Introduction
les organismes supérieurs contiennent des communautés complexes de types cellulaires distincts qui collaborent pour réaliser des fonctions plus complexes. Par exemple, les tumeurs contiennent non seulement les cellules cancéreuses, mais aussi des fibroblastes, des cellules qui constituent les vaisseaux sanguins et de cellules immunitaires souvent infiltrats 1; sang contient un mélange complexe de plusieurs dizaines de sous - types de cellules immunitaires 2; et même des lignées cellulaires cultivées peuvent être constituées de plusieurs sous - populations, comme l'luminale et les sous - types de base de cellules de cancer du sein 3. De plus, les types de cellules distinctes qui coexistent peut présenter métabolique "collaboration". Par exemple, dans le cerveau, les astrocytes sont pensés pour convertir le glucose en lactate qui est ensuite «alimenté» pour les neurones qui oxydent ce substrat 4; Les lymphocytes T sont dans certains contextes , qui dépendent des cellules dendritiques adjacentes en tant que source de cystéine 5; et les cellules cancéreuses peuvent collaborer avec des assofibroblastes ciés dans les tumeurs 6. Pour comprendre le comportement métabolique de tels systèmes, il est nécessaire de séparer et de mesurer les activités métaboliques des différents types présents de cellules.
De loin, la méthode la plus largement utilisée pour séparer les types de cellules est le tri cellulaire activé par fluorescence. Ce procédé est largement applicable, à condition que le type de cellule ou d'un état d'intérêt peuvent être "marqués" en utilisant des anticorps fluorescents, l'expression de protéines fluorescentes modifiées, ou d'autres colorants. Une option est de types de cellules initialement séparées par un trieur de cellules, re-culture les types cellulaires individuels obtenus, puis effectuer des études sur le métabolisme de ces cultures 7. Toutefois, cela est seulement possible si le type de cellule ou d'un phénotype est stable dans des conditions de culture, et ne peuvent pas capturer le comportement transitoire tels que les états du cycle cellulaire, ni la coopération métabolique dans les co-cultures. Pour de tels cas, le métabolisme doit être mesurée directement sur tantcellules rted. Cela est difficile car la cellule procédure de tri soumet les cellules à des contraintes qui peuvent fausser leur métabolisme 8, et nous sommes conscients de seulement quelques études qui suivent cette approche 9, 10. En particulier, nous avons constaté que les principaux métabolites tels que les acides aminés peuvent fuir à partir de cellules conservées dans un tampon de tri cellulaire, de sorte que les mesures de l' abondance absolue des métabolites ne sont plus fiables 11 (bien que la comparaison relative entre fractions triées peut encore être utile).
Pour contourner ces problèmes, nous appelons les cellules avec des isotopes stables avant le tri, et de se concentrer sur les MIDs en métabolites cellulaires, plutôt que les abondances métabolites. Depuis MIDs sont formés sur des échelles de temps plus longues, ils devraient être moins affectés par l'exposition à court terme à des conditions de tri. Nous quantifions MIDs utilisant-balayage complet à haute résolution spectrométrie de masse, ce qui est assez sensible pour fournir data sur des centaines de métabolites à partir de environ 500.000 cellules triées, nécessitant environ 30-60 min de la cellule de temps à trier. Une comparaison entre un "mock triée" contrôle (cellules transmises à travers l'instrument de trieur de cellules sans gating une population spécifique) et l'extraction des métabolites directement à partir de la boîte de culture est faite pour veiller à ce que les MIDs observés sont représentatifs de ceux de la culture d'origine. En fonction du choix des traceurs isotopiques stables, diverses voies métaboliques peuvent être étudiés par cette méthode.
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Protocol
1. Métabolite Extraction
- Extraction du plat
- les cellules de culture dans une plaque à 6 puits en triple dans isotope marqué les milieux de culture stables + suppléments dialysés (sérum ou autres suppléments de croissance) jusqu'à ce que les cellules deviennent 75% confluentes.
Remarque: ici , la culture des cellules HeLa pendant 48 h dans un milieu RPMI contenant 40% U- 13 C-glucose et 70% U- 13 C, 15 N2-glutamine et 5% de FBS dialyse (sérum bovin fœtal). Dialysée FBS est utilisé pour se débarrasser des petits métabolites de poids moléculaire qui pourrait contaminer les médias étiquetés. La culture de cellules en supplément dialysée avant l'expérience réelle est recommandée pour assurer les cellules se développent normalement dans le milieu. Les suppléments sont dialysées dans 0,15 M de NaCl solution durant la nuit en utilisant un tube de dialyse de la peau de serpent. - Au jour de l'extraction défausse des milieux de culture, rincer les puits deux fois avec HBSS 500 ul froide, puis jetez-le.
REMARQUE: Ici utiliser HBSS contenant 40% U-13C-glucose car il est aussi dans le milieu de culture. - Ajouter 600 pi à 100% de méthanol pré-refroidi sur de la glace sèche.
- Transférez le plat pour sécher la glace et enlever de la matière cellulaire avec un grattoir cellulaire.
- Pipetter prudemment les extraits cellulaires à un tube de microcentrifugeuse et conserver à -80 ° C jusqu'à l'analyse par spectrométrie de masse.
- les cellules de culture dans une plaque à 6 puits en triple dans isotope marqué les milieux de culture stables + suppléments dialysés (sérum ou autres suppléments de croissance) jusqu'à ce que les cellules deviennent 75% confluentes.
- Extraction de cellules triées simulacres
- les cellules de la culture dans une boîte de 100 mm en triple en isotopes étiquetés milieux de culture + suppléments dialysés stables.
NOTE: Voici la culture des cellules HeLa pendant 48 h à 100 mm plat car un nombre élevé de cellules (~ 4 x 10 6) sont nécessaires pour obtenir 500.000 cellules triées. Ce nombre de HeLa extrait de cellules a été nécessaire pour obtenir une bonne mesure des métabolites. Le milieu de culture utilisé était RPMI contenant 40% U- 13 C-glucose et 70% U- 13 C, 15 N2-glutamine et 5% de FBS dialyse. - Au jour de l'extraction, les milieux de culture défausse, rincer les puits with chaud 1,5 ml de HBSS, puis jetez-le.
- Détacher les cellules en ajoutant 1,5 trypsine mL / EDTA pendant 4 minutes à 37 ° C. Effectuez les étapes suivantes dans 4 ° C ou dans de la glace.
- Désactiver la trypsine en ajoutant 3 ml de glace HBSS froid (solution saline équilibrée de Hank) + supplément dialysée.
- Recueillir les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et à 750 g pendant 3 min.
- Reprendre le culot dans HBSS + dialysée supplément + 1 mM EDTA à une concentration de 1-2 x 10 6 cellules / mL, passent à travers 40 um crépines de cellules pour obtenir des cellules individuelles, et transférer dans un tube de 5 ml.
- Trier les cellules par trieur de cellules gating seulement pour singulets, et les cellules de centrifugation triées à 750 g pendant 3 min à 4 ° C.
NOTE: Voici trier les cellules HeLa à un taux de 1000 événements / s, avec la pression de l'instrument 27 psi, et en utilisant une buse de 100 um. Les cellules HeLa sont grandes de sorte qu'ils doivent être triés à un taux d'événement lent et large buse pour obtenir culot aussi intact que possible. Gardez les cellules dans des blocs froids throughout tri pour diminuer le métabolisme. Une description détaillée de la procédure de tri est décrit précédemment 12. - Jeter le surnageant et remettre le culot dans 50 ul de la glace dH froide 2 O pour obtenir un culot homogène avant d' ajouter du méthanol. L'addition de méthanol froid directement à granulés forme une pastille solide qui est difficile à remettre en suspension.
- Extrait métabolites en ajoutant 540 ul de méthanol maintenu dans la glace sèche et de garder des extraits à -80 ° C jusqu'à ce que la chromatographie liquide - spectrométrie de masse à haute résolution (LC-HRMS) analyse.
- les cellules de la culture dans une boîte de 100 mm en triple en isotopes étiquetés milieux de culture + suppléments dialysés stables.
- Extraction du cycle cellulaire des cellules triées
- les cellules de la culture dans une boîte de 100 mm en triple dans les milieux de culture + suppléments dialysés.
NOTE: Voici la culture des cellules HeLa contenant Géminine Fucci Green (mag1-hGem) sonde 13 qui permet le tri de G1 (négatif) et SG2M cellules (positives). Les cellules peuvent être cultivées dans des milieux d'isotopes stables pour un traçages longtemps que nécessaire. Ici , nous les avons mis en culture pendant 46 h dans des milieux non marqué, nous sommes passés à RPMI contenant 40% U- 13 C-glucose et 70% U- 13 C, 15 N2-glutamine 2 h avant de commencer le tri. Cela a été fait afin d'être en mesure d'étudier les phases du cycle cellulaire qui exige un étiquetage à impulsions courtes. - Au jour de l'extraction, les milieux de culture défausse, rincer les puits avec 1,5 mL HBSS chaud puis le jeter.
- Détacher les cellules en ajoutant 1,5 trypsine mL / EDTA pendant 4 minutes à 37 ° C. Effectuez les étapes suivantes dans 4 ° C ou dans de la glace.
- Désactiver la trypsine en ajoutant 3 ml de glace froide HBSS + supplément dialysée.
- Recueillir les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et à 750 g pendant 3 min.
- Reprendre le culot dans HBSS + dialysée supplément + 1 mM EDTA à une concentration de 1-2 x 10 6 cellules / mL, passent à travers 40 um crépines de cellules pour obtenir des cellules individuelles, et transférer dans un tube de 5 ml.
- Trier les cellules à travers le trieur de cellules gAting les débris et les doublets, puis gating pour le marqueur de cellule d'intérêt, et les cellules de centrifugation triées à 750 g pendant 3 min à 4 ° C.
NOTE: Voici trier les cellules HeLa à un taux de 1000 événements / s, avec la pression de l'instrument 27 psi, et en utilisant une buse de 100 um. Gardez les cellules dans des blocs froids tout au long de tri pour diminuer le taux de métabolisme. - Jeter le surnageant et remettre le culot dans 50 ul de la glace dH froide 2 O pour obtenir un culot homogène avant d' ajouter du méthanol. L'addition de méthanol froid directement à granulés forme une pastille solide qui est difficile à remettre en suspension.
- Extraire les métabolites en ajoutant 540 ul de méthanol maintenu dans la glace sèche et de garder des extraits à -80 ° C jusqu'à l'analyse LC-HRMS.
- les cellules de la culture dans une boîte de 100 mm en triple dans les milieux de culture + suppléments dialysés.
2. Analyse de spectrométrie de masse
Note: Nous décrivons ici le protocole d'analyse des extraits de cellules sur un système LC-HRMS. Toutes les méthodes de la métabolomique pour l'analyse d'extraits cellulaires peuvent être utilisés. Scan completl'analyse pourrait être utile pour la détection d'un large éventail de métabolites.
- Calibrer l'appareil en utilisant un étalonnage mix de référence de la spectrométrie de masse.
- des extraits cellulaires Décongeler sur la glace pendant 30 minutes et le vortex pendant 15 s.
- Transférer 100 pl de l'extrait cellulaire à un filtre et centrifuger pendant 10 min à 13 000 xg à 4 ° C.
- Injecter 12,5 ul du filtrat sur le système LC-HRMS.
- métabolites distincts à l'aide d'une interaction hydrophile zwitterionique chromatographie liquide (ZIC-HILIC) colonne (150 mm x 4,6 mm, 5 um de taille de particule) équipé d'une colonne de garde ZIC-HILIC (20 mm x 2,1 mm) en utilisant un gradient d'élution de 0,1% acide formique l'acide dans l'eau (solvant A) et de l'acétonitrile (solvant B). Démarrer l'élution en gradient à 20% de solvant A et augmenter jusqu'à 80% en 17 min. Maintenir ce pourcentage pendant 4 minutes avec un débit de 400 ul min -1 et la température de la colonne et le plateau d'échantillon à 23 ° C et 4 ° C, respectivement.
- Utilisez un iNSTRUMENT couplée à la séparation chromatographique pour la détection de métabolites, d'un électrospray chauffé (H-ESI II) dans les deux modes positif et négatif en tant que source d'ionisation, et un mode d'acquisition scan complet à un pouvoir de résolution en masse de 70 000 largeur à mi-hauteur (FWHM) ( m / z 200).
- Utilisez l'azote (pureté> 99,995%) pour le gaz de gaine et gaz auxiliaire à un débit de 45 et 10 au (unités arbitraires) et régler la température de vaporisation à 350 ° C et la tension d'électronébulisation à 4 kV en mode positif et -3,5 kV en mode négatif.
Analyse 3. Données
- Sélectionnez un certain nombre de métabolites pour lesquels des normes sont disponibles et qui montrent de bons pics de qualité dans les échantillons. De bons pics de qualité ont élevé le rapport signal sur bruit. Il est important de vérifier la qualité de pointe et assurez-vous de ne pas inclure de faux isotopes. pics isotopiques qui diffèrent dans la forme et / ou le temps de rétention sont susceptibles faux.
- Pour les échantillons marqués par des isotopes calculer isotopomère masse (MI) fractions en divisant la zone de pointe de chaque MI avec des zones totales de pointe de tous les MIs.
- Calculer les fractions carbone / azote marqué, l' enrichissement de 13 C et 15 N, respectivement,
où n est le nombre total de carbones (ou azotes, respectivement) dans le métabolite, et MIx est la fraction MI de x.
NOTE: Tous les calculs peuvent être effectués en utilisant des langages de programmation.
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Representative Results
A titre d'exemple, nous décrivons ici une expérience d'instruction du métabolisme des cellules HeLa triés en fonction de la phase du cycle cellulaire. Étiqueter un large éventail de métabolites centraux sur les deux atomes de carbone et des atomes d' azote, on a cultivé les cellules pendant 48 heures en utilisant U- 13 C-glucose et U- 13 C, 15 N-glutamine comme traceurs. Pour obtenir MID riche pour l'expérience de validation, on a choisi ici un mélange de 40% U- 13 C-glucose et 70% U- 13 C, 15 N2-Glutamine, car les niveaux intermédiaires d'isotopes ont tendance à générer des motifs de MI plus variés 14.
Pour l'expérience de validation nous avons effectué une analyse ciblée de 85 métabolites. Après les contrôles de qualité des mesures pour éliminer les pauvres pics de qualité LC-MS, nous avons pu détecter 69 pics dans les extraits cellulaires directs, dont 66 étaient présents dans les simulacres triés cellules (96%). 60 d'entre eux semblaient être étiquetés(isotope enrichissement supérieur à l' abondance naturelle), et dans la plupart des cas , leurs MIDs étaient similaires entre les extraits de plat et les cellules simulacres triées (Figure 2A). Par exemple, le MID du glutamate (qui comprend à la fois 13 C et 15 N MIs) est similaire entre plat et extraits triés simulacres (figure 2B), indiquant que le glutamate MID est fiable aussi dans les populations de cellules triées. Cependant, certains métabolites sont clairement affectés par la procédure de tri: par exemple, le lactate eu moins 13 C 3 dans les cellules triées simulacres, pour des raisons inconnues. Ces métabolites doivent être considérés avec prudence lors de l'analyse des données provenant des fractions triées réelles. Dans les cellules triées simulacres, 91% de la fraction mesurée MI avait un écart-type inférieur à 1% sur triplicats biologiques, indiquant que MIDs étaient hautement reproductibles dans des cellules triées.
Nous avons ensuite analysé HeLa classée dans l'G0 / G1 ou S / G2 / cycle cellulaire M stages utilisant la sonde FUCCI Géminine 12. Parce que ces étapes du cycle cellulaire ne durent que ~ 10 h, nous ici "impulsions" marqué cultures pendant 2 heures pour atteindre différents marquage isotopique entre les étapes. Par exemple, nous avons constaté que la cytidine est marqué dans les deux populations, mais à un enrichissement plus élevé dans le rapport S / G2 / M stade, compatible avec une synthèse accrue de novo des nucléotides au cours de la phase S (figure 3). Dans ce cas, le MID montre le même schéma dans les deux fractions, ce qui suggère que même voie de synthèse est utilisé, mais il est plus actif dans le S / G2 / M stade. Ces données montrent que les différences métaboliques sont facilement détectables par cette méthode, même entre les sous-populations étroitement apparentées.
Figure 1: La conception expérimentale. Flux de travail pour la préparation du plat, maquette triée et sous-population supplémentaire triéects. extraits triés Dish et maquettes sont utilisées dans les MIDs d'expériences de validation de plat et d'extraits triés simulés sont comparés à l'essai pour les changements possibles en raison de tri. population complexe de cellules est triée en fonction de marqueur du type cellulaire d'intérêt, puis extrait. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Validation des MIDs contre extractions directes. Les diagrammes de dispersion de (A) 13 C et 15 N enrichissement dans un plat et les échantillons triés simulacres. Chaque point représente une réplique. Triplicats sont reliés par des lignes. (B) 13 C- 15 N MIDs de glutamate. (C) 13 C MIDs de lactate. Les barres d'erreur sont les écarts-types de mesu triplicategences. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Les différences métaboliques entre les phases du cycle cellulaire dans les cellules HeLa. Cytidine est étiqueté différemment dans G 1 -G 0 et SG 2 -M cellules. (A) cytidine 13 C enrichissement en G 1 -G 0 et SG 2 -M phases du cycle cellulaire. La ligne pointillée représente l'enrichissement en carbone à partir de l'isotope de masse naturelle. (B) cytidine MIDs représenté comme parcelles de tableau dans G 1 -G 0 et SG 2 -M phases. Les barres d'erreur sont les écarts-types de mesures en triple. S'il vous plaît cliquez ici pour vIEW une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Notre méthode est basée sur le principe que MIDs dans les métabolites cellulaires reflètent l ' «histoire» des activités métaboliques d'une cellule. Ceci permet d'étudier les activités métaboliques dans les sous- population de cellules, car ils se sont produits dans le milieu complexe de cellules, préalablement à la procédure de tri cellulaire. En revanche, les zones de pointe de métabolites diffèrent sensiblement entre les extraits de cellules triées et extraction directe à partir de la boîte de culture 11. En partie , ceci est parce que la composition chimique différente modifie la réponse du signal en spectrométrie de masse, une soi-disant "effet de matrice", mais nous avons également démontré que les acides aminés sont perdus par les cellules au cours de tri, tandis que les cellules sont conservées dans un tampon 11. Cela peut modifier l'état et les activités des cellules métaboliques lors du tri, mais cela est en soi sans importance pour notre méthode: à condition que MIDs sont raisonnablement proches de celles observées dans l'extraction directe, les données restent un pièd la mesure de l'état métabolique de chaque sous-population dans la culture complexe d'origine.
Nous avons d'abord testé une méthode où les cellules ont été triées directement dans la solution d'extraction (méthanol) pour étancher rapidement le métabolisme. Malheureusement, les extraits résultants ont été difficiles à analyser, car ils contiennent des quantités élevées de sels et éventuellement d'autres contaminants à partir du liquide de la gaine de trieur de cellules, ce qui entraîne la suppression d'ions massive sur le système de spectrométrie de masse. Par conséquent nous avons choisi le protocole décrit ici, où l'excès de liquide déposé par l'appareil de tri de cellules est éliminé par lavage avant l'extraction.
Notre protocole de tri consiste dans HBSS, une solution de sel physiologique additionné de glucose pour maintenir la viabilité des cellules. À certains égards, il peut être préférable de trier les cellules dans le milieu de culture réelle pour minimiser le stress métabolique, tels que des fuites d'acides aminés. Cependant, il est difficile de laver la petite pastille de cellules triées et therefmétabolites de minerai présents dans le milieu contamineraient les MIDs recherchés de métabolites intracellulaires. 13 chaque fois que le glucose marqué au carbone est utilisé comme traceur, du glucose marqué identique doit être utilisé dans la solution HBSS aussi.
Comme on le voit sur la figure 2, plusieurs, mais pas tous les métabolites, conservent leurs MID après l'opération de tri cellulaire. Nous ne savons pas pourquoi certains métabolites (lactate, par exemple) sont spécifiquement modifiés. Ce résultat souligne qu'il est crucial de vérifier que MIDs d'intérêt sont robustes vers la cellule de tri procédure par tri simulée. Bien qu'il ne soit pas possible de vérifier directement le MID d'une sous-population triée, MIDs qui ne sont pas affectés par le tri mock (glutamate, par exemple) devraient être affectés par le réel de tri ainsi, car la procédure est identique, sauf pour la sélection de cellules. Cette étape de validation doit être effectuée chaque fois qu'une nouvelle condition de type ou de la culture cellulaire est utilisé. Il est important de souligner que our méthode est limitée aux métabolites pour lesquels MIDs robustes peuvent être vérifiés de cette manière.
Nous prévoyons que la méthode décrite ici sera utile dans un certain nombre d'applications dans la biologie cellulaire et de la biomédecine. Des exemples comprennent des phénotypes métaboliques des cellules co-cultivées telles que les cellules souches - cultures de couche nourricière, des modèles neurones, astrocytes 4 sous - populations de cellules sanguines 2, ainsi que des populations cellulaires complexes isolés à partir de modèles animaux.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree - MC - VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20 mm x 2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| Myrsyra 99.5% Optima (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
References
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