Summary

Test de la capacité vasculaire invasive des cellules cancéreuses dans Zebrafish (<em> Danio rerio</em>)

Published: November 03, 2016
doi:

Summary

Cette méthode utilise des embryons de poisson zèbre pour tester efficacement la capacité invasive vasculaire des cellules cancéreuses. les cellules cancéreuses fluorescentes sont injectées dans le sinus précardiaque ou de sac vitellin d'embryons en développement. cellule cancéreuse invasion vasculaire et une extravasation est évaluée par microscopie de fluorescence de la région de la queue 24-96 heures plus tard.

Abstract

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

Introduction

La maladie métastatique est une cause majeure de mortalité et de nombreux mécanismes qui permettent la diffusion des cellules cancéreuses restent à découvrir 1 cancer. Pour une cellule cancéreuse à métastaser avec succès, il doit tout d'abord envahir à travers le stroma entourant la tumeur primaire, entrer (intravasate) dans le système circulatoire, à survivre dans le transit, la sortie (extravasation) à partir de la circulation, et enfin d'établir une colonie viable sur le site de l' organe distant 2. Intravasculaire et extravasation sont donc des étapes cruciales dans la cascade métastatique, mais toutes les cellules du cancer ne sont pas intrinsèquement aptes à perturber et à migrer à travers les jonctions endothéliales 3. En fait, il existe une série de pressions de sélection unique qui entourent la cellule cancéreuse une invasion vasculaire et le processus peut être encore influencée par une variété de facteurs endogènes et exogènes 4. Pour ces raisons, les techniques qui sondent le comportement agressif du cancer de stade avancé se concentrent souvent sur vasculaire capacité invasive comme un moyen de prédire la dissémination métastatique.

Divers systèmes de modèles existent pour faciliter l'étude des cellules cancéreuses envahissement vasculaire in vitro. Le plus utilisé dans des essais in vitro impliquent soit des systèmes Transwell pour évaluer la migration des cellules cancéreuses à travers une barrière endothéliale 5 ou de la technologie électrique Cell-Substrat Impedance Sensing (ECIS) pour surveiller en temps réel les perturbations d'une monocouche endothéliale intacte par les cellules cancéreuses 6. Ces dosages manquent généralement de la dynamique des fluides et des facteurs de stroma qui seraient par ailleurs une incidence sur l'attachement des cellules cancéreuses à une paroi endothéliale. Cette question est quelque peu contournée par des réseaux vasculaires irrigables qui découlent de la culture 3D de l' endothélium à l' appui des cellules stromales, et ces systèmes microfluidiques 3D représentent désormais l'avant – garde des options actuelles in vitro 7,8. Pourtant, ces approches omettent le microenvironnement robuste d'un système circulatoire fonctionnelet donc seulement en remplaçant une partie des modèles in vivo.

Le plus largement utilisé dans le modèle in vivo de l' invasion vasculaire est la souris, dans lequel des essais de métastases expérimentales sont généralement effectuées parce qu'ils se produisent sur des échelles de temps relativement courtes et sont généralement indicatives de la capacité métastatique 9. Ces essais impliquent l'injection directe de cellules cancéreuses en circulation, et donc de modéliser les étapes d'extrémité des métastases, à savoir une extravasation et une cellule cancéreuse colonisation des organes. Les essais de métastases expérimentales diffèrent en fonction du site d'injection des cellules cancéreuses et les organes finalement analysés. Dans le premier type d'essai, les cellules cancéreuses sont injectées dans la veine caudale de la souris et l' ensemencement des cellules cancéreuses dans les poumons est contrôlée 10,11. Le second test consiste à effectuer des injections intracardiaques pour semis direct métastatique vers le microenvironnement osseux 12 à 14, mais aussi le cerveau 15. Dans le troisième essai, le cancer du cells sont injectées dans la rate, afin de permettre la colonisation du foie 16 tandis que la quatrième voie de livraison dans l'artère carotide transporte des cellules cancéreuses du cerveau 17,18. Indépendamment de la méthode de distribution des cellules cancéreuses, la colonisation d'organes est le point final expérimental accepté et est généralement déterminée par luminescence, histologie, ou des techniques basées sur la PCR. Malgré les avantages physiologiques de la réalisation d'essais de métastases expérimentales dans un hôte murin, ces expériences ont encore besoin de semaines à quelques mois pour terminer et à analyser.

Le poisson zèbre (Danio rerio) modèle a récemment émergé comme un nouveau système pour étudier la progression du cancer 19,20, et permet l'évaluation de la cellule cancéreuse invasion vasculaire dans un système circulatoire fonctionnelle sur une échelle de temps beaucoup plus courte en comparaison avec des souris 21-24. Le procédé utilise une souche zebrafish transparente qui a son endothélium marqué par un fluo des récifs coralliens verterescent rapporteur de la protéine entraînée par le promoteur kdrl, le récepteur du poisson zèbre pour endothélial vasculaire facteur de croissance 25. Dans le dosage, les cellules cancéreuses sont marquées avec un marqueur fluorescent rouge et injecté dans le sinus précardiaque de 2 jours embryons âgés. Environ entre 48-96 heures après l'injection, les cellules cancéreuses qui ont envahi par les vaisseaux sanguins et dans la région caudale d'embryons peuvent être marqués de manière efficace sur un microscope à fluorescence. Ici, nous appliquons la technique à un groupe de lignes couramment utilisées cellulaires du cancer du sein humain pour démontrer des différences marquées dans leur capacité invasive vasculaire. De plus, nous démontrons que la modification du site d'injection dans le sac vitellin d'embryons permet l'étude des interactions cellulaires hétérogènes, comme des populations de cellules cancéreuses peuvent être marqués de façon différentielle avec des colorants fluorescents et injectés dans des embryons de poisson zèbre dépourvus de système vasculaire fluorescent. Dans ce dernier essai, les cellules cancéreuses qui ont envahi le jaune d'oeuf et dans le intravasated vasculature sont marqués dans la région caudale 24-48 h après l'injection. En raison de l'efficacité et de commodité de ce modèle, les poissons zèbres sont de plus en plus utilisé pour tester rapidement la capacité invasive vasculaire des cellules cancéreuses sous un paramètre physiologique.

Protocol

Déclaration d'éthique: embryons de poisson zèbre ont été générés selon un protocole IACUC approuvé. Ces expériences ont été réalisées en conformité avec les recommandations du Comité sur les soins et l'utilisation des animaux de l'Université de Georgetown. 1. Organiser Embryons pour injection et créer Stock Solutions Générer des larves de poisson zèbre nécessaire pour évaluer la cellule cancéreuse invasion vasculaire. Mettre en place pa…

Representative Results

Ici nous avons testé la capacité invasive vasculaire des lignées cellulaires de cancer du sein couramment utilisés dans un modèle d'embryon de poisson zèbre (figure 1). critères rigoureux ont été utilisés dans la notation extravasation pour ces différentes lignées cellulaires, où les événements positifs ont été seulement comptés si les cellules cancéreuses avaient clairement extravasation, cet être fait surtout de limiter les faux positifs qui pou…

Discussion

Cette technique utilise le modèle zebrafish pour tester efficacement la capacité invasive vasculaire des cellules cancéreuses (voir Figure 1). Ici , nous avons appliqué la technique à un panel de lignées cellulaires de cancer du sein, afin de fournir une base sur laquelle d' autres chercheurs peuvent alors construire leurs propres études (voir le tableau 1, figures 2 – 3). L'observation que MDA-MB-231 cellules facilement envahi dans la région caudale d&#…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Peter Johnson of the Georgetown University Microscopy Core for assistance with imaging the zebrafish embryos. The Microscopy & Imaging Shared Resource and the Zebrafish Shared Resource are partially supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. This work was also supported by NIH/NCI CA71508 (AW) and CA177466 (AW).

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
100mm Dishes Corning Incorporated 3160-100
5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass Fisher Brand 13-678-20B
60 mm Dish Corning Incorporated 3160-60
Agarose, Low Melting Fisher BP165-25
Agarose, Molecular Grade Bioline BIO-41026
Capillary Glass, Standard, 1.2MM x 0.68MM, 4" A-M Systems, Inc 627000
David Kopf 700C Vertical Pipette Puller Hofstra Group 3600
DMEM Life Technologies 11995-065
Electrode Storage Jar, 1.0MM World Precision Instruments, Inc E210
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) Fluka A5040
Eyelash Brush Ted Pella, Inc 113
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated Omega Scientific FB-12
Fisherbrand Transfer Pipettes ThermoFisher Scientific 13-711-7M
Gel Loading Pipet Tips Fisher Brand 02-707-181
Glass Bottom Dishes (12.0 mm) ThermoFisher Scientific 150680
Glass Depression Slide VWR 470005-634
Instant Ocean Salt, Sea Salt Pentair IS50
Latex Rubber Bulbs, 2mL, Pack of 72 Heathrow Scientific HS20622B
SP8 Confocal Microscope Leica
Micromanipulator Narishige
Eclipse E600 Nikon
PBS Life Technologies 10010-023
Penicillin-G Potassium Fisher Biotech BP914-100
Petri Plates, 100mm x 15mm Fisher Brand  FB0875713
Picospritzer II General Valve Corporation
RPMI 1640 Medium  Life Technologies 11875-093
Streptomycin Sulfate Fisher Biotech BP910-50
Vybrant DiI ThermoFisher Scientific V22885
Vybrant DiO ThermoFisher Scientific V22886
Zebrafish  Georgetown Zebrafish Shared Resources
Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.

References

  1. Cummings, M. C., et al. Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies. Am J Path. 232, 23-31 (2014).
  2. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  3. Reymond, N., d’Água, B. B., Ridley, A. J. Crossing the endothelial barrier during metastasis. Nat Rev Cancer. 13 (12), 858-870 (2013).
  4. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  5. Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Method Enzymol. 409, 625-642 (2006).
  6. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  7. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (1), 214-219 (2015).
  8. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
  9. Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
  10. Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J Vis Exp. (42), (2010).
  11. Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
  12. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (64), e4260 (2012).
  13. Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Res. 48 (23), 6876-6881 (1988).
  14. Minn, A. J., et al. Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors. J Clin Invest. 115 (1), 44-55 (2005).
  15. Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
  16. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. (91), e51677 (2014).
  17. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Med. 16 (1), 116-122 (2010).
  18. Hasegawa, H., Ushio, Y., Hayakawa, T., Yamada, K., Mogami, H. Changes of the blood-brain barrier in experimental metastatic brain tumors. J Neurosurg. 59 (2), 304-310 (1983).
  19. Amatruda, J. F., Shepard, J. L., Stern, H. M., Zon, L. I. Zebrafish as a cancer model system. Cancer Cell. 1 (3), 229-231 (2002).
  20. Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Res. 6 (5), 685-694 (2008).
  21. Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
  22. Stoletov, K., et al. Visualizing extravasation dynamics of metastatic tumor cells. J Cell Sci. 123 (13), 2332-2341 (2010).
  23. Kanada, M., Zhang, J., Yan, L., Sakurai, T., Terakawa, S. Endothelial cell-initiated extravasation of cancer cells visualized in zebrafish. PeerJ. , (2014).
  24. Teng, Y., Xie, X., Walker, S., White, D. T., Mumm, J. S., Cowell, J. K. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC Cancer. 13 (453), (2013).
  25. Cross, L. M., Cook, M. A., Lin, S., Chen, J. -. N., Rubinstein, A. L. Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay. Arterioscl Throm Vas. 23 (5), 911-912 (2003).
  26. Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34, 5879-5889 (2015).
  27. Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases. Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).
  28. Kitamura, T., Qian, B. -. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
  29. He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
  30. Tulotta, C., et al. Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model. Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).
  31. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  32. Berens, E. B., et al. Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion. Oncogene. , (2016).

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Cite This Article
Berens, E. B., Sharif, G. M., Wellstein, A., Glasgow, E. Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio). J. Vis. Exp. (117), e55007, doi:10.3791/55007 (2016).

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