェクションディスペンスシステムを接続し、目をオンにします電子マイクロインジェクション分配システムの電源。
    1. フットペダルを押すことにより試験圧力。空気の短いパルスは、針ホルダーから放射する必要があります。
  2. 2Xトリカイン溶液で2回噴射プレートを平衡化。
    1. 各平衡段階のために、10分間シェーカー上射出プレートと場所に2倍トリカイン溶液20mlを加えます。
  3. 2倍のトリカイン溶液を含む小さな皿に胚のグループを転送するためにプラスチック製のピペットを使用してください。
  4. ゲルローディングピペットチップを使用して、癌細胞を有するマイクロインジェクション注射針を埋め戻します。
    1. 細胞は先端付近に落ち着くように下向きに先端を有する電極保存瓶に針を置きます。
  5. プラスチックピペットで2倍トリカインをたっぷり使って胚を収集することにより、射出プレートに30麻酔し、胚 - 転送20。
    1. 胚は、ピペットの先端に定住することを可能にします。
    2. ヘントlyがトラフの長さに沿って胚を拡散、注入プレートのトラフに胚を追放します。
    3. トラフの急な壁に直面して上を向く頭と腹を持つ胚を合わせます。
      注:トリカイン溶液は、胚が唯一のトラフに存在すると、トラフの長さとフラットアガロース面の両方をカバーする必要があります。胚は今、注射の準備ができています。
  6. マイクロインジェクションディスペンスシステムを用いて、ゼブラフィッシュ胚の心臓前方の洞に - (5 NL 2)100癌細胞 - 50を注入します。
    1. マイクロマニピュレータの針ホルダーに針を取り付けます。
    2. 左に60度の壁とステレオスコープの下で注入プレートを置き、25倍の倍率でトップ胚に焦点を当てます。
    3. 拡張時、針が胚を貫通するように、マイクロマニピュレーターを配置します。
    4. それはほぼ胚をタッチするまで目で針を拡張します。
    5. 顕微鏡で見ると、トンように針を合わせます帽子には、さらなる伸長時の胚を貫通します。
    6. ピアースだけでチップを置く卵黄嚢を通して胚ではなく、中に、プレ心臓洞。
    7. フットペダルを押すことによって、細胞を注入します。注入の力は、心臓の洞に細胞を放出します。針を撤回。
    8. 右手を使用して、拡張し、注射針を後退させます。左手で、次の胚を配置するために微調整を行います。
    9. 別のプレートを注入するために設定しながら、電極保存瓶に針を戻します。
  7. プレート全体が注入されると、回復皿に胚を移します。
    1. トラフのうち残りの胚を洗浄し、プラスチック製ピペットでそれらを収集し、下部にある胚をプールするために注入プレートを傾けます。
    2. 胚は、ピペットの底に定住することができます。
    3. トリカインの最小容量の回復皿に胚を移します。
  8. Incuba1時間28℃でのTE回収皿。
    1. 死んだ胚および他の破片から独立した実行可能なゼブラフィッシュ胚。
  9. 96時間 - 得点、一般的に24の準備ができるまで33℃で皿をインキュベートします。
    注意:この温度は37℃、癌細胞のための理想的な温度、及び28.5°C、ゼブラフィッシュのための理想的な温度との間の妥協点として決定されます。

4.得点溢出

  1. トリカイン溶液で皿にそれらを置くことによって得点する胚のバッチを麻酔。
  2. トリカインのドロップでうつ病顕微鏡スライド上に麻酔をかけた幼虫を置きます。
    1. 尾部領域の最適なイメージングのための横方向に東洋の幼虫。
  3. 正常に明らかに無傷の細胞を識別するためにテール領域を介して上下に着目して血管系の外に侵入した癌細胞の数をカウントします。
    注:これは、トンに関与する少なくとも2人を持っているのがベストです個々の魚の得点彼のプロセスは、評価される実験条件に盲目です。
    1. 10倍の対物レンズを有する化合物の蛍光顕微鏡で幼虫をスコア。いかなる困難通話用20倍対物レンズを使用してください。

5.スライドとその後の蛍光イメージングに胚をマウントします

  1. 1.5%アガロース/トリカイン溶液を融解し、37℃にもたらします。
  2. トリカイン溶液中にそれを置くことによって撮像される胚を麻酔。
  3. 撮像面にトリカイン溶液の液滴で胚を転送します。必要に応じてガラスボトムディッシュや顕微鏡スライドを使用します。
  4. 撮像面に胚を保持し、過剰トリカイン溶液を除去するためにガラスピペットを使用してください。
  5. 胚の上に溶融アガロース溶液の一滴をオーバーレイ。
  6. 迅速に、アガロースが重合前に、イメージングのために横方向に胚を配向させるために、まつげブラシのような、繊細なツールを使用し、特別な注意を与えます胚を確実にするために、撮像面に沿って平坦化されます。
  7. トリカインソリューションの下になりまし重合アガロースドロップを水没。
  8. 顕微鏡イメージングにライブゼブラフィッシュ胚を施します。

6.変更:ゼブラフィッシュ胚の卵黄嚢に癌細胞を注入

  1. 以前にこのプロトコルの項(3)に記載されているようにマイクロインジェクションディスペンスシステムと注入プレートを準備します。
  2. 以前にこのプロトコルの項(2)に記載されているように対照的な蛍光色素と2つの細胞集団にラベルを付けます。
  3. 卵黄嚢の中に2×10 ^ 7細胞/ mlの10 NL - 5を注入します。各細胞集団から - (200癌細胞100)同一の細胞数を注入する注入量を一定に保ちます
    注:一つは、このアッセイの蛍光血管系を欠く透明なゼブラフィッシュの胚を使用することができます。受動的な脈管構造への粒子の侵入蛍光ビーズ(<10ミクロン)を注入することによってために制御することができ、あるいは、変化させますネイティブ、intravsateしない細胞株。
  4. 以前に(3)このプロトコルの、その後成功した注射用画面セクションで説明したように注入された胚を回復します。
    1. 首尾よく新しい皿に注入した生存可能な胚を選別し、転送するためにステレオスコープを使用してください。
      注:すべての胚は、卵黄に位置する細胞の一貫サイズの質量を持っている必要があります。任意の細胞は卵黄の外側に配置されている場合は質量のサイズが異なる場合、または胚は廃棄されます。
    2. 癌細胞が明らかに卵黄嚢に見られる場合は、新しい皿に実行可能な胚を移します。
  5. 48時間 - 得点、一般的に24の準備ができるまで33℃で皿をインキュベートします。
    注意:この温度は37℃、癌細胞のための理想的な温度、及び28.5°C、ゼブラフィッシュのための理想的な温度との間の妥協点として決定されます。
  6. 、血管内をスコアこのプロトコルの項(4)に記載されているガイドラインに従うのではなく、Cの数をカウントするには成功した尾部領域の血管系に侵入したancer細胞。

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Representative Results

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ここでは、ゼブラフィッシュ胚モデルで一般的に使用される乳癌細胞株( 図1)の血管の侵襲能力を試験しました。厳格な基準は、癌細胞が明らかに溢出した場合は正のイベントのみカウントされ、これは細胞の破片を得点に起因する可能性のある偽陽性を制限するために主に行われていたこれらの異なる細胞株、のために得点溢出に採用されました。

侵入が心臓前方の洞( 表1)への注射後96時間を評価したとき、我々の分析では、行の中で極端に異なることが明らかになりました。試験した7細胞株、MDA-MB-231細胞株を注射したゼブラフィッシュ胚は胚あたりの血管外遊出した腫瘍細胞の最大数は、行の受け入れ転移性質( 図2)と一致する所見を示しました。我々はまた、容易に私そのBT-474細胞を発見しましたこのようなMCF-7、SK-BR-3、およびT-47D細胞のような他の細胞株は、( 図3)低侵襲性であったが、胚の尾部領域にnvaded。好奇心旺盛な発見は、MDA-MB-468細胞を注入したゼブラフィッシュ胚の約半分が、噴門地域で浮腫を有しており、これらは得点されていなかったということでした。我々は血管外遊出のために定量化することができる十分な生存可能な標本を発見する前に、結果として、MDA-MB-468細胞を注入した胚の数を廃棄しました。これらの表向きの違いにもかかわらず、血管外漏出は、試験した各癌細胞株で発生したことは注目に値します。

心臓前方の洞アッセイの変形例として、我々は彼らの血管浸潤能26が異なるMDA-MB-231細胞の2つの集団が同時に発生中の胚の卵黄嚢に注入したことにより競合実験を行いました。コンフルエントな培養条件下で増殖さMDA-MB-231細胞の前注射の循環に血管内での減少を示したため、スコアリング時の胚の尾部領域( 図4)で減少した存在感を持っていました。

細胞株 平均。胚あたり#溢出細胞 範囲
MDA-MB-231(サブコン) 4 0-9
BT-474 1.5 0-4
MDA-MB-468 0.7 0-6
MCF-7 0.6 0-2
T-47D 0.3 0-2
HCC1806 0.2 0-1
SK-BR-3 0.1 0-1

表1:一般的に乳癌細胞株は、2日齢のゼブラフィッシュ胚の心臓前方の洞に注入し、4日後に採点した使用ゼブラフィッシュでの乳癌細胞株の血管浸潤能の比較 。血管系から尾側の領域に侵入した癌細胞は、細胞株当たり10胚で定量しました。血管外遊出した腫瘍細胞の平均数は、範囲と共に示されています。

図1
ゼブラフィッシュ癌細胞溢出アッセイの 図1. ビジュアル概要。このアッセイでは、癌細胞が蛍光色素で標識され、血管系対照的な蛍光レポーターによってマークされて2日齢のゼブラフィッシュ胚の心臓前方の洞に注入。 2次の - さらに4日間、胚の尾部領域に侵入した癌細胞であります獲得し、その後のイメージングのための麻酔アガロース培地に取り付けることができます。この模式的に示した各ステップは、プロトコルのセクションに対応しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
MDA-MB-231細胞と4日間注射後のゼブラフィッシュ胚の 図2. 画像モザイク。(A)と蛍光(B)モザイクを示します。蛍光画像は、緑色の脈管構造を示し、赤色は、癌細胞を示したzスタックの最大投影として示されています。スケールバー、200μmである。(C)胚の尾部領域は、血管外遊出した癌細胞を示すために拡大されます。点状の蛍光標識は、マグニフィカ時に見られていまする。スケールバー、50μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
実験結果の 3 例は、ここで血管外遊出はなく、MCF-7、SK-BR-3、およびT-47D癌細胞を注射した胚におけるBT-474癌細胞を注入した胚で実証されています。矢印は、血管外遊出した細胞を示します。スケールバー、100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4 MDA-MB-231細胞集団の血管内で2日間AFター卵黄嚢注入。(A)グリーン(侵襲)と赤(侵襲性の低い)と卵黄嚢は、標識されたMDA-MB-231細胞。(B)尾に到達するために血管系に侵入し、MDA-MB-231細胞を用いた尾部領域地域。(C)2日間注射26後に尾部領域におけるintravasated MDA-MB-231細胞を用いたゼブラフィッシュ胚の数。スケールバー、250μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

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この技術は、効率的に癌細胞( 図1参照 )の脈管浸潤能を試験するためのゼブラフィッシュモデルを利用します。ここでは、他の研究者は、その後、独自の研究(; - 3図2、 表1を参照)を構築することができ、その上にベースラインを提供するために、乳癌細胞株のパネルに技術を適用しました。 MDA-MB-231細胞は容易にゼブラフィッシュ胚の尾部領域に侵入観察は、血管浸潤を阻害する可能性がある薬剤をテストするためのこの細胞株の理想的になるだろう。例えばHCC1806またはMDA-MB-468細胞のような比較的低侵襲性の細胞株は、そうでなければ血管浸潤を増強するであろう因子を研究するために使用することができます。実験のこれらのタイプは、薬物を含めることを必要とする場合は、一方が治療効果は耐久性であると予想されるかどうかに応じて、配信2つの異なる経路を有しています。癌細胞は、薬物注射の前にして前処理することができます胚または薬物は直接拡散することによって癌細胞に影響を与える胚を収容する水に添加することができます。

私たちの比較では、96時間心臓前方の洞への注入後のゼブラフィッシュ胚の尾部に癌細胞の血管外漏出を分析しました。 MDA-MB-231細胞競合アッセイのために、循環系への血管内には卵黄嚢注射の48時間後に評価しました。分析のために選択された時点では、典型的には、いくつかの実験のために、ピーク溢出は、注射後のちょうど24時間を発生することができ、各細胞株の最適化を必要とします。彼らが結果的に、癌細胞からの蛍光破片が、マクロファージや好中球などの免疫細胞によって貪食することができるがん細胞27と、を注射されたときにゼブラフィッシュ胚は、機能的な自然免疫系を持っていることは注目に値します。 extravasatを獲得しようとすると、自然免疫系の活性は、したがって、潜在的に偽陽性蛍光標識を作成することができますイオン;ケアは、ロバスト適切なチャネルで蛍光を発するだけスコア細胞に与えられなければなりません。現在の癌研究は癌転移28を増強するのに免疫系が関与しているので、ゼブラフィッシュ胚モデルは、癌細胞および自然免疫系との間に発生するクロストークの検査を可能にすることによって、この領域にユニークな洞察を提供することができます。この考えは、最近の研究の対が挙げられます。これらの研究の最初のゼブラフィッシュ内のVEGFR阻害は、癌細胞29からの転移挙動を誘発する好中球の能力を増強することを実証しました。第二の研究は、ヒト癌細胞上の受容体が感知し、ゼブラフィッシュリガンド30への対応、およびそれらの浸潤能と相関癌細胞におけるCXCR4の発現が可能であったとして軸シグナリングCXCR4-CXL12免疫ケモカインは、ゼブラフィッシュ内で無傷であることを示しました動物モデル内。さらに、それはexhibiそのゼブラフィッシュマクロファージを実証しましたテッド人間CXCL12に向かって走化性応答。蛍光標識された好中球31とゼブラフィッシュ胚株は、例えば、さらに、このモデルにおける免疫系による癌細胞の相互作用を探索するために利用することができます。

プロトコルにおけるいくつかの手順は、特に注意が必要です。まず、癌細胞は、胚への注射中に針を目詰まり防止するために、単一細胞懸濁液に解離することが必須です。細胞凝集体は、血液の流れを遮断し、したがって、分析をゆがめる、尾部領域に移動する癌細胞の能力を妨害することができます。細胞凝集体はまた、破裂させるために血管を誘導し、これが発生した場合、これらの地域でのライブ癌細胞の浸潤能を採点することは、信頼性もお勧めでもないことがあります。別の潜在的な問題領域は、蛍光色素で癌細胞を標識に関する。私たちの研究室が運営する実験では、その親油性染料を発見しました、例えばのDiIように、最良の標識を生成する傾向があり、まだその蛍光レベルは、細胞株の間で変化することができます。この理由のために、癌細胞の蛍光標識は、過剰の標識を防止するために、前の胚への注入に最適化されるべきです。それらが標識された後、過剰の色素が離れて癌細胞から洗浄され、そしてこれは、プロトコルのラベリング部に示され、様々な遠心分離工程によって達成されることが重要です。これらの手順は、余分に見えるかもしれませんが、彼らは絶対に必要です。あまりにも多くの蛍光色素が細胞に毒性であるか、または人為的な蛍光バックグラウンドを生成する、血流に漏れ出すことができます。これらの問題の多くは、蛍光タンパク質を発現する癌細胞を使用することによって回避することができ、可能な場合、これらのシステムは、蛍光色素の代わりに使用することが推奨されます。癌の血管外漏出のための胚を採点するとき最後に、すべての条件に一貫性のある基準を適用することが不可欠です。私たちは、目を見つけますスコアリングステップで、少なくとも2人が関与で科学的な厳密さを維持することができます:他の個人が血管外漏出の評決をレンダリングし、評価されている状態にブラインド維持したまま1個体は、スライドを準備し、その結果を記録する使命を帯びています。得点すると、1はテール領域に溢出癌細胞を定量化や比較を容易にするためにバイナリの基準を作成することができます。全細胞は、低倍率( 図3)で識別するのが容易であるものの、蛍光がん細胞を染色することは、非常に高い倍率( 図2c)で表示されます点状のラベルを生成し、後者は、スコアリングのために推奨されます。溢出のより曖昧な例を判断することはテール領域内のすべてのセルの割合として血管外漏出を定量化することは胚への癌細胞の不均等なローディングのために制御することができる共焦点顕微鏡、上の光学スライスの買収によって支援することができます。

ヨーヨーそれは細胞のより高い数を可能にし、したがって、より良いが、細胞集団内の不均一性を収容するように注入ルート嚢LKは心臓前方の洞と異なっています。 図4に示すように、いくつかの差別的に標識された細胞集団は、同時にそれらの浸潤能とパターンを比較するために卵黄嚢に注入することができます。注入された細胞の血管新生能および血管の強化補充は、尾部への癌細胞の侵入を促進することができるが、この態様は、まだ解析されていません。技術的には、卵黄嚢注射はも心臓前方の洞注入よりも実行するのが容易である一方、卵黄嚢は、癌細胞の出口を妨げる可能性が栄養豊富な環境です。卵黄の血管の近くに注入が途中循環に癌細胞を導入することができる、従って、一方は慎重にしくじっ注射をスクリーニングしなければならず、得点から、これらの胚を省略することも可能です。最後に、重要なTでありますOそれは、マウスまたはヒトにおける類似のプライマリサイトを欠いているとして、卵黄微小環境は、やや人工的であることに注意してください。

癌転移を予測しようと、様々なモデル系は、その利点と欠点がないわけではない、とゼブラフィッシュ溢出アッセイも例外ではありません。主な利点として、このアッセイは、機能的な循環系内の血管浸潤能の評価を可能にし、実験的な質問は、わずか数日後に回答することができます。迅速なターンアラウンド時間を与え、そのようなシステムだけでなく、確立された細胞株の攻撃的な挙動を調べるために利用することができるが、ヒト癌患者からも新たに単離されたサンプル。主な欠点は、このモデルは血管浸潤のみに焦点を当てることによって転移カスケードの最初と最後のイベントを省略していることです。また、これらのゼブラフィッシュの胚に注入したヒト癌細胞が明らかに同系環境とtとのいくつかの相互に動作していません彼は結果的に失われることがありストロマ。我々はそれが癌の血管浸潤能に経路26およびケラチン関連タンパク質5-5 32シグナリングカバの役割を示して採用してきたように、これらの制限にもかかわらず、ゼブラフィッシュ胚モデルは、両方の基本および翻訳癌研究における当然の場所を持っています細胞。したがって、このモデルは、進行癌の主要な転移性特徴の調査を支援する可能性を有します。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
100 mm Dishes Corning Incorporated 3160-100
5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass Fisher Brand 13-678-20B
60 mm Dish Corning Incorporated 3160-60
Agarose, Low Melting Fisher BP165-25
Agarose, Molecular Grade Bioline BIO-41026
Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4" A-M Systems, Inc 627000
David Kopf 700C Vertical Pipette Puller Hofstra Group 3600
DMEM Life Technologies 11995-065
Electrode Storage Jar, 1.0 mm World Precision Instruments, Inc E210
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) Fluka A5040
Eyelash Brush Ted Pella, Inc 113
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated Omega Scientific FB-12
Fisherbrand Transfer Pipettes ThermoFisher Scientific 13-711-7M
Gel Loading Pipet Tips Fisher Brand 02-707-181
Glass Bottom Dishes (12.0 mm) ThermoFisher Scientific 150680
Glass Depression Slide VWR 470005-634
Instant Ocean Salt, Sea Salt Pentair IS50
Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72 Heathrow Scientific HS20622B
SP8 Confocal Microscope Leica
Micromanipulator Narishige
Eclipse E600 Nikon
PBS Life Technologies 10010-023
Penicillin-G Potassium Fisher Biotech BP914-100
Petri Plates, 100 mm x 15 mm Fisher Brand  FB0875713
Picospritzer II General Valve Corporation
RPMI 1640 Medium  Life Technologies 11875-093
Streptomycin Sulfate Fisher Biotech BP910-50
Vybrant DiI ThermoFisher Scientific V22885
Vybrant DiO ThermoFisher Scientific V22886
Zebrafish  Georgetown Zebrafish Shared Resources
Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.

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(ゼブラフィッシュにおける癌細胞の血管浸潤能をテストします<em&gt;ゼブラフィッシュ</em&gt;)
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Berens, E. B., Sharif, G. M., Wellstein, A., Glasgow, E. Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio). J. Vis. Exp. (117), e55007, doi:10.3791/55007 (2016).More

Berens, E. B., Sharif, G. M., Wellstein, A., Glasgow, E. Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio). J. Vis. Exp. (117), e55007, doi:10.3791/55007 (2016).

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