Introduction
الكائنات العليا تحتوي على مجتمعات معقدة من أنواع الخلايا المتميزة التي تتعاون لتحقيق المزيد من الوظائف المعقدة. على سبيل المثال، وأورام تحتوي ليس فقط الخلايا السرطانية، ولكن أيضا الخلايا الليفية، الخلايا التي تشكل الأوعية الدموية، والخلايا في كثير من الأحيان المناعة تتسرب 1؛ يحتوي الدم على خليط معقد من عشرات الأنواع الفرعية الخلايا المناعية 2. ويمكن أن تتألف حتى خطوط خلايا مستنبتة من القطعان متعددة، مثل اللمعية وفرعية القاعدية من خلايا سرطان الثدي 3. وعلاوة على ذلك، أنواع الخلايا المتميزة التي تتعايش يمكن أن تظهر الأيض "التعاون". على سبيل المثال، في الدماغ، ويعتقد أن الخلايا النجمية لتحويل الجلوكوز إلى اللاكتات، وهو بعد ذلك "تغذية" إلى الخلايا العصبية التي تؤكسد هذه الركيزة 4؛ اللمفاويات التائية هي في بعض السياقات التي تعتمد على الخلايا الجذعية المجاورة كمصدر للالسيستين 5؛ والخلايا السرطانية قد تتعاون مع أسوالليفية ciated في الأورام 6. لفهم سلوك الأيض مثل هذه الأنظمة، لا بد من فصل وقياس الأنشطة الأيضية لمختلف أنواع الخلايا الحالية.
إلى حد بعيد الأسلوب الأكثر استخداما على نطاق واسع لفصل أنواع الخلايا غير مضان تنشيط الفرز الخلية. هذه الطريقة تنطبق على نطاق واسع، شريطة أن يكون نوع من الخلايا أو دولة من الفائدة يمكن أن يكون "المسمى" باستخدام الأجسام المضادة الفلورسنت والتعبير عن البروتينات الفلورية هندسيا، أو الأصباغ الأخرى. خيار واحد هو أن خلايا أنواع منفصلة في البداية من خلال فارز الخلية، وإعادة ثقافة أنواع الخلايا الفردية التي تم الحصول عليها، ثم قم بإجراء دراسات التمثيل الغذائي لهذه الثقافات 7. ومع ذلك، وهذا أمر ممكن فقط إذا كان نوع من الخلايا أو النمط الظاهري مستقرة في ظروف ثقافة، ولا يمكن التقاط السلوك عابرة مثل دول دورة الخلية، ولا التعاون الأيض في المشترك الثقافات. لمثل هذه الحالات، يجب أن تقاس عملية التمثيل الغذائي مباشرة على ذلكخلايا rted. هذا هو التحدي منذ الخلية فرز إجراء تخضع خلايا للضغوط التي قد تشوه عملية الأيض لديهم 8، ونحن ندرك فقط عدد قليل من الدراسات اتخاذ هذا النهج 9 و 10. على وجه الخصوص، وجدنا أن نواتج رئيسية مثل الأحماض الأمينية قد تسرب من خلايا أبقى في الخلية فرز العازلة، بحيث قياسات وفرة الأيض المطلقة لم تعد موثوقة 11 (على الرغم من أن المقارنة النسبية بين كسور فرزها قد يكون لا يزال قيما).
للتحايل على هذه القضايا، ونحن تسمية الخلايا مع نظائر مستقرة قبل الفرز، والتركيز على أجهزة الإنترنت النقالة في الأيض الخلوية، بدلا من وفرة الأيض. منذ تتشكل أجهزة الإنترنت النقالة على مدى فترات زمنية أطول، ينبغي أن تكون أقل تأثرا التعرض على المدى القصير لشروط الفرز. نحن قياس أجهزة الإنترنت النقالة باستخدام كامل المسح الضوئي عالية الدقة الطيفي، وهي حساسة بما يكفي لتوفير داتا على مئات من المركبات بدءا من حوالي 500،000 خلايا فرزها، والتي تتطلب حوالي 30-60 دقيقة من الخلايا وقت الفرز. مقارنة بين "وهمية فرز" السيطرة (خلايا مرت الصك خلية فارز دون النابضة أية مجموعة من السكان معين) واستخراج المستقلب مباشرة من يرصد الطبق الثقافة للتأكد من أن أجهزة الإنترنت النقالة المرصودة هي تمثيلية من تلك الموجودة في الثقافة الأصلية. اعتمادا على اختيار استشفاف النظائر المستقرة، ومختلف المسارات الأيضية يمكن دراستها مع هذا الأسلوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. المستقلب استخراج
- استخراج من الطبق
- خلايا الثقافة في لوحة 6 جيدا في يثلث في النظائر وصفت وسائل الإعلام ثقافة مستقرة + ملاحق مدال (المصل أو المكملات النمو الأخرى) حتى تصبح الخلايا 75٪ متموجة.
ملاحظة: هنا ثقافة خلايا هيلا لمدة 48 ساعة في RPMI تحتوي على 40٪ U- 13 C-الجلوكوز و 70٪ U- 13 C، 15 N2-الجلوتامين و 5٪ مدال FBS (مصل بقري جنيني). يستخدم مدال FBS للتخلص من نواتج الأيض الوزن الجزيئي الصغيرة التي قد تلوث وسائل الإعلام المسمى. ينصح زراعة الخلايا في ملحق مدال قبل التجربة الحقيقية لضمان الخلايا تنمو عادة في المتوسط. ومدال ملاحق في 0.15 حل M كلوريد الصوديوم بين عشية وضحاها باستخدام جلد الثعبان غسيل الكلى الأنابيب. - في يوم سائل الإعلام والثقافة استخراج فضلات، وشطف الآبار مرتين مع HBSS 500 ميكرولتر البارد ثم تخلص منه.
ملاحظة: هنا استخدام HBSS التي تحتوي على 40٪ U-13 C-الجلوكوز لأنه هو أيضا في وسائل الإعلام والثقافة. - إضافة 600 ميكرولتر 100٪ الميثانول قبل تبريده على الثلج الجاف.
- نقل طبق لتجف الجليد وإزالة المواد خلية مع مكشطة الخلية.
- بعناية ماصة مقتطفات الخلية إلى أنبوب microcentrifuge ومخزن في -80 درجة مئوية حتى تحليل الطيف الكتلي.
- خلايا الثقافة في لوحة 6 جيدا في يثلث في النظائر وصفت وسائل الإعلام ثقافة مستقرة + ملاحق مدال (المصل أو المكملات النمو الأخرى) حتى تصبح الخلايا 75٪ متموجة.
- استخراج الخلايا مرتبة وهمية
- خلايا الثقافة في صحن 100 ملم في يثلث في النظائر وصفت وسائل الإعلام ثقافة + ملاحق مدال مستقرة.
ملاحظة: هنا ثقافة خلايا هيلا لمدة 48 ساعة في صحن 100 ملم لعدد كبير من الخلايا (~ 4 × 10 6) هناك حاجة إلى الحصول على 500،000 خلايا فرزها. وقد يتطلب هذا العدد من هيلا خلايا استخراج للحصول على قياس جيد الأيض. وكان وسائل الإعلام ثقافة استخدام RPMI تحتوي على 40٪ U- 13 C-الجلوكوز و 70٪ U- 13 C، 15 N2-الجلوتامين و 5٪ مدال FBS. - في يوم من الاستخراج، وسائل الإعلام ثقافة نبذ، وشطف الآبار ثإيث 1.5 مل دافئ HBSS ثم تخلص منه.
- فصل الخلايا عن طريق إضافة 1.5 مل التربسين / EDTA لمدة 4 دقائق عند 37 درجة مئوية. نفذ الخطوات التالية في 4 درجات مئوية أو في الجليد.
- تعطيل التربسين وذلك بإضافة 3 مل الجليد HBSS الباردة (هانك المتوازن محلول الملح) + ملحق مدال.
- جمع الخلايا في أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 750 x ج لمدة 3 دقائق.
- Resuspend وبيليه في HBSS + مدال ملحق + 1 ملم EDTA بتركيز 1-2 × 10 6 خلية / مل، تمر عبر 40 ميكرومتر مصافى الخلية للحصول على خلايا واحدة، ونقل إلى أنبوب 5 مل.
- خلايا من خلال فرز النابضة خلية فارز فقط لsinglets، ووأجهزة الطرد المركزي فرز الخلايا في 750 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: هنا نوع خلايا هيلا بمعدل 1000 أحداث / ثانية، مع الضغط أداة 27 رطل، وباستخدام فوهة 100 ميكرومتر. خلايا هيلا كبيرة ولذلك يجب فرز بمعدل الحدث بطيئة وفوهة كبيرة للحصول على بيليه كما سليمة قدر الإمكان. إبقاء الخلايا في كتل الباردة throughouر الفرز لتقليل عملية التمثيل الغذائي. وصفت وصفا شاملا لإجراء الفرز سابقا 12. - تجاهل طاف و resuspend بيليه في 50 ميكرولتر الجليد درهم البارد 2 O للحصول على بيليه متجانسة قبل إضافة الميثانول. إضافة الميثانول البارد مباشرة إلى بيليه تشكل بيليه الصلبة والتي من الصعب ل resuspend.
- استخراج الأيض وذلك بإضافة 540 ميكرولتر الميثانول يوضع في الثلج الجاف والحفاظ على مقتطفات في -80 درجة مئوية حتى اللوني السائل - عالية الدقة الطيف الكتلي (LC-HRMS) التحليل.
- خلايا الثقافة في صحن 100 ملم في يثلث في النظائر وصفت وسائل الإعلام ثقافة + ملاحق مدال مستقرة.
- استخراج دورة الخلية فرز الخلايا
- خلايا الثقافة في صحن 100 ملم في يثلث في وسائل الإعلام ثقافة + ملاحق مدال.
ملاحظة: هنا ثقافة خلايا هيلا تحتوي على Geminin Fucci الأخضر (mAG1-hGem) التحقيق 13 الذي يسمح للفرز من G1 (السلبي) وSG2M الخلايا (إيجابية). الخلايا يمكن تربيتها في وسائل الإعلام النظائر تتبع مستقرة لليالي طويلة كما هو مطلوب. هنا لدينا مثقف لهم لمدة 46 ساعة في وسائل الإعلام الخالي من الملصقات، ثم قمنا تحولت إلى RPMI تحتوي على 40٪ U- 13 C-الجلوكوز و 70٪ U- 13 C، 15 N2-الجلوتامين 2 ساعة قبل بدء الفرز. وقد تم ذلك من أجل أن تكون قادرة على دراسة مراحل دورة الخلية مما يتطلب وضع العلامات نبضة قصيرة. - في يوم من الاستخراج، وسائل الإعلام ثقافة نبذ، وشطف الآبار مع 1.5 مل HBSS الدافئ ثم تخلص منه.
- فصل الخلايا عن طريق إضافة 1.5 مل التربسين / EDTA لمدة 4 دقائق عند 37 درجة مئوية. نفذ الخطوات التالية في 4 درجات مئوية أو في الجليد.
- تعطيل التربسين وذلك بإضافة 3 مل الجليد الباردة HBSS + ملحق مدال.
- جمع الخلايا في أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 750 x ج لمدة 3 دقائق.
- Resuspend وبيليه في HBSS + مدال ملحق + 1 ملم EDTA بتركيز 1-2 × 10 6 خلية / مل، تمر عبر 40 ميكرومتر مصافى الخلية للحصول على خلايا واحدة، ونقل إلى أنبوب 5 مل.
- خلايا الفرز من خلال خلية فارز زating من الحطام والحلل، ثم النابضة للعلامة الخلية من الفائدة، وأجهزة الطرد المركزي فرز الخلايا في 750 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: هنا نوع خلايا هيلا بمعدل 1000 أحداث / ثانية، مع الضغط أداة 27 رطل، وباستخدام فوهة 100 ميكرومتر. إبقاء الخلايا في كتل الباردة طوال الفرز لخفض معدل الأيض. - تجاهل طاف و resuspend بيليه في 50 ميكرولتر الجليد درهم البارد 2 O للحصول على بيليه متجانسة قبل إضافة الميثانول. إضافة الميثانول البارد مباشرة إلى بيليه تشكل بيليه الصلبة والتي من الصعب ل resuspend.
- استخراج الأيض وذلك بإضافة 540 ميكرولتر الميثانول يوضع في الثلج الجاف والحفاظ على مقتطفات في -80 درجة مئوية حتى التحليل LC-إدارة الموارد البشرية.
- خلايا الثقافة في صحن 100 ملم في يثلث في وسائل الإعلام ثقافة + ملاحق مدال.
تحليل 2. الطيف الكتلي
ملاحظة: نحن هنا وصف بروتوكول لتحليل مقتطفات خلية على نظام LC-إدارة الموارد البشرية. أي طرق الايض لتحليل مقتطفات خلية يمكن استخدامها. مسح كاملقد يكون من المفيد تحليل للكشف عن مجموعة واسعة من المركبات.
- معايرة أداة باستخدام مزيج معايرة الطيف إشارة الشامل.
- مقتطفات الخلية ذوبان الجليد على الجليد لمدة 30 دقيقة ودوامة لمدة 15 ثانية.
- نقل 100 ميكرولتر من استخراج الخلايا إلى تصفية تدور وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 13000 x ج في 4 درجات مئوية.
- ضخ 12.5 ميكرولتر من الترشيح على النظام LC-إدارة الموارد البشرية.
- الأيض منفصلة باستخدام Zwitterionic التفاعل ماء اللوني السائل (زيوريخ-HILIC) عمود (150 ملم × 4.6 ملم، 5 ميكرون حجم الجسيمات) مزودة العمود حارس زيوريخ-HILIC (20 مم × 2.1 مم) باستخدام شطف التدرج من 0.1٪ الفورمات الحمض الموجود في الماء (مذيب) والأسيتونتريل (المذيبات B). بدء شطف التدرج في 20٪ من المذيبات ألف وزيادة تصل إلى 80٪ في 17 دقيقة. الحفاظ على هذه النسبة خلال 4 دقائق مع تدفق 400 ميكرولتر دقيقة -1 و درجة حرارة العمود وصينية عينة في 23 درجة مئوية و 4 درجات مئوية، على التوالي.
- استخدام طnstrument بالإضافة إلى الفصل الكروماتوغرافي للكشف عن الأيض، وelectrospray ساخنة (H-ESI الثاني) في كل من وسائط الإيجابية والسلبية كمصدر التأين، وكامل طريقة اكتساب المسح في كتلة حل السلطة من 70000 كاملة العرض نصف الحد الأقصى (FWHM) ( م / ض 200).
- استخدام النيتروجين (نقاء> 99.995٪) للغاز غمد والغاز مساعد بمعدل تدفق 45 و 10 او (وحدات التعسفي) وضبط درجة الحرارة المرذاذ في 350 ° C والجهد electrospray في 4 كيلو فولت في وضع إيجابي و-3.5 كيلو فولت في وضع سلبي.
تحليل 3. البيانات
- اختيار عدد من المركبات التي تتوفر المعايير والتي تظهر قمم نوعية جيدة في العينات. قمم نوعية جيدة لها إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء. ومن المهم أن تحقق الذروة الجودة والتأكد من عدم إدراج النظائر كاذبة. قمم النظائر التي تختلف في الشكل و / أو الوقت الاحتفاظ هي على الأرجح زائفة.
- للحصول على عينات المسمى النظير حساب isotopomer الشامل (MI) كسور بتقسيم منطقة ذروة كل MI مع مجموع المناطق الذروة من كل سوء.
- حساب المسمى كسور الكربون / النيتروجين، والإثراء من 13 C و 15 N، على التوالي، كما
حيث n هو عدد ذرات الكربون (أو نيتروجين، على التوالي) في الأيض، ومزج هو جزء MI من س.
ملاحظة: يمكن تنفيذ جميع العمليات الحسابية باستخدام لغات البرمجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكمثال على ذلك، ونحن هنا وصف تجربة التحقيق في عملية التمثيل الغذائي للخلايا هيلا مرتبة وفقا لمرحلة دورة الخلية. لتسمية مجموعة واسعة من المركبات المركزية في كل من الكربون ونيتروجين، ونحن مثقف الخلايا لمدة 48 ساعة باستخدام U- 13 C-الجلوكوز وU- 13 C، N-15 الجلوتامين كأثر. للحصول على أجهزة الإنترنت النقالة الغنية للتجربة التحقق من صحة، اخترنا هنا خليط من 40٪ U- 13 C-الجلوكوز و 70٪ U- 13 C، 15 N2-الجلوتامين، ومستويات متوسطة من النظائر تميل إلى توليد أنماط MI أكثر تنوعا 14.
للتجربة التحقق من صحة أجرينا تحليل المستهدفة من 85 الأيض. بعد ضبط الجودة خطوات لإزالة سوء قمم نوعية LC-MS، تمكنا من كشف 69 قمم في مقتطفات الخلية مباشرة، منها 66 كانت موجودة في خلايا وهمية مرتبة (96٪). 60 من هذه يبدو أن وصفت(تخصيب النظائر فوق الوفرة الطبيعية)، وفي معظم الحالات كانت أجهزة الإنترنت النقالة متشابهة بين مقتطفات طبق والخلايا مرتبة وهمية (الشكل 2A). على سبيل المثال، MID الغلوتامات (الذي يشمل كلا من C 13 و 15 N MIS) مشابه بين طبق ومقتطفات فرز وهمية (الشكل 2B)، مشيرا إلى أن الغلوتامات MID موثوق بها أيضا في السكان الخلية التي تم فرزها. ومع ذلك، بعض نواتج الأيض تتأثر بشكل واضح للإجراءات الفرز: على سبيل المثال، كان لاكتات أقل 13 C 3 في الخلايا مرتبة وهمية، لأسباب غير معروفة. وينبغي النظر إلى هذه الأيض مع الحذر عند تحليل البيانات من كسور مرتبة الفعلية. في الخلايا مرتبة وهمية، كان 91٪ من نسبة MI قياس انحراف معياري أقل من 1٪ في يثلث البيولوجية، مشيرا إلى أن أجهزة الإنترنت النقالة كانت استنساخه للغاية في خلايا فرزها.
قمنا بتحليل المقبل مرتبة هيلا إما إلى G0 / G1 أو S / G2 / دورة الخلية M الصورةتاغس باستخدام مسبار FUCCI Geminin 12. لأن هذه المراحل دورة الخلية الماضي فقط ~ 10 ساعة، ونحن هنا "نبض" وصفت الثقافات لمدة 2 ساعة لتحقيق وضع العلامات النظائر بين مختلف المراحل. على سبيل المثال، لاحظنا أن سيتيدين هو المسمى في كل من السكان، ولكن لتخصيب العالي في S / G2 / M المرحلة، بما يتفق مع زيادة التوليف دي نوفو من النيوكليوتيدات خلال المرحلة S (الشكل 3). في هذه الحالة، MID يدل على نفس النمط في كل من الكسور، مما يشير إلى أن يتم استخدام نفس تركيب الممر، ولكن أكثر نشاطا في S / G2 / M المرحلة. وتشير هذه البيانات إلى أن الاختلافات التمثيل الغذائي يمكن اكتشافها بسهولة بواسطة هذه الطريقة حتى بين مجموعات سكانية فرعية ترتبط ارتباطا وثيقا.
الشكل 1: التصميم التجريبي. سير العمل لإعداد الطبق، وهمية فرز وفرز حيوانية إضافيةسنت. تستخدم طبق وهمية مقتطفات فرزها في أذهان التحقق من صحة التجربة من طبق ومقتطفات فرز وهمية تتم مقارنة لاختبار لتغييرات محتملة، بسبب الفرز. يتم فرز السكان معقدة من الخلايا استنادا علامة على نوع من الخلايا في المصالح ومن ثم استخراج. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التحقق من أجهزة الإنترنت النقالة ضد الاستخراج المباشر. المؤامرات مبعثر من (A) 13 C و 15 N تخصيب اليورانيوم في طبق وعينات فرز وهمية. وتمثل كل نقطة على تكرار. وانضم يثلث مع خطوط. (ب) 13 ج 15 N أجهزة الإنترنت النقالة من الغلوتامات. (C) 13 C أجهزة الإنترنت النقالة اللاكتات. أشرطة الخطأ هي الانحرافات المعيارية من قنينة ثلاث نسخrements. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): الخلافات الاستقلابية بين مراحل دورة الخلية في خلايا هيلا. وصفت سيتيدين بشكل مختلف في مجموعة 1 -G 0 وسان جرمان 2 -M الخلايا. (A) سيتيدين 13 C تخصيب اليورانيوم في G 1 -G 0 وسان جرمان 2 -M مراحل دورة الخلية. خط متقطع لتقف على تخصيب الكربون من النظائر كتلة الطبيعي. (ب) سيتيدين أجهزة الإنترنت النقالة كما هو موضح المؤامرات مجموعة في مجموعة 1 -G 0 وسان جرمان 2 -M مراحل. أشرطة الخطأ هي الانحرافات المعيارية من القياسات ثلاث نسخ. الرجاء النقر هنا لضدiew نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويستند طريقتنا على مبدأ أن أجهزة الإنترنت النقالة في الأيض الخلوية تعكس "التاريخ" من الأنشطة الأيضية للخلية. هذا يجعل من الممكن للتحقيق في الأنشطة الأيضية في حيوانية من الخلايا، لأنها وقعت في المجتمع المعقدة من الخلايا، قبل الخلية إجراء الفرز. في المقابل، مناطق الذروة الأيض تختلف بشكل ملحوظ بين مقتطفات من خلايا فرزها واستخراج مباشرة من صحن الثقافة 11. في هذا الجزء لأن تكوين كيميائي مختلف يغير استجابة إشارة في مطياف الكتلة، وهو ما يسمى "تأثير المصفوفة"، لكننا أظهرنا أيضا أن الأحماض الأمينية تضيع من الخلايا أثناء الفرز، في حين يتم الاحتفاظ الخلايا في المخزن (11). وهذا قد يغير من الدولة وأنشطة خلايا الأيض أثناء الفرز، ولكن هذا في حد ذاته غير ذي صلة لأسلوبنا: شريطة أن أجهزة الإنترنت النقالة قريبة بشكل معقول لتلك التي لوحظت في استخراج المباشر، تبقى البيانات على فاليقياس د الدولة الأيضية لمجموعة حيوانية في والثقافة المعقدة الأصلية.
اختبرنا في البداية طريقة حيث تم فرز الخلايا مباشرة في حل واستخراج (الميثانول) لإرواء بسرعة الأيض. للأسف، كانت مقتطفات مما أدى الصعب تحليل، لأنها تحتوى على كميات كبيرة من الأملاح والملوثات ربما غيرها من غمد السائل خلية فارز، مما أدى إلى قمع أيون هائل على نظام قياس الطيف الكتلي لدينا. لذا علينا تسويتها على بروتوكول الموصوفة هنا، حيث يتم غسل السوائل الزائدة التي أودعتها الصك خلية فارز من قبل الاستخراج.
بروتوكول لدينا يستلزم الفرز في HBSS، محلول ملحي الفسيولوجية تستكمل مع الجلوكوز للحفاظ على بقاء الخلية. في بعض النواحي، قد يكون من الأفضل لفرز الخلايا في مستنبت الفعلي للحد من الإجهاد الأيضي مثل تسرب الأحماض الأمينية. ومع ذلك، فإنه من الصعب أن يغسل بيليه صغيرة من الخلايا فرزها، وtherefسوف الأيض خام موجودة في المتوسط تلوث أجهزة الإنترنت النقالة سعى الأيض داخل الخلايا. كلما تم استخدام 13 الجلوكوز المسمى C كما التتبع، وينبغي أن تستخدم متطابقة الجلوكوز وصفت في حل HBSS كذلك.
كما رأينا في الشكل 2، كثيرة، ولكن ليس كل الأيض، والحفاظ على أجهزة الإنترنت النقالة الخاصة بهم بعد الخلية إجراء الفرز. نحن لا نعرف لماذا بعض نواتج الأيض (اللاكتات، على سبيل المثال) يتم تغيير وجه التحديد. هذه النتيجة تؤكد أنه من الأهمية بمكان للتحقق من أن أجهزة الإنترنت النقالة من الفائدة هي قوية نحو الخلية فرز الإجراء الفرز وهمية. على الرغم من أنه ليس من الممكن التحقق مباشرة من منتصف لجزء من السكان فرزها، يجب أن أجهزة الإنترنت النقالة التي لا تتأثر الفرز وهمية (الغلوتامات، على سبيل المثال) لن تتأثر الفعلية فرز كذلك، لهذا الإجراء هو متطابقة باستثناء لاختيار الخلية. وينبغي إجراء هذه الخطوة التحقق من كل من يستخدمها نوع من الخلايا أو ثقافة حالة جديدة. ومن المهم أن نشير إلى أن سيقتصر طريقة اور لنواتج الأيض التي أجهزة الإنترنت النقالة قوية يمكن التحقق بهذه الطريقة.
ونحن نتوقع أن الطريقة الموصوفة هنا سيكون مفيدا في عدد من التطبيقات في بيولوجيا الخلية والطب الحيوي. ومن الأمثلة الظواهر التمثيل الغذائي للخلايا شارك مثقف مثل الخلايا الجذعية - ثقافات الطبقة المغذية، ونماذج الخلايا العصبية نجمية 4، القطعان من خلايا الدم 2، وأيضا سكان الخلية معقدة معزولة عن النماذج الحيوانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree - MC - VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20 mm x 2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| Myrsyra 99.5% Optima (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
References
- Gregersen, P. K. Cell type-specific eQTLs in the human immune system. Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).
- Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).
- Prat, A., et al. Characterization of cell lines derived from breast cancers and normal mammary tissues for the study of the intrinsic molecular subtypes. Breast Cancer Res. Treat. 142 (2), 237-255 (2013).
- Magistretti, P. J., Allaman, I. A Cellular Perspective on Brain Energy Metabolism and Functional Imaging. Neuron. 86 (4), 883-901 (2015).
- Angelini, G., et al. Antigen-presenting dendritic cells provide the reducing extracellular microenvironment required for T lymphocyte activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1491-1496 (2002).
- Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Harris, A. L., Sivridis, E. Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: A metabolic survival role for tumor-associated stroma. Cancer Res. 66 (2), 632-637 (2006).
- Hollenbaugh, J. A., Munger, J., Kim, B. Metabolite profiles of human immunodeficiency virus infected CD4+ T cells and macrophages using LC-MS/MS analysis. Virology. 415 (2), 153-159 (2011).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytom. Part A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Moussaieff, A., et al. High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).
- Johnson, C., et al. A metabolic signature of colon cancer initiating cells. Cancer Metab. 2, 32 (2014).
- Roci, I., et al. Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells. Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).
- Shapiro, H. Practical flow cytometry. , Wiley-Liss. New York. (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Noack, S., Wiechert, W. Quantitative metabolomics: A phantom. Trends Biotechnol. 32 (5), 238-244 (2014).
