Introduction
יצורים עילאיים להכיל קהילות שלמות מורכבות של סוגי תא ברורים כי לשתף פעולה כדי להביא פונקציות מורכבות יותר. לדוגמא, גידולים לכלול לא רק תאים סרטניים, אלא גם פיברובלסטים, תאים המהווים כלי דם, ולעתים קרובות תא חיסון מחלחל 1; דם מכיל תערובת מורכבת של עשרות תת תא חיסון 2; ואפילו שורות תאים בתרבית עשויות להיות מורכבות תת-אוכלוסיות מרובות, כגון לומינל, תת בסיס של תאי סרטן השד 3. יתר על כן, סוגי תא ברורים כי לדור בכפיפה אחת יכול להפגין מטבולית "שיתוף פעולה". לדוגמה, במוח, האסטרוציטים הם חשבו להמיר גלוקוז לקטט, אשר אז "הפד" לנוירונים כי לחמצן מצע זה 4; לימפוציטים מסוג T הם בהקשרים מסוימים תלויים תאים דנדריטים סמוכים כמקור ציסטאין 5; ותאים סרטניים יכולים לשתף פעולה עם Assoפיברובלסטים ciated בגידולים 6. כדי להבין את ההתנהגות המטבולית של מערכות כאלה, חשוב להפריד ולמדוד את הפעילות המטבולית של תאים מסוגים שונים בהווה.
ללא ספק השיטה הנפוצה ביותר להפרדת סוגי תאים היא מיון תא מופעל קרינה. שיטה זו היא החלימה רחב, ובלבד סוג התא או המדינה של עניין ניתן "שכותרתו" באמצעות נוגדני ניאון, ביטוי של חלבוני ניאון מהונדסים, או צבעים אחרים. אפשרות אחת היא סוגי תאים נפרדים בתחילה באמצעות סדרן תא, מחדש תרבות סוגי התאים הבודדים מתקבלים, ולאחר מכן לבצע מחקרים מטבוליזם של תרבויות אלה 7. עם זאת, זה אינו ריאלי רק אם הסוג או פנוטיפ התא יציב בתנאי תרבות, ולא יכול ללכוד התנהגות חולפת כמו מצבי מחזור התא, ולא את שיתוף הפעולה המטבולית שיתוף תרבויות. במקרים כאלה, מטבוליזם חייב להימדד ישירות על כךתאי rted. זה מאתגר מאז מיון תא הליך נושאים לתאים מדגיש כי עלול לעוות את חילוף החומרים שלהם 8, ואנו מודעים רק מעט מחקרי נקיטת גישה זו 9, 10. בפרט, מצאנו כי מטבוליטים גדולים כמו חומצות אמינו עלולים לדלוף מתאים שמרה במאגר מיון תא, כך שמדידות של שפע המטבוליט מוחלט הם כבר לא אמינות 11 (אם כי השוואה יחסית בין שברי מיון עדיין עשויה להיות בעלי ערך).
כדי לעקוף בעיות אלה, אנו תווית תאים עם איזוטופים יציבים לפני מיון, ולהתמקד MIDs מטבוליטים הסלולר, ולא שכיחותם המטבוליט. מאז MIDs נוצרות על סולמות זמן רב יותר, הם צריכים להיות מושפעים פחות על ידי חשיפה קצרת טווח לתנאים מיון. אנחנו לכמת MIDs באמצעות ספקטרומטריית מסה מלאה ברזולוציה גבוהה סריקה, שהוא רגיש מספיק כדי לספק data על מאה מטבוליטים החלו מתאי סביב 500,000 מסודרים, המחייב כ 30-60 דקות של זמן על מיון תא. השוואה בין "מדומה מסודרת" שליטה (תאים עברו מכשיר סדרן תא ללא gating כל אוכלוסייה ספציפית) והפקת המטבוליט ישירות מצלחת התרבות הוא עשתה כדי להבטיח כי MIDs הנצפה הם שמייצגים את התרבות המקורית. בהתאם הבחירה של קליעים נותבים איזוטופ יציב, מסלולים מטבוליים שונים ניתן ללמוד עם שיטה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הפקת המטבוליט
- הפקת מצלחת
- התרבות תאים בצלחת 6-היטב triplicates בתקשורת תרבות יציבה שכותרתו איזוטופ + תוספי dialyzed (סרום או תוספי גדילה אחרים) עד התאים להיות ומחוברות 75%.
הערה: כאן תאי הלה תרבות עבור 48 שעות RPMI המכילות 40% U- 13 C-גלוקוז ו -70% U- 13 C, 15 N2-גלוטמין ו -5% FBS dialyzed (בסרום שור עוברי). Dialyzed FBS משמש להיפטר מטבוליטים משקל מולקולרי קטן אשר עשוי לזהם את התקשורת שכותרתו. Culturing תאים במוסף dialyzed לפני הניסוי האמיתי מומלץ להבטיח התאים גדלים בדרך כלל בטווח הבינוני. תוספים הם dialyzed ב 0.15 פתרון M NaCl לילה באמצעות צינורות עור דיאליזת נחש. - באותו יום של התקשורת בתרבות החילוץ שנזרקו, ולשטוף בארות פעמיים עם 500 μL HBSS קר ולאחר מכן למחוק אותו.
הערה: כאן להשתמש HBSS המכיל 40% U-C-גלוקוז 13 שכן הוא גם בתקשורת ובתרבות. - להוסיף 600 μL 100% מתנול מראש מקורר על קרח יבש.
- מעבירים את צלחת לייבוש קרח ולהסיר את החומרים בתא עם מגרד תא.
- בזהירות פיפטה תמציות לתא צינור ולאחסן microcentrifuge ב -80 ° C עד לניתוח ספקטרומטריית מסה.
- התרבות תאים בצלחת 6-היטב triplicates בתקשורת תרבות יציבה שכותרתו איזוטופ + תוספי dialyzed (סרום או תוספי גדילה אחרים) עד התאים להיות ומחוברות 75%.
- הפקת תאים ממוינים מדומים
- התרבות תאים בצלחת 100 מ"מ triplicates ב + התקשורת והתרבות יציב שכותרתו איזוטופ תוספי dialyzed.
הערה: כאן תאים הלה תרבות במשך 48 שעות בצלחת 100 מ"מ כי מספר גבוה של תאים (~ 4 x 10 6) נדרשים כדי להשיג 500,000 תאים ממוינים. מספר זה של תמצית תאים הלה נדרש להשיג מדידה של מטבוליטים טוב. תקשורת התרבות המשמשת הייתה RPMI המכיל 40% U- 13 C-גלוקוז ו -70% U- 13 C, 15 N2-גלוטמין ו -5% dialyzed FBS. - באותו היום של מיצוי, תקשורת ותרבות שנזרקה, ולשטוף בארות wה- i 1.5 מ"ל חם HBSS ולאחר מכן למחוק אותו.
- ניתוק התאים על ידי הוספת 1.5 טריפסין מ"ל / EDTA במשך 4 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בצע את השלבים הבאים ב 4 ° C או בקרח.
- Deactivate טריפסין על ידי הוספת 3 מ"ל קרח קר HBSS (תמיסת מלח מאוזן של האנק) + תוספת dialyzed.
- איסוף תאים בתוך שפופרת צנטריפוגות 15 מ"ל ב 750 XG במשך 3 דקות.
- Resuspend גלולה ב HBSS + dialyzed תוספת + 1 mM EDTA בריכוז 1-2 x 10 6 תאים / מ"ל, לעבור דרך 40 מיקרומטר מסננות תא להשיג תאים בודדים, ולהעביר צינור 5 מ"ל.
- מיין תאים באמצעות gating סדרן התא רק singlets, ו תאים ממוינים צנטריפוגות ב 750 XG 3 דקות ב 4 ° C..
הערה: כאן מעין תאים הלה בשיעור 1,000 אירועים / s, עם psi 27 בלחץ המכשיר, ושימוש זרבובית 100 מיקרומטר. תאי הלה הם גדולים ולכן הם צריכים להיות מסודרים בקצב אירוע איטי זרבובית גדולה כדי לקבל גלולה ללא פגע ככל האפשר. שמור את התאים בבלוקים קרים throughout מיון כדי להקטין את חילוף החומרים. תיאור מפורט של הליך מיון מתואר בעבר 12. - בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 50 μL קרח קר DH 2 O להשיג גלולה הומוגנית לפני הוספת מתנול. תוספת של מתנול קר ישירות גלול יוצרת גלולה מוצקה שקשה resuspend.
- חלץ מטבוליטים על ידי הוספת 540 μL מתנול שמרו על קרח יבש ולשמור תמציות ב -80 ° C עד כרומטוגרפיה נוזלית - ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה ניתוח (LC-HRMS).
- התרבות תאים בצלחת 100 מ"מ triplicates ב + התקשורת והתרבות יציב שכותרתו איזוטופ תוספי dialyzed.
- הפקת מחזור התא מסודרת תאים
- התרבות תאים בצלחת 100 מ"מ triplicates בתקשורת תרבות + תוספי dialyzed.
הערה: כאן התרבות תאים הלה המכיל Geminin Fucci גרין (mAG1-hGem) בדיקה 13 המאפשר למיון של G1 (שלילי) ו SG2M (חיובי) תאים. תאים יכולים להיות מתורבתים במדיה התחקות איזוטופ יציבים עבורזה עוד נדרש. כאן יש לנו את התרבית אותם במשך 46 שעות ב מדיה ללא תווית, אז אנחנו עברנו RPMI המכיל 40% U- 13 C-גלוקוז ו -70% U- 13 C, 15 N2-גלוטמין 2 שעות לפני תחילת המיון. הדבר נעשה על מנת להיות מסוגל ללמוד את שלבי מחזור התא מחייב תיוג דופק קצר. - באותו יום של מיצוי, התקשורת והתרבות שנזרקו, ולשטוף בארות עם 1.5 מ"ל חם HBSS ולאחר מכן למחוק אותו.
- ניתוק התאים על ידי הוספת 1.5 טריפסין מ"ל / EDTA במשך 4 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בצע את השלבים הבאים ב 4 ° C או בקרח.
- Deactivate טריפסין על ידי הוספת 3 מ"ל קרח קר HBSS + תוספת dialyzed.
- איסוף תאים בתוך שפופרת צנטריפוגות 15 מ"ל ב 750 XG במשך 3 דקות.
- Resuspend גלולה ב HBSS + dialyzed תוספת + 1 mM EDTA בריכוז 1-2 x 10 6 תאים / מ"ל, לעבור דרך 40 מיקרומטר מסננות תא להשיג תאים בודדים, ולהעביר צינור 5 מ"ל.
- תאי מיין הדרך גרם סדרן התאating החוצה פסולת כפילויות, אז gating עבור סמן תא של עניין, תאים ממוינים צנטריפוגות ב 750 XG 3 דקות ב 4 ° C..
הערה: כאן מעין תאים הלה בשיעור 1,000 אירועים / s, עם psi 27 בלחץ המכשיר, ושימוש זרבובית 100 מיקרומטר. שמור את התאים בבלוקים קרים לאורך מיון כדי להקטין את קצב חילוף חומרים. - בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 50 μL קרח קר DH 2 O להשיג גלולה הומוגנית לפני הוספת מתנול. תוספת של מתנול קר ישירות גלול יוצרת גלולה מוצקה שקשה resuspend.
- חלץ את מטבוליטים על ידי הוספת 540 μL מתנול שמרו על קרח יבש ולשמור תמציות ב -80 ° C עד לניתוח LC-HRMS.
- התרבות תאים בצלחת 100 מ"מ triplicates בתקשורת תרבות + תוספי dialyzed.
2. ניתוח ספקטרומטריית מסה
הערה: כאן אנו מתארים את הפרוטוקול לניתוח תמציות תא על מערכת LC-HRMS. כל שיטות metabolomics לניתוח של תמציות התא יכול לשמש. סריקה מלאהניתוח יכול להיות שימושי לצורך גילוי מגוון רחב של מטבוליטים.
- כייל את המכשיר באמצעות שילוב כיול התייחסות ספקטרומטריית מסה.
- תמציות תאי הפשרה על קרח למשך 30 דקות ו מערבולת למשך 15 שניות.
- העברת 100 μL של תמצית התא מסנן ספין צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 13,000 XG ב 4 ° C..
- להזריק 12.5 μL של תסנין על מערכת LC-HRMS.
- מטבוליטים נפרדים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית אינטראקציה zwitterionic הידרופיליות (ZIC-HILIC) טור (150 מ"מ x 4.6 מ"מ, 5 מיקרומטר גודל החלקיקים) המצויידים טור השומר ZIC-HILIC (20 מ"מ × 2.1 מ"מ) באמצעות elution שיפוע של פורמית 0.1% חומצה במים (ממס) ו אצטוניטריל (B ממס). הפעל את elution שיפוע של 20% ממס A ו- להגדיל עד 80% ב -17 דקות. לשמור על אחוז זה במהלך 4 דקות עם זרימה של 400 μL דקות -1 וטמפרטורת טור ומגש מדגם ב 23 מעלות צלזיוס ו 4 ° C, בהתאמה.
- השתמש instrument מצמידים את ההפרדה chromatographic לגילוי מטבוליטים, electrospray מחוממת (H-ESI II) בשני מצבים חיוביים ושליליים כמקור יינון, לבין מצב הרכישה סריקה מלאה בכל הכוח בפתרון המוני של 70,000 מלא רוחב חצי מקסימום (FWHM) ( מ '/ z 200).
- השתמש חנקן (טוהר> 99.995%) עבור גז נדן וגז עזר בקצב זרימה של 45 ו -10 au (יחידות שרירותיות) וטמפרטורה מאדה להגדיר ב 350 ° C ואת מתח electrospray ב 4 ק במצב חיובי -3.5 kV במצב שלילי.
.3 ניתוח נתונים
- בחר מספר מטבוליטים עבורו סטנדרטים זמינים אשר מראים פסגות באיכות טובה בדגימות. יש פסגות באיכות טובות אות גבוהה יחס רעש. חשוב לוודא איכות שיא ולוודא שלא לכלול איזוטופים שווא. פסגות איזוטופים אשר נבדלות צורה ו / או זמן שמירה הן שקריות סבירות.
- לקבלת דוגמיות שכותרתו איזוטופ לחשב isotopomer מסה (MI) שברים על ידי חלוקת אזור השיא של כל MI עם אזורי שיא כוללים של כל MIS.
- חישוב שברי פחמן / חנקן שכותרתו, העשרה של 13 C ו -15 N, בהתאמה, כפי
כאשר n הוא המספר הכולל של פחמנים (או חנקנים, בהתאמה) המטבוליט, ומערבבים הוא שבריר MI של x.
הערה: כל החישובים יכולים להתבצע באמצעות שפות תכנות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדוגמא, כאן אנו מתארים ניסוי חוקר את חילוף החומרים של תאים הלה ממוין לפי שלב מחזור התא. כדי לתייג מגוון רחב של מטבוליטים מרכזיים משני פחמנים חנקנים, אנו בתרבית תאים עבור 48 שעות באמצעות U- 13 C-גלוקוז U- 13 C, 15 N-גלוטמין קליעים נותבים. כדי להשיג MIDs העשיר לניסוי האימות, אנחנו כאן בוחרים תערובת של 40% U- 13 C-גלוקוז ו -70% U- 13 C, 15 N2-גלוטמין, כמו רמות ביניים של איזוטופים נוטות ליצור דפוסי MI מגוונים יותר 14.
לצורך הניסוי אימות ביצענו ניתוח ממוקד של 85 מטבוליטים. לאחר באיכות שולטת צעדים להסרה באיכות ירודות פסגות LC-MS, הצלחנו לזהות 69 פסגות תמציות התא הישירות, מתוכם 66 נכחו תאים ממוינים ודגמים (96%). 60 מהן הופיעו להיות מתויגים(העשרה איזוטופ מעל שפע טבעי), וברוב המקרים MIDs שלהם היו דומות בין תמציות מאכל תאים ממוינים ודגמים (איור 2 א). לדוגמה, באמצע של גלוטמט (הכולל הן 13 C ו -15 N MIS) דומה בין צלחת ותמציות מסודרים ודגמים (איור 2 ב), המציין כי גלוטמט MID הוא אמין גם אוכלוסיות תאים ממוינים. עם זאת, מטבוליטים מסוימים מושפעים באופן ברור על ידי הליך המיון: למשל, היה לקטט פחות 13 C 3 בתאים מדומים מסודרים, מסיבות לא ידועות. מטבוליטים כזה יש לראות בזהירות בעת ניתוח נתונים מתוך שברים מסודרים בפועל. בתאים מדומים מסודרים, 91% של השבר המדוד MI היו סטיית תקן פחות מ -1% על פני triplicates הביולוגי, המציין כי MIDs היה לשחזור מאוד תאים ממוינים.
אנחנו הבא ניתחו הלה למיינם או G0 / G1 או S / G2 / מחזור התא M יםTages באמצעות החללית FUCCI Geminin 12. בגלל שלבי מחזור התא אלה האחרונים רק ~ 10 שעות, אנחנו כאן תרבויות "דופק" שכותרתו עבור 2 שעות כדי להשיג תיוג איזוטופ שונים בין שלבים. לדוגמא, אנו ציינו כי cytidine מסומן בין שני האוכלוסיות, אלא העשרה גבוהה ב- S / G2 / M הבמה, עולה בקנה אחד עם סינתזת דה נובו מוגברת נוקלאוטידים בשלב S (איור 3). במקרה זה, האמצע מראה את אותו הדפוס בשני השברים, דבר המצביע על כך מסלול סינתזה אותה משמש, אבל הוא פעיל יותר S / G2 / M הבמה. נתונים אלה מראים כי ההבדלים מטבולית ניתנים לזיהוי בקלות על ידי שיטה זו גם בין תת-אוכלוסיות קשורים זה לזה.
איור 1: עיצוב ניסיוני. Workflow להכנת מנה, מעושה מסודר וממוין תת-אוכלוסייה נוספתCTS. תמציות מסודרות תבשיל מדומה משמשות MIDs ניסוי אימות של מאכל ותמציות מסודרות מדומה מושווי בדיקה לגבי שינויים אפשריים עקב מיון. האוכלוסייה מורכבת של תאים ממוינים לפי סמן של סוג תא של עניין ולאחר מכן חילוץ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: אימות של MIDs נגד עקירות ישירות. פיזור חלק (א) 13 ג ו -15 N העשרת צלחת דגימות מסודרות מדומה. כל נקודה מייצגת לשכפל. Triplicates מצטרף עם קווים. (ב) 13 C- 15 N MIDs של גלוטמט. (ג) 13 C MIDs של לקטט. ברי השגיאה מציינים את סטיית התקן של צפחות בשלושה עותקיםrements. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: הבדלים מטבולית בין שלבי מחזור התא בתאים הלה. Cytidine מתויג שונה בסול 1 -G 0 ו SG 2 -M תאים. (א) Cytidine 13 C העשרה בסול 1 -G 0 ו SG 2 -M שלבי מחזור התא. קו מקווקו מייצג עשרה הפחמן איזוטופ ההמוני הטבעי. (ב) Cytidine MIDs כפי שמוצג מגרשים מערך בסול 1 -G 0 ו SG 2 -M שלבים. ברי השגיאה מציינים את סטיית התקן של מדידות בשלושה עותקים. אנא לחץ כאן כדי נiew גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה שלנו מבוססת על העיקרון כי MIDs מטבוליטים הסלולר לשקף את "ההיסטוריה" של פעילות מטבולית של התא. זה מאפשר לחקור פעילויות מטבוליים תת-אוכלוסייה של תאים, בעת התרחשותם בקהילה הסבוכה של תאים, לפני הליך מיון התא. לעומת זאת, באזורי שיא של מטבוליטים שונים באופן ניכר בין התמציות של תאים ממוינים והפקה ישירה מצלחת התרבות 11. בחלק זה הוא כי ההרכב הכימי השונה משנה את תגובת האות ספקטרומטריית מסה, "אפקט מטריקס" כביכול, אבל אנחנו גם הראינו כי חומצות אמינו הם אבדו מתאים במהלך מיון, תוך תאים נשמרים במאגר 11. זה עשוי לשנות את המצב ופעילות מטבולית של תאים במהלך מיון, אבל זה כשלעצמו לא רלוונטי עבור השיטה שלנו: ובלבד MIDs הם די קרוב לאלו שנצפו חילוץ ישיר, הנתונים נשארים הוואלימדידה ד של המצב מהטבולים של כל תת-אוכלוסייה בתרבות המורכבת, המקורית.
אנחנו בתחילה נבדקים שיטה שבה תאים מוינו ישירות לתוך פתרון חילוץ (מתנול) להרוות מטבוליזם במהירות. למרבה הצער, תמציות וכתוצאה מכך היה קשה לנתח, הם הכילו כמויות גבוהות של מלחים ואולי מזהמים אחרים מהעמוד בו נוזל נדן התא סדרן, וכתוצאה מכך דיכוי יון מסיבי על מערכת ספקטרומטריית מסה שלנו. לפיכך מיקמנו על הפרוטוקול המתואר כאן, שבו הנוזלים העודפים שהופקדו על ידי המכשיר סדרן התא הוא נשטף לפני מיצוי.
פרוטוקול שלנו כרוך מיון HBSS, תמיסת מלח פיזיולוגית בתוספת גלוקוז כדי לשמור על כדאיות התא. במובנים מסוימים, זה עשוי להיות עדיף למיין תאים במדיום התרבות בפועל כדי למזער מתח מטבוליות כגון דליפת חומצת אמינו. עם זאת, קשה לשטוף את הכדור הקטן של תאים ממוינים, ו Therefמטבוליטים עפרות נוכחיים במדיום יטמאו את MIDs בקש של מטבוליטים התאיים. בכל פעם 13 גלוקוז C שכותרתו משמש נותב, גלוקוז שכותרתו זהה אמור לשמש פתרון HBSS גם כן.
כפי שניתן לראות באיור 2, רב, אך לא כולם מטבוליטים, לשמור MIDs שלהם לאחר הליך מיון התא. אנחנו לא יודעים למה מטבוליטים מסוימים (לקטט, למשל) הם שינו באופן ספציפי. תוצאה זו מדגישה כי חשוב מאוד לוודא כי MIDs עניין הם חזקים כלפי תא מיון הליך על ידי מיון מדומה. למרות זאת הוא לא ניתן לאמת את MID ישירות של תת-אוכלוסייה מסודרת, MIDs כי אינם מושפעים על ידי מיון ודגמים (גלוטמט, למשל) צריך להיות מושפע בפועל מיון וכן, כמו ההליך הוא זהה למעט בחירת התא. שלב אימות זה צריכה להתבצע בכל פעם מצב סוג או תרבית תאים חדש משמש. חשוב לציין כי oשיטת ur מוגבלת מטבוליטים עבורו MIDs החזק ניתן לאמת באופן זה.
אנו צופים כי השיטה המתוארת כאן תהיה שימושית במספר היישומים בתוך ביולוגיה של תא ביו. דוגמאות כוללות פנוטיפים המטבולית של תאי שיתוף תרבותי כגון תאי גזע - תרבויות שכבת מזין, מודלי נוירון astrocyte 4, תת-אוכלוסיות של תאי דם 2, וגם אוכלוסיות תאים מורכבות מבודדות במודלים של בעלי חיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree - MC - VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20 mm x 2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| Myrsyra 99.5% Optima (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
References
- Gregersen, P. K. Cell type-specific eQTLs in the human immune system. Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).
- Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).
- Prat, A., et al. Characterization of cell lines derived from breast cancers and normal mammary tissues for the study of the intrinsic molecular subtypes. Breast Cancer Res. Treat. 142 (2), 237-255 (2013).
- Magistretti, P. J., Allaman, I. A Cellular Perspective on Brain Energy Metabolism and Functional Imaging. Neuron. 86 (4), 883-901 (2015).
- Angelini, G., et al. Antigen-presenting dendritic cells provide the reducing extracellular microenvironment required for T lymphocyte activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1491-1496 (2002).
- Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Harris, A. L., Sivridis, E. Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: A metabolic survival role for tumor-associated stroma. Cancer Res. 66 (2), 632-637 (2006).
- Hollenbaugh, J. A., Munger, J., Kim, B. Metabolite profiles of human immunodeficiency virus infected CD4+ T cells and macrophages using LC-MS/MS analysis. Virology. 415 (2), 153-159 (2011).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytom. Part A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Moussaieff, A., et al. High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).
- Johnson, C., et al. A metabolic signature of colon cancer initiating cells. Cancer Metab. 2, 32 (2014).
- Roci, I., et al. Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells. Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).
- Shapiro, H. Practical flow cytometry. , Wiley-Liss. New York. (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Noack, S., Wiechert, W. Quantitative metabolomics: A phantom. Trends Biotechnol. 32 (5), 238-244 (2014).
