Este método utiliza embriões de peixe-zebra para testar de forma eficiente a capacidade invasiva de células de cancro vascular. células cancerosas fluorescentes são injectados para dentro do seio precardiac ou saco vitelino de embriões em desenvolvimento. invasão vascular e celular do cancro do extravasamento é avaliada através de microscopia de fluorescência da região da cauda de 24 a 96 horas mais tarde.
Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.
A doença metastática é uma das principais causas de mortalidade por cancro e diversos mecanismos que permitem a difusão de células de cancro continuam a ser descobertos 1. Para que uma célula cancerosa para metastizar com sucesso, ele deve primeiro invadir através do estroma que rodeia um tumor primário, introduzir (intravasate) para o sistema circulatório, sobreviver em trânsito, saída (extravasamento) a partir da circulação, e, por último, estabelecer uma colónia viáveis no local do órgão distante 2. Intravasation e extravasamento são, assim, passos cruciais na cascata metastática, mas cada célula cancerosa não é inerentemente adepto de interromper e migrando através de junções endoteliais 3. De facto, há uma série de pressões de selecção únicas que circundam invasão vascular de células de cancro e o processo pode ser ainda influenciada por uma variedade de factores endógenos e exógenos 4. Por estas razões, as técnicas que sondam o comportamento agressivo de câncer em estágio avançado, muitas vezes se concentrar em vascular capacidade invasiva como um meio para prever a propagação metastática.
Existem vários sistemas de modelo para facilitar o estudo de invasão vascular de células de cancro in vitro. Os mais utilizados em ensaios in vitro envolvem ou sistemas Transwell para avaliar a migração de células de cancro por meio de uma barreira endotelial ou 5 tecnologia celular Eléctrica-Substrato Impedância de detecção (ECIS) para monitorar a interrupção em tempo real de uma monocamada endotelial intacta por células cancerosas 6. Estes ensaios normalmente não têm a dinâmica dos fluidos e fatores estromais que de outra forma afetar a fixação de células de câncer para uma parede endotelial. Este problema é um pouco iludida por redes vasculares perfusable que surgem a partir da cultura 3D do endotélio com o apoio de células do estroma, e estes sistemas microfluídicos 3D agora representam a vanguarda das atuais in vitro opções de 7,8. Ainda, estas abordagens omitir o microambiente robusta de um sistema circulatório funcionale, portanto, apenas em substituto parcial para os modelos in vivo.
O mais amplamente usado no modelo in vivo de invasão vascular é o rato, em que os ensaios experimentais de metástases são normalmente executada porque eles ocorrem em escalas de tempo relativamente curtos e são geralmente indicativas da capacidade metastática 9. Estes ensaios envolvem injeção direta de células cancerígenas em circulação e, portanto, modelar os estágios finais de metástase, ou seja, extravasamento e célula cancerosa colonização de órgãos. Os ensaios experimentais de metástase diferem de acordo com o local da injecção de células de cancro e em última análise, os órgãos analisados. No primeiro tipo de ensaio, as células cancerosas são injectados na veia da cauda de ratos e sementeira de células de cancro nos pulmões é monitorizada 10,11. O segundo ensaio envolve a execução de injecções intracardíaca para dirigir a sementeira metastática para o microambiente do osso 12-14, mas também no cérebro 15. No terceiro ensaio, cancro cells são injectados no baço, a fim de permitir a colonização do fígado 16, enquanto que a quarta via de administração para dentro da artéria carótida transporta as células cancerosas do cérebro 17,18. Independentemente do método de entrega de células de cancro, a colonização de órgãos é o ponto de extremidade experimental aceite e é geralmente determinada através da luminescência, histologia, ou técnicas baseadas em PCR. Apesar das vantagens fisiológicas de condução de ensaios experimentais de metástases dentro de um hospedeiro murino, estas experiências continuam a exigir semanas a meses para completar e analisar.
O modelo de peixe-zebra (Danio rerio) surgiu recentemente como um novo sistema para estudar a progressão do câncer 19,20, e permite a avaliação de invasão vascular de células cancerígenas dentro de um sistema circulatório funcional através de uma escala de tempo muito mais curto, quando comparado com camundongos 21-24. O método utiliza uma cepa zebrafish transparente que tem a sua endotélio marcado com um fluo recife de coral verderepórter proteína rescent dirigido pelo promotor kdrl, o receptor de peixes-zebra para o factor de crescimento endotelial vascular 25. No ensaio, as células cancerosas são marcadas com um marcador fluorescente vermelha e injectada no seio de 2-precardiac embriões dia de idade. Em qualquer lugar entre 48 a 96 horas após a injecção, as células cancerosas que invadiram fora da vasculatura e para dentro da região caudal de embriões podem ser marcados de forma eficiente num microscópio de fluorescência. Aqui nós aplicamos a técnica de um painel de linhas celulares de cancro da mama humano comumente utilizados para demonstrar grandes diferenças em sua capacidade invasiva vascular. Além disso, nós demonstramos que a mudança do local de injecção ao saco vitelino de embriões permite o estudo de interacções de células heterogéneas, como as populações de células de cancro podem ser diferencialmente marcadas com corantes fluorescentes e injectado em embriões de peixe-zebra que faltam vasculatura fluorescente. Neste último ensaio, as células cancerosas que invadiram a gema e intravasated no vasculature são marcados na região caudal de 24 a 48 horas após a injeção. Devido à eficácia e conveniência de este modelo, peixe-zebra são cada vez mais utilizados para testar rapidamente a capacidade invasiva vascular das células cancerosas sob um ambiente fisiológico.
Esta técnica utiliza o modelo de peixe-zebra para testar de forma eficiente a capacidade invasiva de células de cancro vascular (ver Figura 1). Aqui nós aplicada a técnica de um painel de linhas celulares de cancro da mama a fim de fornecer uma linha de base sobre a qual outros investigadores pode então construir os seus próprios estudos (ver Tabela 1 e Figuras 2 – 3). A observação de que as células MDA-MB-231 facilmente invadidas na região caudal de embriões…
The authors have nothing to disclose.
We thank Peter Johnson of the Georgetown University Microscopy Core for assistance with imaging the zebrafish embryos. The Microscopy & Imaging Shared Resource and the Zebrafish Shared Resource are partially supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. This work was also supported by NIH/NCI CA71508 (AW) and CA177466 (AW).
0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
100mm Dishes | Corning Incorporated | 3160-100 | |
5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass | Fisher Brand | 13-678-20B | |
60 mm Dish | Corning Incorporated | 3160-60 | |
Agarose, Low Melting | Fisher | BP165-25 | |
Agarose, Molecular Grade | Bioline | BIO-41026 | |
Capillary Glass, Standard, 1.2MM x 0.68MM, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
David Kopf 700C Vertical Pipette Puller | Hofstra Group | 3600 | |
DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
Electrode Storage Jar, 1.0MM | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) | Fluka | A5040 | |
Eyelash Brush | Ted Pella, Inc | 113 | |
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
Fisherbrand Transfer Pipettes | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
Gel Loading Pipet Tips | Fisher Brand | 02-707-181 | |
Glass Bottom Dishes (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
Glass Depression Slide | VWR | 470005-634 | |
Instant Ocean Salt, Sea Salt | Pentair | IS50 | |
Latex Rubber Bulbs, 2mL, Pack of 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
Micromanipulator | Narishige | ||
Eclipse E600 | Nikon | ||
PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
Penicillin-G Potassium | Fisher Biotech | BP914-100 | |
Petri Plates, 100mm x 15mm | Fisher Brand | FB0875713 | |
Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
Streptomycin Sulfate | Fisher Biotech | BP910-50 | |
Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
Zebrafish | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |