Questo metodo utilizza zebrafish embrioni per testare efficacemente la capacità invasiva vascolare delle cellule tumorali. le cellule tumorali fluorescenti sono iniettati nel precardiac seno o il sacco vitellino di embrioni in via di sviluppo. invasione vascolare delle cellule tumorali e stravaso è valutata mediante microscopia a fluorescenza della regione di coda 24-96 ore più tardi.
Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.
La malattia metastatica è una delle principali cause di mortalità per cancro e molti meccanismi che consentono la diffusione delle cellule tumorali rimangono da scoprire 1. Al fine di una cellula tumorale a metastatizzare con successo, deve prima di invadere attraverso lo stroma che circonda un tumore primario, entra (intravasate) nel sistema circolatorio, sopravvivere in transito, uscita (stravaso) dalla circolazione, e, infine, stabilire una colonia vitale presso il sito organo lontana 2. Intravasation e stravaso sono quindi una tappa fondamentale verso la cascata metastatica, eppure ogni cellula tumorale non è intrinsecamente abili a interrompere e la migrazione attraverso giunzioni endoteliali 3. In realtà, ci sono una serie di pressioni selettive uniche che circondano invasione vascolare delle cellule tumorali e il processo può essere ulteriormente influenzata da una varietà di fattori endogeni ed esogeni 4. Per queste ragioni, le tecniche che analizzano il comportamento aggressivo di cancro in fase avanzata spesso si concentrano su vascular capacità invasiva come un mezzo per prevedere diffusione metastatica.
Vari sistemi modello esistono per facilitare lo studio di invasione vascolare delle cellule tumorali in vitro. Il più utilizzato in vitro coinvolgono sia sistemi transwell per valutare la migrazione delle cellule tumorali attraverso una tecnologia elettrica Cell-substrato impedenza di rivelazione (ECIS) barriera endoteliale 5 o per monitorare l'interruzione in tempo reale di un monostrato endoteliale intatto dalle cellule tumorali 6. Questi test in genere non hanno la dinamica dei fluidi e fattori stromali che altrimenti un impatto attaccamento delle cellule tumorali ad una parete endoteliale. Questo problema è in qualche modo aggirato da reti vascolari perfusable che nascono dalla cultura 3D di endoteli con il supporto di cellule stromali, e questi sistemi microfluidici 3D ora rappresentano la prima linea di corrente in vitro opzioni 7,8. Tuttavia, questi approcci omettono microambiente robusta di un sistema circolatorio funzionantee quindi solo in parte sostituto per modelli in vivo.
Il più utilizzato nel modello vivo di invasione vascolare è il mouse, in cui saggi metastasi sperimentali sono comunemente eseguiti perché si verificano in tempi relativamente brevi e sono generalmente indicativi di capacità metastatica 9. Questi test comportano l'iniezione diretta delle cellule tumorali in circolazione e quindi modellare le fasi finali della metastasi, cioè stravaso e delle cellule del cancro della colonizzazione degli organi. I saggi metastasi sperimentali variano a seconda del sito di iniezione delle cellule tumorali e gli organi infine analizzati. Nel primo tipo di saggio, cellule tumorali vengono iniettate nella vena della coda di topi e semina delle cellule del cancro ai polmoni è monitorata 10,11. Il secondo saggio comprende l'esecuzione di iniezioni intracardiaci per dirigere semina metastatico verso il microambiente del midollo 12-14, ma anche il cervello 15. Nel terzo test, il cancro cells vengono iniettati milza per permettere la colonizzazione del fegato 16 mentre il quarto percorso di consegna nella carotide trasporta cellule tumorali al cervello 17,18. Indipendentemente dal metodo di consegna delle cellule tumorali, la colonizzazione organo è il punto finale sperimentale accettato e viene generalmente determinato tramite luminescenza, istologia, o tecniche di PCR-based. Nonostante i vantaggi fisiologici di condurre test di metastasi sperimentali all'interno di un host murino, questi esperimenti richiedono ancora settimane o mesi per completare e analizzare.
Il modello di zebrafish (Danio rerio) ha recentemente emerso come un nuovo sistema per studiare la progressione del cancro 19,20, e permette per la valutazione di invasione vascolare delle cellule tumorali all'interno di un sistema circolatorio funzionale su un arco di tempo molto più breve se confrontato con i topi 21-24. Il metodo utilizza un ceppo zebrafish trasparente che ha la sua endoteli etichettato con una barriera verde fluo corallinagiornalista proteine fluore- guidato dal promotore kdrl, il recettore zebrafish per endoteliali fattore di crescita vascolare 25. Nel saggio, le cellule tumorali sono etichettati con un marcatore fluorescente rosso e iniettato nel seno precardiac di 2 giorni embrioni. Ovunque tra 48 a 96 ore dopo l'iniezione, le cellule tumorali che hanno invaso fuori del sistema vascolare e nella regione caudale embrioni possono essere lanciati in modo efficiente su un microscopio a fluorescenza. Qui si applica la tecnica di un panel di linee di cellule umane di cancro al seno comunemente usati per dimostrare forti differenze nella loro capacità invasiva vascolare. Inoltre, abbiamo dimostrato che cambiare il sito di iniezione al sacco embrionale tuorlo permette per lo studio delle interazioni cellulari eterogenee, come le popolazioni di cellule del cancro possono essere etichettati con differenziale coloranti fluorescenti e iniettate in embrioni di zebrafish prive di vascolarizzazione fluorescente. In quest'ultimo test, le cellule tumorali che hanno invaso il tuorlo e intravasated nella vasculature sono segnato nella regione caudale 24-48 ore dopo l'iniezione. A causa l'efficacia e la convenienza di questo modello, zebrafish sono sempre più impiegati per testare rapidamente la capacità invasiva vascolare delle cellule tumorali in un ambiente fisiologico.
Questa tecnica utilizza il modello zebrafish per testare efficacemente la capacità invasiva vascolare delle cellule tumorali (vedi Figura 1). Qui abbiamo applicato la tecnica ad un pannello di linee cellulari di cancro al seno, al fine di fornire una base su cui altri ricercatori possono costruire i propri studi (vedi Tabella 1; figure 2 – 3). L'osservazione che MDA-MB-231 cellule prontamente hanno invaso nella regione caudale embrioni di zebrafish renderebbe quest…
The authors have nothing to disclose.
We thank Peter Johnson of the Georgetown University Microscopy Core for assistance with imaging the zebrafish embryos. The Microscopy & Imaging Shared Resource and the Zebrafish Shared Resource are partially supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. This work was also supported by NIH/NCI CA71508 (AW) and CA177466 (AW).
0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
100mm Dishes | Corning Incorporated | 3160-100 | |
5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass | Fisher Brand | 13-678-20B | |
60 mm Dish | Corning Incorporated | 3160-60 | |
Agarose, Low Melting | Fisher | BP165-25 | |
Agarose, Molecular Grade | Bioline | BIO-41026 | |
Capillary Glass, Standard, 1.2MM x 0.68MM, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
David Kopf 700C Vertical Pipette Puller | Hofstra Group | 3600 | |
DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
Electrode Storage Jar, 1.0MM | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) | Fluka | A5040 | |
Eyelash Brush | Ted Pella, Inc | 113 | |
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
Fisherbrand Transfer Pipettes | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
Gel Loading Pipet Tips | Fisher Brand | 02-707-181 | |
Glass Bottom Dishes (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
Glass Depression Slide | VWR | 470005-634 | |
Instant Ocean Salt, Sea Salt | Pentair | IS50 | |
Latex Rubber Bulbs, 2mL, Pack of 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
Micromanipulator | Narishige | ||
Eclipse E600 | Nikon | ||
PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
Penicillin-G Potassium | Fisher Biotech | BP914-100 | |
Petri Plates, 100mm x 15mm | Fisher Brand | FB0875713 | |
Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
Streptomycin Sulfate | Fisher Biotech | BP910-50 | |
Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
Zebrafish | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |