Introduction
Hogere organismen bevatten complexe gemeenschappen van verschillende celtypen die samenwerken om meer complexe functies te brengen. Bijvoorbeeld tumoren bevatten niet alleen kankercellen, maar ook fibroblasten, cellen die bloedvaten vormen, vaak immuuncel infiltraten 1; bloed bevat een complex mengsel van tientallen immuuncel subtypen 2; en zelfs gekweekte cellijnen kunnen bestaan uit meerdere subpopulaties, zoals de luminale en basale subtypes van borstkankercellen 3. Bovendien verschillende celtypen die naast elkaar kunnen metabole "samenwerken" vertonen. Bijvoorbeeld in de hersenen, astrocyten worden verondersteld om glucose om te zetten naar lactaat, die vervolgens "gevoed" neuronen die dit substraat 4 oxideren; T-lymfocyten zijn in sommige contexten afhankelijk aangrenzende dendritische cellen als een bron van cysteïne 5; en kankercellen kunnen samenwerken met assobehorende fibroblasten in tumoren 6. De metabolische gedrag van dergelijke systemen te begrijpen, is het noodzakelijk te scheiden en meten van de metabolische activiteiten van de verschillende celtypen aanwezig.
Verreweg de meest gebruikte methode voor het scheiden van celtypes is fluorescentie-geactiveerde celsortering. Deze werkwijze is breed toepasbaar, mits het celtype of de toestand van belang kan worden "gemerkt" met fluorescerende antilichamen expressie van fluorescente proteïnen, of andere kleurstoffen. Een optie is om in eerste instantie een aparte cellen types door middel van een cel sorter, re-cultuur van de afzonderlijke celtypen verkregen, en vervolgens uit te voeren onderzoek naar het metabolisme van deze culturen 7. Dit is echter alleen mogelijk als het type cel of fenotype stabiel in kweekomstandigheden, en kan transient gedrag vangen zoals celcyclus staten, noch de metabolische samenwerking in co-culturen. Voor dergelijke gevallen moet de stofwisseling direct worden gemeten, zodatrted cellen. Dit is een uitdaging, omdat de celsortering procedure onderwerpt cellen om de spanningen die hun metabolisme 8 kunnen verstoren, en we zijn ons bewust van de weinige studies die deze aanpak 9, 10. In het bijzonder hebben wij gevonden dat belangrijke metabolieten zoals aminozuren kunnen lekken uit cellen in celsortering buffer gehouden, zodat metingen van absolute metaboliet abundantie niet meer betrouwbaar 11 (hoewel relatieve vergelijking tussen gesorteerde fracties nog steeds waardevol kan zijn).
Om deze problemen te omzeilen, We noemen cellen met stabiele isotopen uit te sorteren, en focus op de MID in cellulaire metabolieten, plaats metaboliet abundanties. Sinds MID's worden gevormd over langere tijdschalen, moeten ze minder worden beïnvloed door kortdurende blootstelling aan het sorteren van omstandigheden. We kwantificeren MID's met behulp van full-scan met hoge resolutie massaspectrometrie, die gevoelig genoeg is om da te biedenta op honderden metabolieten vanaf ongeveer 500.000 gesorteerde cellen, die ongeveer 30-60 min van celsortering tijd. Een vergelijking tussen een "mock gesorteerd" controle (cellen doorgegeven via de celsorteerinrichting instrument zonder gating specifieke populatie) en metaboliet extractie direct uit de kweekschaal wordt nagegaan of de waargenomen MID representatief zijn voor die welke in het oorspronkelijke cultuur. Afhankelijk van de keuze van stabiele isotopen kunnen diverse metabole pathways bestudeerd worden met deze methode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Metabolite Extraction
- Extractie uit schotel
- Kweekcellen in een 6-wells plaat in drievoud in stabiele isotoop gelabelde kweekmedia + gedialyseerd supplementen (serum of andere groeisupplementen) tot cellen 75% confluent.
OPMERKING: Hier kweek HeLa cellen gedurende 48 uur in RPMI dat 40% U- 13 C-glucose en 70% U- 13 C, 15 N2-glutamine en 5% gedialyseerd FBS (foetaal runderserum). Gedialyseerd FBS wordt gebruikt om zich te ontdoen van de kleine moleculair gewicht metabolieten die de gelabelde media kunnen besmetten. Het kweken van cellen in aanvulling gedialyseerd voorafgaand aan de werkelijke experiment wordt aanbevolen om te verzekeren cellen worden normaal groeien in het medium. Supplementen worden gedialyseerd in 0,15 M NaCl-oplossing 's nachts met behulp van snake skin dialyse tubing. - Op de dag van de winning teruggooi cultuur media, spoel putten tweemaal met 500 pi koude HBSS en dan gooi hem weg.
LET OP: Hier gebruiken HBSS met 40% U-13 C-glucose omdat het ook in het kweekmedium. - Voeg 600 ul 100% methanol voorgekoeld op droog ijs.
- Breng het gerecht om ijs te drogen en verwijder celmateriaal met een cel schraper.
- pipet voorzichtig de celextracten aan een microcentrifugebuis en bewaar bij -80 ° C tot massaspectrometrie analyse.
- Kweekcellen in een 6-wells plaat in drievoud in stabiele isotoop gelabelde kweekmedia + gedialyseerd supplementen (serum of andere groeisupplementen) tot cellen 75% confluent.
- Extractie van mock gesorteerde cellen
- Kweekcellen in een 100 mm schaal in drievoud in stabiele isotoop gelabelde kweekmedia + gedialyseerd supplementen.
OPMERKING: Hier kweek HeLa cellen gedurende 48 h in 100 mm schaal omdat een groot aantal cellen (4 x 10 ~ 6) nodig zijn gesorteerd 500.000 cellen te verkrijgen. Dit aantal HeLa-cellen extract gehouden is de meting van metabolieten te verkrijgen. De gebruikte kweekmedia was RPMI dat 40% U- 13 C-glucose en 70% U- 13 C, 15 N2-glutamine en 5% gedialyseerd FBS. - Op de dag van de winning, de teruggooi cultuur media, spoel putten wide 1,5 ml warm HBSS en dan gooi hem weg.
- Los cellen door toevoeging van 1,5 ml trypsine / EDTA gedurende 4 min bij 37 ° C. De volgende stappen van 4 ° C of op ijs.
- Deactiveren trypsine door het toevoegen van 3 ml ijskoude HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) + gedialyseerd supplement.
- Verzamel cellen in een 15 ml buis en centrifugeer bij 750 xg gedurende 3 min.
- Resuspendeer de pellet in HBSS + gedialyseerd supplement + 1 mM EDTA bij een concentratie van 1-2 x 10 6 cellen / ml, passeren 40 urn cel zeven tot enkele cellen te verkrijgen en over te dragen aan een 5 ml buis.
- Soort cellen door celsortering gating alleen singlets en centrifugeer gesorteerd cellen bij 750 g gedurende 3 min bij 4 ° C.
LET OP: Hier soort HeLa-cellen met een snelheid 1.000 evenementen / s, met een instrument druk 27 psi, en met behulp van een 100 urn mondstuk. HeLa-cellen zijn groot, dus ze moeten worden gesorteerd in een traag tempo evenement en grote sproeier zo intact pellet mogelijk te krijgen. Houd de cellen in koud blokken throughout sorteren om het metabolisme te verminderen. Een grondige beschrijving van het sorteren procedure is eerder 12 beschreven. - Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 50 ul ijskoud dH 2 O tot een homogeen pellet te verkrijgen voor het toevoegen van methanol. Toevoeging van koude methanol rechtstreeks pellet vormt een stevige pellet die moeilijk te mengen.
- Extract metabolieten door de toevoeging van 540 ul methanol in droog ijs gehouden en houden extracten bij -80 ° C tot vloeistofchromatografie - hoge resolutie massaspectrometrie (LC-HRMS) analyse.
- Kweekcellen in een 100 mm schaal in drievoud in stabiele isotoop gelabelde kweekmedia + gedialyseerd supplementen.
- Extractie van de celcyclus gesorteerde cellen
- Kweekcellen in een 100 mm schaal in drievoud in kweekmedium + gedialyseerd supplementen.
LET OP: Hier kweek HeLa-cellen die Geminin Fucci Green (MAG1-hGem) sonde 13 die het mogelijk maakt voor het sorteren van de G1 (negatief) en SG2M (positief) cellen. Cellen kunnen worden gekweekt in stabiele isotoop opsporen media voor eens lang als nodig. Hier hebben we ze gekweekt gedurende 46 uur in ongelabelde media, dan hebben we naar RPMI dat 40% U- 13 C-glucose en 70% U- 13 C, 15 N2-Glutamine 2 uur voor het begin sortering. Dit werd gedaan om te kunnen de celcyclus fasen korte puls labeling vereist bestuderen. - Op de dag van de winning, de teruggooi cultuur media, spoel putten met 1,5 ml warm HBSS en dan gooi hem weg.
- Los cellen door toevoeging van 1,5 ml trypsine / EDTA gedurende 4 min bij 37 ° C. De volgende stappen van 4 ° C of op ijs.
- Deactiveren trypsine door het toevoegen van 3 ml ijskoude HBSS + gedialyseerd supplement.
- Verzamel cellen in een 15 ml buis en centrifugeer bij 750 xg gedurende 3 min.
- Resuspendeer de pellet in HBSS + gedialyseerd supplement + 1 mM EDTA bij een concentratie van 1-2 x 10 6 cellen / ml, passeren 40 urn cel zeven tot enkele cellen te verkrijgen en over te dragen aan een 5 ml buis.
- Sorteren cellen door de cel sorter gAting puin en wambuizen, dan gating voor de cel merker van interesse, en centrifugeer gesorteerd cellen bij 750 g gedurende 3 min bij 4 ° C.
LET OP: Hier soort HeLa-cellen met een snelheid 1.000 evenementen / s, met een instrument druk 27 psi, en met behulp van een 100 urn mondstuk. Houd de cellen in koud blokken gedurende het sorteren van de stofwisseling te verlagen. - Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 50 ul ijskoud dH 2 O tot een homogeen pellet te verkrijgen voor het toevoegen van methanol. Toevoeging van koude methanol rechtstreeks pellet vormt een stevige pellet die moeilijk te mengen.
- Extraheer de metabolieten door toevoeging van 540 pi methanol in droogijs gehouden en houdt extracten bij -80 ° C totdat LC-HRMS analyse.
- Kweekcellen in een 100 mm schaal in drievoud in kweekmedium + gedialyseerd supplementen.
2. massaspectrometrie Analyse
Let op: Hier het protocol beschrijven we voor het analyseren van celextracten op een LC-HRMS systeem. Elke metabolomics voor de analyse van celextracten worden gebruikt. Volledige scananalyse kan nuttig zijn voor het detecteren van een groot aantal metabolieten.
- Kalibreren van het instrument met behulp van een massaspectrometrie referentiekalibratie mix.
- Dooi celextracten op ijs gedurende 30 min en vortex gedurende 15 s.
- Breng 100 pi van het celextract op een spin filter en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 13.000 xg bij 4 ° C.
- Injecteer 12,5 pl van het filtraat op de LC-HRMS systeem.
- Afzonderlijke metabolieten met een zwitterionen Hydrofiele Interactie vloeistofchromatografie (ZIC-HILIC) kolom (150 mm x 4,6 mm, 5 urn deeltjesgrootte) voorzien van een ZIC-HILIC voorkolom (20 mm x 2,1 mm) met een gradiënt elutie van 0,1% mieren- zuur in water (oplosmiddel A) en acetonitril (oplosmiddel B). Start de gradiëntelutie van 20% oplosmiddel A en verhogen tot 80% in 17 min. Handhaaf dit percentage gedurende 4 minuten met een stroomsnelheid van 400 pL min -1 en kolomtemperatuur en monsterblad bij 23 ° C en 4 ° C.
- Gebruik een instrument gekoppeld aan de chromatografische scheiding van metabolieten detectie verwarmd elektrospray (H-ESI II) in zowel positieve als negatieve modes ionisatiebron, en een volledige scan acquisitiemodus met een massa oplossend vermogen van 70.000 volle breedte half maximum (FWHM) ( m / z 200).
- Gebruik stikstof (zuiverheid> 99,995%) van het omhulsel gas en hulpgas met een debiet van 45 en 10 au (arbitraire eenheden) en stel verdampertemperatuur bij 350 ° C en de electrospray spanning op 4 kV positieve modus -3,5 kV in negatieve mode.
3. Gegevensanalyse
- Selecteer een aantal metabolieten waarvoor normen beschikbaar zijn en die laten zien een goede kwaliteit pieken in de monsters. Goede kwaliteit pieken hoge signaal-ruisverhouding. Het is belangrijk om te verifiëren piek kwaliteit en zorg valse isotopen te omvatten. Isotoop pieken die verschillen in vorm en / of retentietijd waarschijnlijk vals.
- Voor-isotoop gelabelde monsters te berekenen massa isotopomeer (MI) fracties van het piekoppervlak van elk MI delen met totale piekoppervlak van alle MI.
- Bereken de gelabelde koolstof / stikstof fracties verrijking van 13 C en 15 N, respectievelijk, zoals
waarbij n het totale aantal koolstofatomen (of stikstofatomen, respectievelijk) in de metaboliet en MIx is de MI fractie van x.
Opmerking: Alle berekeningen worden uitgevoerd onder toepassing programmeertalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als voorbeeld beschrijven we een experiment onderzoek naar het metabolisme van HeLa cellen gesorteerd volgens celcyclus fase. Een groot aantal centrale metabolieten zowel koolstofatomen en stikstofatomen labelen we gekweekte cellen gedurende 48 uur met gebruik van U-13C-glucose en U- 13 C, 15 N-glutamine als tracers. Rijke MID voor validatieproef verkrijgen we hier gekozen voor een mengsel van 40% U- 13 C-glucose en 70% U- 13 C, 15 N2-Glutamine, als intermediaire niveaus van isotopen meestal meer gevarieerde patronen MI 14 genereren.
Voor de validatie experiment voerden we een gerichte analyse van 85 metabolieten. Na kwaliteitscontroles stappen slechte kwaliteit LC-MS pieken verwijderen, konden we 69 pieken te detecteren in de directe celextracten, waarvan 66 in de mock gesorteerde cellen (96%) waren. 60 van deze leek te worden geëtiketteerd(isotoop verrijking boven natuurlijke overvloed), en in de meeste gevallen hun MID's waren vergelijkbaar tussen gerecht extracten en mock gesorteerde cellen (Figuur 2A). Bijvoorbeeld, de MID glutamaat (die zowel 13 C en 15 N MI's bevat) is gelijk schotel en mock gesorteerd extracten (Figuur 2B) dat aangeeft dat de glutamaat MID ook betrouwbaar gesorteerde celpopulaties. Echter, sommige metabolieten duidelijk beïnvloed door de sorteerinrichting -procedure bijvoorbeeld lactaat had minder 13 C 3 in mock gesorteerde cellen, om onbekende redenen. Dergelijke metabolieten moet worden gezien met de nodige voorzichtigheid bij het analyseren van de gegevens van de werkelijke gesorteerd fracties. Mock gesorteerde cellen, 91% van de gemeten MI fractie had een standaardafwijking van minder dan 1% door biologische triplo, wat aangeeft dat MID waren zeer reproduceerbare in gesorteerde cellen.
We volgende geanalyseerd HeLa gesorteerd in beide G0 / G1 of S / G2 / M celcyclus stages met behulp van de Fucci Geminin sonde 12. Omdat deze celcyclus fasen duren slechts ~ 10 uur, dat we hier "pulse" gemerkt culturen 2 uur naar verschillende isotopen labeling tussen trappen te bereiken. Zo hebben we vastgesteld dat cytidine is gekenmerkt beide populaties, maar een hogere verrijking in de S / G2 / M fase in overeenstemming met verhoogde de novo synthese van nucleotiden in de S-fase (figuur 3). In dit geval, de MID toont hetzelfde patroon in beide fracties, hetgeen suggereert dat dezelfde syntheseweg wordt gebruikt, maar is actiever in de S / G2 / M fase. Deze gegevens tonen dat metabole verschillen gemakkelijk detecteerbaar met deze methode zelfs tussen nauw verwante subpopulaties.
Figuur 1: Experimental design. Workflow voor de voorbereiding van de schotel, mock gesorteerd en gesorteerd subpopulatie extracts. Schotel en mock gesorteerd extracten worden bij de validatie experiment MID van schaal en mock gesorteerd extracten worden vergeleken met testen op mogelijke veranderingen als gevolg van het sorteren. Complexe populatie van cellen wordt gesorteerd op basis marker van het celtype van belang en daarna geëxtraheerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Validatie van MID's tegen directe extracties. Scatter plots van (A) 13 C en 15 N verrijking in schaal en mock gesorteerd samples. Elke stip staat voor een herhaling. Drievoud worden samengevoegd met lijnen. (B) 13 C- 15 N MID's van glutamaat. (C) 13 C MID's lactaat. De fout bars zijn standaarddeviaties van drievoudige measusingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Metabolic verschillen tussen fasen van de celcyclus in HeLa-cellen. Cytidine is verschillend gelabelde in G 1 -G 0 en SG 2 -M cellen. (A) cytidine 13 C verrijking in G 1 -G 0 en SG 2-M fasen van de celcyclus. Binnen de stippellijn staat voor koolstof verrijking van het massa-isotoop natuurlijk. (B) Cytidine MID's getoond als serie plots in G 1 -G 0 en SG 2 -M fasen. De fout bars zijn standaarddeviaties van drievoudige metingen. Klik hier om vIEW een grotere versie van deze figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onze werkwijze is gebaseerd op het principe dat MID in cellulaire metabolieten weerspiegelen de "geschiedenis" van metabolische activiteiten van een cel. Dit maakt het mogelijk om metabolische activiteiten onderzoeken subpopulatie van cellen, zoals ze zich in het complex door cellen, vóór de celsortering procedure. In tegenstelling piekoppervlakken van metabolieten verschillen sterk tussen de extracten van gesorteerde cellen en directe extractie uit de cultuur schotel 11. Voor een deel komt dit omdat de verschillende chemische samenstelling van het signaal in respons massaspectrometrie, een zogenaamd "matrixeffect" verandert, maar we hebben ook aangetoond dat aminozuren verloren cellen tijdens het sorteren, terwijl cellen in buffer 11 worden gehouden. Dit kan tijdens het sorteren van de metabole toestand en de activiteiten van de cellen te veranderen, maar dit is op zichzelf niet relevant voor onze methode: mits MID's zijn redelijk dicht bij die waargenomen in de directe extractie, de data blijft een Valid meting van de metabole toestand van elke subpopulatie in de oorspronkelijke, complex cultuur.
We gekeurde een werkwijze waarbij cellen direct in extractieoplossing (methanol) werden gesorteerd om snel doven metabolisme. Helaas, de verkregen extracten waren moeilijk te analyseren, omdat zij grote hoeveelheden van zouten en mogelijk andere verontreinigingen uit de cel sorteerder sheath vloeistof, resulterend in massale ion onderdrukking onze massaspectrometrie systeem. We vestigden zich daarom op het hier beschreven protocol, waarbij overtollig vocht afgezet door de cel sorter instrument voorafgaand aan de extractie wordt uitgewassen.
Ons protocol houdt in sorteren in HBSS, een fysiologische zoutoplossing, aangevuld met glucose om levensvatbaarheid van de cellen te handhaven. In sommige opzichten, kan het de voorkeur om te sorteren cellen in het werkelijke kweekmedium metabole stress te minimaliseren, zoals aminozuur lekkage. Het is echter moeilijk om de kleine pellet van cellen gesorteerd wassen en thereferts metabolieten aanwezig in medium zou de gezochte MID's van intracellulaire metabolieten besmetten. Wanneer 13-gelabeld glucose wordt gebruikt als een tracer, moeten identiek gelabelde glucose worden gebruikt in de HBSS oplossing ook.
Zoals blijkt uit figuur 2, veel, maar niet alle metabolieten, behouden hun MID na de celsortering procedure. We weten niet waarom bepaalde metabolieten (lactaat, bijvoorbeeld) in het bijzonder worden gewijzigd. Dit resultaat onderstreept dat het van cruciaal belang om te controleren of MID's van belang zijn robuust in de richting van de celsortering procedure mock sorteren. Hoewel het niet mogelijk is de MID direct verifiëren van een subpopulatie gesorteerd moet MID's die niet gevoelig mock sortering (glutamaat, bijvoorbeeld) worden niet beïnvloed door de feitelijke sorteren ook, de procedure identiek behalve de celselectie zijn. Deze validatie stap moet worden uitgevoerd wanneer een nieuw type cel of kweek conditie wordt gebruikt. Het is belangrijk om erop te wijzen dat de our methode wordt beperkt tot metabolieten waar betrouwbare MIDs kunnen worden gecontroleerd op deze manier.
We verwachten dat de hier beschreven werkwijze nuttig is in een aantal toepassingen in cel- biologie en biogeneeskunde. Voorbeelden omvatten metabolische fenotypen van co-gekweekte cellen zoals stamcellen - voedsterlaag culturen, neuron-astrocyten modellen 4, subpopulaties van bloedcellen 2, en ook complexe celpopulaties geïsoleerd uit diermodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree - MC - VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20 mm x 2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| Myrsyra 99.5% Optima (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
References
- Gregersen, P. K. Cell type-specific eQTLs in the human immune system. Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).
- Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).
- Prat, A., et al. Characterization of cell lines derived from breast cancers and normal mammary tissues for the study of the intrinsic molecular subtypes. Breast Cancer Res. Treat. 142 (2), 237-255 (2013).
- Magistretti, P. J., Allaman, I. A Cellular Perspective on Brain Energy Metabolism and Functional Imaging. Neuron. 86 (4), 883-901 (2015).
- Angelini, G., et al. Antigen-presenting dendritic cells provide the reducing extracellular microenvironment required for T lymphocyte activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1491-1496 (2002).
- Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Harris, A. L., Sivridis, E. Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: A metabolic survival role for tumor-associated stroma. Cancer Res. 66 (2), 632-637 (2006).
- Hollenbaugh, J. A., Munger, J., Kim, B. Metabolite profiles of human immunodeficiency virus infected CD4+ T cells and macrophages using LC-MS/MS analysis. Virology. 415 (2), 153-159 (2011).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytom. Part A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Moussaieff, A., et al. High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).
- Johnson, C., et al. A metabolic signature of colon cancer initiating cells. Cancer Metab. 2, 32 (2014).
- Roci, I., et al. Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells. Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).
- Shapiro, H. Practical flow cytometry. , Wiley-Liss. New York. (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Noack, S., Wiechert, W. Quantitative metabolomics: A phantom. Trends Biotechnol. 32 (5), 238-244 (2014).
