Introduction
Höhere Organismen enthalten komplexe Gemeinschaften von verschiedenen Zelltypen, die über komplexere Funktionen zu bringen, zusammenzuarbeiten. Zum Beispiel enthalten Tumoren nicht nur Krebszellen, sondern auch Fibroblasten, Zellen , die Blutgefäße darstellen, und oft Immunzellen infiltriert 1; Blut enthält eine komplexe Mischung von Dutzenden von Immunzellsubtypen 2; und auch kultivierte Zelllinien können aus mehreren Subpopulationen bestehen, wie beispielsweise der luminalen und basalen Subtypen von Brustkrebszellen 3. Darüber hinaus verschiedene Zelltypen, die metabolische "Zusammenarbeit" zeigen nebeneinander bestehen können. Beispielsweise im Gehirn, sind Astrozyten gedacht Glukose zu Laktat zu konvertieren, die "gefüttert" zu Neuronen ist dann , dass dieses Substrat 4 zu oxidieren; T - Lymphozyten sind in einigen Zusammenhängen abhängig von benachbarten dendritischen Zellen als eine Quelle für Cystein 5; und Krebszellen können mit asso zusammenarbeitengehörigen Fibroblasten in Tumoren 6. Um das metabolische Verhalten solcher Systeme zu verstehen, ist es wichtig, zu trennen und die Stoffwechselaktivitäten der verschiedenen Zelltypen zu messen.
Bei weitem das am häufigsten verwendete Verfahren zur Abtrennung von Zelltypen ist die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung. Dieses Verfahren ist breit anwendbar, vorausgesetzt, dass der Zelltyp oder Zustand von Interesse kann unter Verwendung von fluoreszierenden Antikörpern, die Expression von gentechnisch fluoreszierende Proteine oder andere Farbstoffe "markiert" werden. Eine Möglichkeit besteht darin , zunächst getrennte Zelltypen durch einen Zellsortierer, wieder Kultur die einzelnen Zelltypen erhalten, und dann Metabolismus - Untersuchungen dieser Kulturen 7 durchführen. Dies ist jedoch nur möglich, wenn der Zelltyp oder Phänotyps in Kulturbedingungen stabil ist, und nicht die Übergangsverhalten, wie beispielsweise Zellzykluszustände noch die metabolischen Kooperation in Kokulturen erfassen kann. Für solche Fälle müssen Stoffwechsel direkt auf so gemessen werden,rtet Zellen. Das ist eine Herausforderung , da die Zelle Verfahren Sortierfächer Zellen zu Spannungen, die ihren Stoffwechsel 8 verzerren, und wir sind nur wenige Studien bewusst diesen Ansatz 9, 10. Insbesondere haben wir die Hauptmetaboliten wie Aminosäuren gefunden in Zellsortierpuffer gehalten von Zellen austreten kann, so dass die Messungen des absoluten Metabolitenfluss sind nicht mehr zuverlässig 11 (obwohl relativen Vergleich zwischen sortierten Fraktionen immer noch wertvoll sein kann).
Um diese Probleme zu umgehen, wir beschriften Zellen mit stabilen Isotopen vor der Sortierung und konzentrieren sich auf die MIDs in zellulären Metaboliten, anstatt Metaboliten Abundanzen. Da MIDs über längere Zeitskalen gebildet werden, sollten sie weniger durch Sortierung Bedingungen kurzfristige Exposition. Wir quantifizieren MIDs Full-Scan-hochauflösende Massenspektrometrie, die empfindlich genug ist, da bietenta auf Hunderten von Metaboliten von rund 500.000 sortierten Zellen beginnen, was etwa 30-60 Minuten von Zellsortierung Zeit. Ein Vergleich zwischen einem "mock sortiert" Kontrolle (Zellen durch den Zellsortierer Instrument weitergegeben, ohne spezifische Bevölkerungs Gating) und Metaboliten Extraktion direkt aus der Kulturschale gewährleisten gemacht, dass die beobachteten MIDs sind repräsentativ für diejenigen, die in der ursprünglichen Kultur. Je nach Wahl der stabilen Isotopen Tracern können verschiedene Stoffwechselwege mit diesem Verfahren untersucht werden.
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Protocol
1. Metabolit Extraction
- Extraktion aus Gericht
- Kultur-Zellen in einer 6-Well-Platte in dreifacher Ausführung in einem stabilen Isotop Kulturmedien + dialysiert Ergänzungen (Serum oder anderen Wachstums Ergänzungen), bis die Zellen werden 75% konfluent.
HINWEIS: Hier Kultur HeLa - Zellen für 48 h in RPMI mit 40% U- 13 C-Glucose und 70% U- 13 C, 15 N2-Glutamin und 5% dialysiertem FBS (Fetal Bovine Serum). Dialysierter FBS wird verwendet, der mit geringem Molekulargewicht Metaboliten, um loszuwerden, die den markierten Medien kontaminieren könnten. Kultivieren von Zellen in dialysiert Ergänzung vor dem realen Experiment wird empfohlen Zellen wachsen üblicherweise in dem Medium zu gewährleisten. Zuschläge sind in 0,15 M NaCl-Lösung über Nacht unter Verwendung von Schlangenhaut Dialyseschlauch dialysiert. - Am Tag der Kulturmedien Extraktion zu verwerfen, spülen Vertiefungen zweimal mit 500 & mgr; l kaltem HBSS und es dann zu verwerfen.
Hinweis: Verwenden Sie hier HBSS 40% U-13 C-Glucose , da es auch in den Kulturmedien. - In 600 & mgr; l 100% Methanol vorgekühlt auf Trockeneis.
- Übertragen Sie die Schüssel Eis zu trocknen und Zellmaterial mit einem Zellschaber entfernen.
- Sorgfältig Pipette die Zellextrakte auf einem Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C bis zur Massenspektrometrie-Analyse.
- Kultur-Zellen in einer 6-Well-Platte in dreifacher Ausführung in einem stabilen Isotop Kulturmedien + dialysiert Ergänzungen (Serum oder anderen Wachstums Ergänzungen), bis die Zellen werden 75% konfluent.
- Die Extraktion von Mock sortierten Zellen
- Kultur-Zellen in einer 100-mm-Schale in dreifacher Ausführung in einem stabilen Isotop Kulturmedien + dialysierten ergänzt.
HINWEIS: Hier Kultur HeLa - Zellen für 48 h in 100 - mm - Schale , da eine hohe Anzahl von Zellen (~ 4 × 10 6) 500.000 sortierten Zellen zu erhalten , benötigt. Diese Anzahl von Zellen, HeLa-Extrakt wurde erforderlich gute Messung von Stoffwechselprodukten zu erhalten. Das Kulturmedium verwendet wurde , war RPMI , enthaltend 40% U- 13 C-Glucose und 70% U- 13 C, 15 N2-Glutamin und 5% dialysiertem FBS. - Am Tag der Extraktion, Discard Kulturmedien, spülen Brunnen with 1,5 ml warmem HBSS und es dann zu verwerfen.
- Abzulösen Zellen durch Zugabe von 1,5 ml Trypsin / EDTA für 4 min bei 37 ° C. Führen Sie die folgenden Schritte in 4 ° C oder in Eis.
- Deaktivieren Trypsin durch Zugabe von 3 ml eiskaltem HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) + dialysiert Ergänzung.
- Sammeln Zellen in einem 15 ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 750 × g für 3 min.
- Das Pellet in HBSS + dialysiert Ergänzung + 1 mM EDTA in einer Konzentration von 1 bis 2 x 10 6 Zellen / ml, durch 40 & mgr; m Zelle Siebe passieren zu einzelnen Zellen zu erhalten, und in ein 5 ml - Röhrchen.
- Sortier Zellen durch Gating Zellsortierer nur für Singuletts und zentrifugieren sortierten Zellen bei 750 × g für 3 min bei 4 ° C.
HINWEIS: Hier sortieren HeLa-Zellen mit einer Rate 1.000 Veranstaltungen / s, mit Instrumentendruck 27 psi und unter Verwendung einer 100 & mgr; m Düse. HeLa-Zellen sind groß, so sollten sie in einem langsamen Ereignisrate und große Düse sortiert werden als intakte Pellet wie möglich zu erhalten. Halten Sie die Zellen in kalten Blöcke throughout Sortieren des Metabolismus zu verringern. Eine ausführliche Beschreibung der Sortierverfahren wird zuvor 12 beschrieben. - Überstand verwerfen und das Pellet in 50 & mgr; l eiskaltem dH 2 O , um eine homogene Pellets zu erhalten , bevor Zugabe von Methanol. Zugabe von kaltem Methanol direkt zu Pellets bildet eine feste Pellet, das schwer zu resuspendieren.
- Extrahieren Sie Metaboliten durch Zugabe von 540 & mgr; l Methanol in Trockeneis gehalten und halten Extrakte bei -80 ° C bis zur Flüssigchromatographie - hochauflösender Massenspektrometrie (LC-HRMS) Analyse.
- Kultur-Zellen in einer 100-mm-Schale in dreifacher Ausführung in einem stabilen Isotop Kulturmedien + dialysierten ergänzt.
- Die Extraktion von Zellzyklus - sortierten Zellen
- Kultur-Zellen in einer 100-mm-Schale in dreifacher Ausführung in Kulturmedien + dialysiert Ergänzungen.
HINWEIS: Hier Kultur HeLa - Zellen Geminin Fucci Green (mag1-hGem) Sonde 13 , die für die Sortierung von G1 (negativ) ermöglicht und SG2M (positive) Zellen enthält. Die Zellen können in einem stabilen Isotop Tracing Medien für eine kultiviert werdens lange wie erforderlich. Hier haben wir kultiviert sie für 46 h in unmarkierten Medien, dann haben wir umgeschaltet RPMI mit 40% U- 13 C-Glucose und 70% U- 13 C, 15 N 2-Glutamin 2 h vor dem Start zu sortieren. Dies wurde getan, um in der Lage sein, die Zellzyklusphasen zu untersuchen, die eine kurze Pulsmarkierung erfordert. - Am Tag der Extraktion, Discard Kulturmedien, spülen Brunnen mit 1,5 ml warmem HBSS und es dann zu verwerfen.
- Abzulösen Zellen durch Zugabe von 1,5 ml Trypsin / EDTA für 4 min bei 37 ° C. Führen Sie die folgenden Schritte in 4 ° C oder in Eis.
- Deaktivieren Trypsin durch Zugabe von 3 ml eiskaltem HBSS + dialysierten ergänzen.
- Sammeln Zellen in einem 15 ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 750 × g für 3 min.
- Das Pellet in HBSS + dialysiert Ergänzung + 1 mM EDTA in einer Konzentration von 1 bis 2 x 10 6 Zellen / ml, durch 40 & mgr; m Zelle Siebe passieren zu einzelnen Zellen zu erhalten, und in ein 5 ml - Röhrchen.
- Sortier Zellen durch den Zellsortierer gtriebs aus Schutt und Dubletts, dann für die Zellmarker von Interesse Gating und zentrifugieren sortierten Zellen bei 750 × g für 3 min bei 4 ° C.
HINWEIS: Hier sortieren HeLa-Zellen mit einer Rate 1.000 Veranstaltungen / s, mit Instrumentendruck 27 psi und unter Verwendung einer 100 & mgr; m Düse. Halten Sie die Zellen in kalten Blöcke im gesamten Sortier die Stoffwechselrate zu verringern. - Überstand verwerfen und das Pellet in 50 & mgr; l eiskaltem dH 2 O , um eine homogene Pellets zu erhalten , bevor Zugabe von Methanol. Zugabe von kaltem Methanol direkt zu Pellets bildet eine feste Pellet, das schwer zu resuspendieren.
- Extrahieren Sie die Metaboliten durch Zugabe von 540 & mgr; l Methanol in Trockeneis gehalten und halten Extrakte bei -80 ° C bis LC-HRMS-Analyse.
- Kultur-Zellen in einer 100-mm-Schale in dreifacher Ausführung in Kulturmedien + dialysiert Ergänzungen.
2. Massenspektrometrie-Analyse
Hinweis: Hier haben wir das Protokoll zur Analyse von Zellextrakten auf einem LC-HRMS-System zu beschreiben. Jegliche metabolomics Verfahren zur Analyse von Zellextrakten verwendet werden. Kompletter SuchlaufAnalyse könnte zum Erfassen einer Vielzahl von Stoffwechselprodukten nützlich sein.
- Kalibrieren Sie das Gerät eine Massenspektrometrie Referenzkalibrierungsmischung verwendet wird.
- Thaw Zellextrakten auf Eis für 30 min und Vortex für 15 s.
- Transfer von 100 & mgr; l des Zellextraktes auf ein Spinfilter und Zentrifuge für 10 min bei 13000 × g bei 4 ° C.
- Injizieren 12,5 & mgr; l des Filtrats auf das LC-HRMS-System.
- Separate Metaboliten ein zwitterionischer hydrophiler Wechselwirkungen FLÜSSIGCHROMATOGRAPHIE (ZIC-HILIC) Säule (150 mm x 4,6 mm, 5 & mgr; m Partikelgröße) mit einem ZIC-HILIC-Schutzsäule (20 mm × 2,1 mm) unter Verwendung einer Gradientenelution von 0,1% Ameisensäure ausgestattet Säure in Wasser (Lösungsmittel A) und Acetonitril (Lösungsmittel B). Starten Sie die Gradientenelution bei 20% Lösungsmittel A und erhöhen in 17 min bis zu 80%. Aufrechterhaltung dieser Prozentsatz während 4 min mit einem Strom von 400 & mgr; l min -1 und die Säulentemperatur und die Probenschale bei 23 ° C und 4 ° C.
- Verwenden Sie ein instrument zur chromatographischen Trennung gekoppelt Metaboliten Detektion einer beheizten Elektrosprüh (H-ESI II) in sowohl positive als auch negative Betriebsarten als Ionisationsquelle und einen Scan Erfassungsmodus bei einem Massenauflösungsvermögen von 70.000 Full Width Half Maximum (FWHM) ( m / z 200).
- Verwenden Sie Stickstoff (Reinheit> 99,995%) für den Mantel Gas und Hilfsgas mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 45 und 10 au (willkürliche Einheiten), und stellen Verdampfertemperatur bei 350 ° C und der Elektrospannung bei 4 kV im positiven Modus und -3,5 kV in negativen Modus.
3. Datenanalyse
- Wählen Sie eine Reihe von Metaboliten, für die Normen verfügbar sind und die zeigen eine gute Qualität Spitzen in den Proben. Gute Qualität Spitzen haben hohes Signal-Rausch-Verhältnis. Es ist wichtig, Spitzenqualität zu überprüfen und sicherstellen, dass keine falschen Isotope enthalten. Isotopen-Peaks, die in Form und / oder Retentionszeit unterscheiden, sind wahrscheinlich falsch.
- Für isotopenmarkierten Proben berechnen Masse Isotopomer (MI) Fraktionen, die durch den Spitzenbereich jedes MI mit Gesamtpeakflächen aller Infarkte zu teilen.
- Berechnen der markierten Kohlenstoff / Stickstoff - Fraktionen, Anreicherung von 13 C und 15 N, jeweils als
wobei n die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome (oder Stickstoffe, respectively) in dem Metaboliten und mischen ist der MI Bruchteil x.
HINWEIS: Alle Berechnungen können mit Programmiersprachen durchgeführt werden.
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Representative Results
Als Beispiel beschreiben wir ein Experiment den Metabolismus von HeLa-Zellen Untersuchung der Zellzyklus-Phase, sortiert nach. Um eine breite Palette von zentralen Metaboliten auf beiden Kohlenstoffe und Stickstoffe beschriften, kultiviert wir Zellen für 48 Stunden unter Verwendung von U- 13 C-Glucose und U- 13 C, 15 N-Glutamin als Tracer. Um reich MIDs für die Validierung Experiment zu erhalten, haben wir hier eine Mischung aus 40% U- 13 C-Glucose und 70% U- 13 C, 15 N2-Glutamin, als Zwischenstufen Isotope sind in der Regel vielfältigere MI Muster 14 zu erzeugen.
Für die Validierung Experiment führten wir eine gezielte Analyse von 85 Metaboliten. Nach der Qualitätsstufen steuert schlechte Qualität LC-MS Spitzen zu entfernen, konnten wir 69 Spitzen in den direkten Zellextrakten nachzuweisen, davon 66 (96%) in den mock sortierten Zellen vorhanden waren. 60 davon erschienen etikettiert werden(Isotopenanreicherung über natürliche Häufigkeit), und in den meisten Fällen ihre MIDs ähnlich waren zwischen Gericht Extrakten und Mock sortierten Zellen (2A). Zum Beispiel kann die MID von Glutamat (die sowohl 13 C und 15 N MIs enthält) ist ähnlich zwischen Teller und mock sortiert Extrakte (2B), was anzeigt , dass die Glutamat - MID zuverlässig ist auch in sortierten Zellpopulationen. Allerdings sind einige Metaboliten deutlich durch die Sortierverfahren betroffen: zum Beispiel Laktat hatte weniger 13 C 3 in mock sortierten Zellen, aus unbekannten Gründen. Solche Metaboliten sollten mit Vorsicht betrachtet werden, wenn Daten von tatsächlichen sortiert Fraktionen zu analysieren. In Mock Zellen sortiert, 91% der gemessenen MI Fraktion hatte eine Standardabweichung von weniger als 1% über biologische Triplikaten, was darauf hinweist, dass MIDs in sortierten Zellen in hohem Maße reproduzierbar waren.
Wir analysierten nächste sortiert HeLa entweder in G0 / G1 oder S / G2 / M-Zellzyklus steile die Fucci Geminin Sonde 12. Weil dieser Zellzyklusphasen dauern nur ~ 10 h, die wir hier "pulse" markierten Kulturen für 2 h auf unterschiedliche Isotopenmarkierung zwischen den Stufen zu erzielen. Zum Beispiel haben wir festgestellt , daß Cytidin in beiden Populationen gekennzeichnet ist, aber auf eine höhere Anreicherung in der S / G2 / M Phase, was mit erhöhten de novo - Synthese von Nukleotiden während der S - Phase (Abbildung 3). In diesem Fall zeigt die MID das gleiche Muster in den beiden Fraktionen, was darauf hindeutet, dass gleiche Syntheseweg verwendet wird, aber ist aktiver in der S / G2 / M Phase. Diese Daten zeigen, dass metabolische Unterschiede durch dieses Verfahren leicht nachweisbar sind sogar zwischen eng verwandten Subpopulationen.
Abbildung 1: Experimentelles Design. Workflow zur Herstellung von Geschirr, mock sortiert und sortiert Subpopulation Extracts. Dish und Mock sortiert Extrakte werden in den Validierungsexperiment MIDs des Tellers und Mock sortiert Extrakte werden für mögliche Änderungen im Vergleich zum Test verwendet aufgrund Sortierung. Komplexe Population von Zellen basiert auf Marker der Zelltyp von Interesse sortiert und dann extrahiert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Validierung von MIDs gegen direkte Extraktionen. Streudiagramme von (A) 13 C und 15 N - Anreicherung in Schale und Mock sortiert Proben. Jeder Punkt steht für eine Replikation. Dreifache Ausführungen sind mit Linien verbunden. (B) 13 C- 15 N MIDs von Glutamat. (C) 13 C MIDs von Laktat. Die Fehlerbalken sind Standardabweichungen von drei Exemplaren measudernisse. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Metabolic Unterschiede zwischen Zellzyklusphasen in HeLa - Zellen. Cytidin ist anders in G markiert 1 -G 0 und SG 2 -M - Zellen. (A) cytidin 13 C - Anreicherung in G 1 -G 0 und SG 2 -M Phasen des Zellzyklus. Eine gestrichelte Linie steht für Kohlenstoff-Anreicherung aus natürlichen Massen Isotop. (B) Cytidin MIDs als Array Plots in G gezeigt 1 -G 0 und SG 2 -M - Phasen. Die Fehlerbalken sind Standardabweichungen von drei Messungen. Bitte klicken Sie hier , um die vIEW eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Unsere Methode basiert auf dem Prinzip, dass MIDs in zellulären Metaboliten, die die "Geschichte" des metabolischen Aktivitäten einer Zelle widerspiegeln. Dies macht es möglich, Stoffwechselaktivitäten in Subpopulation von Zellen zu untersuchen, wie sie in der komplexen Gemeinschaft der Zellen erfolgte vor der Zellsortierung Verfahren. Im Gegensatz dazu unterscheiden sich die Peakflächen von Metaboliten deutlich zwischen Extrakten von sortierten Zellen und direkte Extraktion aus der Kulturschale 11. Zum Teil ist dies , da die unterschiedlichen chemischen Zusammensetzung , die die Signalantwort in Massenspektrometrie ändert, einer sogenannten "Matrixeffekt", aber wir haben auch , dass Aminosäuren werden aus den Zellen während des Sortierens, während Zellen in Puffer 11 gehalten werden , verloren gezeigt. Dies kann den metabolischen Zustand und die Aktivitäten der Zellen während des Sortierens verändert, aber dies ist an sich für unser Verfahren irrelevant: vorausgesetzt, dass MIDs maßen nahe zu denjenigen in direkten Extraktion beobachtet, bleiben die Daten a Valid Messung des metabolischen Zustand jeder Subpopulation in der ursprünglichen, komplexe Kultur.
Wir testeten zunächst ein Verfahren, bei dem Zellen direkt in die Extraktionslösung sortiert wurden (Methanol), um schnell den Stoffwechsel löschen. Leider waren die resultierenden Extrakte schwierig zu analysieren, da sie große Mengen an Salzen enthalten sind und möglicherweise andere Verunreinigungen aus dem Zellsortierer Hüllflüssigkeit, was zu massiven Ionensuppression auf der Massenspektrometrie-System. Wir entschieden uns daher auf das hier beschriebene Protokoll, in dem die überschüssige Flüssigkeit durch die Zellsortierer Instrument abgelagert wird vor der Extraktion ausgewaschen.
Unser Protokoll beinhaltet in HBSS, einer physiologischen Salzlösung mit Glucose supplementiert Sortier die Lebensfähigkeit der Zellen aufrecht zu erhalten. metabolischem Stress zu minimieren, wie Aminosäure Leckage in gewisser Hinsicht kann es bevorzugt sein, Zellen in dem eigentlichen Kulturmedium zu sortieren. Es ist jedoch schwierig, die kleinen Pellets aus sortierten Zellen zu waschen, und d daherErz Metaboliten in Medium würde die gesuchten MIDs von intrazellulären Metaboliten verunreinigen. Jedes Mal , wenn 13 C-markiertes Glukose als Tracer verwendet wird, identisch markierte Glukose sollte auch in der HBSS - Lösung verwendet werden.
Wie in Figur 2 zu sehen, viele, aber nicht alle Metaboliten, ihrer MIDs nach der Zellsortierung Verfahren aufrechtzuerhalten. Wir wissen nicht, warum bestimmte Stoffwechselprodukte (Laktat, zum Beispiel) gezielt verändert werden. Dieses Ergebnis unterstreicht, dass es von entscheidender Bedeutung ist, um sicherzustellen, dass MIDs von Interesse sind robust gegenüber der Zelle Verfahren durch Mock Sortierung ist. Obwohl es nicht möglich ist, direkt die MID einer sortierten Subpopulation verifizieren, MIDs, die von mock Sortieranlage unbeeinflußt sind (Glutamat, beispielsweise) als auch von der tatsächlichen Sortierung unbeeinflußt, da das Verfahren, mit Ausnahme der Zellenauswahl identisch ist. Diese Validierung Schritt sollte durchgeführt werden, wenn eine neue Zelltyp oder Kulturbedingungen verwendet wird. Es ist wichtig, darauf hinweisen, dass our Verfahren ist nicht auf Metaboliten beschränkt, für die robuste MIDs auf diese Weise überprüft werden kann.
Wir gehen davon aus, dass das hier beschriebene Verfahren in einer Reihe von Anwendungen in der Zellbiologie und Biomedizin nützlich sein wird. Beispiele umfassen metabolische Phänotypen von co-kultivierten Zellen wie Stammzellen - Kulturen feeder layer, neuron-Astrozyten Modelle 4, Subpopulationen von Blutzellen 2 und auch komplexe Zellpopulationen aus Tiermodellen isoliert.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree - MC - VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20 mm x 2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| Myrsyra 99.5% Optima (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
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