Test de la capacité vasculaire invasive des cellules cancéreuses dans Zebrafish (<em> Danio rerio</em>)
Summary
Cette méthode utilise des embryons de poisson zèbre pour tester efficacement la capacité invasive vasculaire des cellules cancéreuses. les cellules cancéreuses fluorescentes sont injectées dans le sinus précardiaque ou de sac vitellin d'embryons en développement. cellule cancéreuse invasion vasculaire et une extravasation est évaluée par microscopie de fluorescence de la région de la queue 24-96 heures plus tard.
Abstract
Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.
Introduction
La maladie métastatique est une cause majeure de mortalité et de nombreux mécanismes qui permettent la diffusion des cellules cancéreuses restent à découvrir 1 cancer. Pour une cellule cancéreuse à métastaser avec succès, il doit tout d'abord envahir à travers le stroma entourant la tumeur primaire, entrer (intravasate) dans le système circulatoire, à survivre dans le transit, la sortie (extravasation) à partir de la circulation, et enfin d'établir une colonie viable sur le site de l' organe distant 2. Intravasculaire et extravasation sont donc des étapes cruciales dans la cascade métastatique, mais toutes les cellules du cancer ne sont pas intrinsèquement aptes à perturber et à migrer à travers les jonctions endothéliales 3. En fait, il existe une série de pressions de sélection unique qui entourent la cellule cancéreuse une invasion vasculaire et le processus peut être encore influencée par une variété de facteurs endogènes et exogènes 4. Pour ces raisons, les techniques qui sondent le comportement agressif du cancer de stade avancé se concentrent souvent sur vasculaire capacité invasive comme un moyen de prédire la dissémination métastatique.
Divers systèmes de modèles existent pour faciliter l'étude des cellules cancéreuses envahissement vasculaire in vitro. Le plus utilisé dans des essais in vitro impliquent soit des systèmes Transwell pour évaluer la migration des cellules cancéreuses à travers une barrière endothéliale 5 ou de la technologie électrique Cell-Substrat Impedance Sensing (ECIS) pour surveiller en temps réel les perturbations d'une monocouche endothéliale intacte par les cellules cancéreuses 6. Ces dosages manquent généralement de la dynamique des fluides et des facteurs de stroma qui seraient par ailleurs une incidence sur l'attachement des cellules cancéreuses à une paroi endothéliale. Cette question est quelque peu contournée par des réseaux vasculaires irrigables qui découlent de la culture 3D de l' endothélium à l' appui des cellules stromales, et ces systèmes microfluidiques 3D représentent désormais l'avant – garde des options actuelles in vitro 7,8. Pourtant, ces approches omettent le microenvironnement robuste d'un système circulatoire fonctionnelet donc seulement en remplaçant une partie des modèles in vivo.
Le plus largement utilisé dans le modèle in vivo de l' invasion vasculaire est la souris, dans lequel des essais de métastases expérimentales sont généralement effectuées parce qu'ils se produisent sur des échelles de temps relativement courtes et sont généralement indicatives de la capacité métastatique 9. Ces essais impliquent l'injection directe de cellules cancéreuses en circulation, et donc de modéliser les étapes d'extrémité des métastases, à savoir une extravasation et une cellule cancéreuse colonisation des organes. Les essais de métastases expérimentales diffèrent en fonction du site d'injection des cellules cancéreuses et les organes finalement analysés. Dans le premier type d'essai, les cellules cancéreuses sont injectées dans la veine caudale de la souris et l' ensemencement des cellules cancéreuses dans les poumons est contrôlée 10,11. Le second test consiste à effectuer des injections intracardiaques pour semis direct métastatique vers le microenvironnement osseux 12 à 14, mais aussi le cerveau 15. Dans le troisième essai, le cancer du cells sont injectées dans la rate, afin de permettre la colonisation du foie 16 tandis que la quatrième voie de livraison dans l'artère carotide transporte des cellules cancéreuses du cerveau 17,18. Indépendamment de la méthode de distribution des cellules cancéreuses, la colonisation d'organes est le point final expérimental accepté et est généralement déterminée par luminescence, histologie, ou des techniques basées sur la PCR. Malgré les avantages physiologiques de la réalisation d'essais de métastases expérimentales dans un hôte murin, ces expériences ont encore besoin de semaines à quelques mois pour terminer et à analyser.
Le poisson zèbre (Danio rerio) modèle a récemment émergé comme un nouveau système pour étudier la progression du cancer 19,20, et permet l'évaluation de la cellule cancéreuse invasion vasculaire dans un système circulatoire fonctionnelle sur une échelle de temps beaucoup plus courte en comparaison avec des souris 21-24. Le procédé utilise une souche zebrafish transparente qui a son endothélium marqué par un fluo des récifs coralliens verterescent rapporteur de la protéine entraînée par le promoteur kdrl, le récepteur du poisson zèbre pour endothélial vasculaire facteur de croissance 25. Dans le dosage, les cellules cancéreuses sont marquées avec un marqueur fluorescent rouge et injecté dans le sinus précardiaque de 2 jours embryons âgés. Environ entre 48-96 heures après l'injection, les cellules cancéreuses qui ont envahi par les vaisseaux sanguins et dans la région caudale d'embryons peuvent être marqués de manière efficace sur un microscope à fluorescence. Ici, nous appliquons la technique à un groupe de lignes couramment utilisées cellulaires du cancer du sein humain pour démontrer des différences marquées dans leur capacité invasive vasculaire. De plus, nous démontrons que la modification du site d'injection dans le sac vitellin d'embryons permet l'étude des interactions cellulaires hétérogènes, comme des populations de cellules cancéreuses peuvent être marqués de façon différentielle avec des colorants fluorescents et injectés dans des embryons de poisson zèbre dépourvus de système vasculaire fluorescent. Dans ce dernier essai, les cellules cancéreuses qui ont envahi le jaune d'oeuf et dans le intravasated vasculature sont marqués dans la région caudale 24-48 h après l'injection. En raison de l'efficacité et de commodité de ce modèle, les poissons zèbres sont de plus en plus utilisé pour tester rapidement la capacité invasive vasculaire des cellules cancéreuses sous un paramètre physiologique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette technique utilise le modèle zebrafish pour tester efficacement la capacité invasive vasculaire des cellules cancéreuses (voir Figure 1). Ici , nous avons appliqué la technique à un panel de lignées cellulaires de cancer du sein, afin de fournir une base sur laquelle d' autres chercheurs peuvent alors construire leurs propres études (voir le tableau 1, figures 2 – 3). L'observation que MDA-MB-231 cellules facilement envahi dans la région caudale d&#…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Peter Johnson of the Georgetown University Microscopy Core for assistance with imaging the zebrafish embryos. The Microscopy & Imaging Shared Resource and the Zebrafish Shared Resource are partially supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. This work was also supported by NIH/NCI CA71508 (AW) and CA177466 (AW).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 100mm Dishes | Corning Incorporated | 3160-100 | |
| 5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass | Fisher Brand | 13-678-20B | |
| 60 mm Dish | Corning Incorporated | 3160-60 | |
| Agarose, Low Melting | Fisher | BP165-25 | |
| Agarose, Molecular Grade | Bioline | BIO-41026 | |
| Capillary Glass, Standard, 1.2MM x 0.68MM, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
| David Kopf 700C Vertical Pipette Puller | Hofstra Group | 3600 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Electrode Storage Jar, 1.0MM | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) | Fluka | A5040 | |
| Eyelash Brush | Ted Pella, Inc | 113 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| Fisherbrand Transfer Pipettes | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Brand | 02-707-181 | |
| Glass Bottom Dishes (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
| Glass Depression Slide | VWR | 470005-634 | |
| Instant Ocean Salt, Sea Salt | Pentair | IS50 | |
| Latex Rubber Bulbs, 2mL, Pack of 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
| SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| Micromanipulator | Narishige | ||
| Eclipse E600 | Nikon | ||
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Penicillin-G Potassium | Fisher Biotech | BP914-100 | |
| Petri Plates, 100mm x 15mm | Fisher Brand | FB0875713 | |
| Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Biotech | BP910-50 | |
| Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| Zebrafish | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. | |||
References
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