Introduction
Højere organismer indeholder komplekse samfund af forskellige celletyper, der samarbejder for at skabe mere komplekse funktioner. For eksempel tumorer ikke alene indeholder kræftceller, men også fibroblaster, celler, der udgør blodkar, og ofte immune celleinfiltrater 1; blod indeholder en kompleks blanding af dusinvis af immuncellepopulationer undertyper 2; og selv dyrkede cellelinier kan bestå af flere subpopulationer, såsom den luminale og basal undertyper af brystcancerceller 3. Desuden distinkte celletyper, der eksisterer side om side, kan udvise metaboliske "samarbejde". For eksempel i hjernen, er astrocytter menes at omdanne glucose til lactat, som derefter "fodret" til neuroner, der oxiderer dette substrat 4; T-lymfocytter er i nogle sammenhænge er afhængige af tilstødende dendritiske celler som en kilde til cystein 5; og kræftceller kan samarbejde med assoknyttede fibroblaster i tumorer 6. For at forstå den metaboliske adfærd af sådanne systemer, er det vigtigt at adskille og måle de metaboliske aktiviteter af de forskellige celletyper stede.
Langt den mest anvendte metode til adskillelse celletyper er fluorescensaktiveret cellesortering. Denne metode er bredt anvendelig, forudsat at celletypen eller tilstand af interesse kan "mærket" under anvendelse af fluorescerende antistoffer, ekspression af konstruerede fluorescerende proteiner eller andre farvestoffer. En mulighed er at begynde med separate celler typer gennem en celle sorteringsanlæg, re-kultur de enkelte celletyper opnået, og derefter udføre metabolisme studier af disse kulturer 7. Men dette er kun muligt, hvis celletypen eller fænotype er stabil i dyrkningsbetingelser, og kan ikke fange forbigående adfærd såsom cellecyklus stater, eller den metaboliske samarbejde i co-kulturer. For sådanne tilfælde skal stofskiftet måles direkte på sårted celler. Dette er en udfordring, da cellesortering procedure udsætter cellerne for belastninger, der kan fordreje deres stofskifte 8, og vi er opmærksomme på kun få undersøgelser, der tager denne tilgang 9, 10. Især har vi fundet, at primære metabolitter, såsom aminosyrer kan lække fra cellerne holdes i cellesortering puffer, således at målinger af absolutte metabolit overflod ikke længere er pålidelige 11 (selv om relativ sammenligning mellem sorterede fraktioner stadig kan være værdifuld).
For at omgå disse problemer, vi mærker celler med stabile isotoper før sortering, og fokusere på de MIDs i cellulære metabolitter, snarere end metabolit forekomster. Da MIDs dannes over længere tidsskalaer, bør de mindre påvirket af kortvarig udsættelse for sorteringsbetingelserne. Vi kvantificere MIDs vha full-scan høj opløsning massespektrometri, som er følsom nok til at tilvejebringe data på hundredvis af metabolitter startende fra omkring 500.000 sorteret celler, der kræver omkring 30-60 min celle sortering tid. En sammenligning mellem en "mock sorteret" kontrol (celler passerede gennem cellesorteringsapparat instrumentet uden gating nogen specifik population) og metabolit ekstraktion direkte fra dyrkningsskålen foretages for at sikre, at de observerede MIDs er repræsentative for de i den oprindelige kultur. Afhængigt af valget af stabile isotop sporstoffer kan forskellige metaboliske veje undersøges med denne metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Metabolit Extraction
- Udsugning fra fad
- Dyrke celler i en 6-brønds plade in triplo i stabile isotopmærkede dyrkningsmedier + dialyserede kosttilskud (serum eller andre væksttilskud) indtil cellerne bliver 75% sammenflydende.
BEMÆRK: Her kultur HeLa-celler i 48 timer i RPMI indeholdende 40% U 13 C-glucose og 70% U 13 C, 15 N2-Glutamin og 5% dialyseret FBS (kalvefosterserum). Dialyseret FBS bruges til at slippe af med lille molekylvægt metabolitter, som kan forurene den mærkede medier. Det anbefales at dyrke celler i dialyseret supplement, før den virkelige eksperiment for at sikre cellerne vokser normalt i mediet. Kosttilskud dialyseres i 0,15 M NaCl-opløsning natten over under anvendelse slangeskind dialyserør. - På dagen for udvinding udsmid dyrkningsmedier, skylles brønde to gange med 500 uL kold HBSS og derefter kassere det.
BEMÆRK: Her bruger HBSS indeholdende 40% U-13C-glucose da det også er i dyrkningsmedierne. - Tilføj 600 pi 100% methanol forafkølet på tøris.
- Overfør skålen til tøris og fjerne cellemateriale med en celleskraber.
- omhyggelig pipettering celleekstrakterne til et mikrocentrifugerør og opbevares ved -80 ° C indtil massespektrometrianalyse.
- Dyrke celler i en 6-brønds plade in triplo i stabile isotopmærkede dyrkningsmedier + dialyserede kosttilskud (serum eller andre væksttilskud) indtil cellerne bliver 75% sammenflydende.
- Ekstraktion af mock sorterede celler
- Kultur celler i en 100 mm skål i tre eksemplarer i stabile isotoper mærket kultur medier + dialyserede kosttilskud.
BEMÆRK: Her kultur HeLa-celler i 48 timer i 100 mm skål, fordi et stort antal celler (~ 4 x 10 6) er nødvendige for at opnå 500.000 sorterede celler. Dette antal HeLa celler ekstrakt var påkrævet for at opnå god måling af metabolitter. Dyrkningsmedierne anvendte RPMI indeholdende 40% U- 13 C-Glucose og 70% U- 13 C, 15 N2-glutamin og 5% dialyseret FBS. - På dagen for udvinding, discard dyrkningsmedier, skylles brønde wed 1,5 ml varm HBSS og derefter kassere det.
- Frigør celler ved at tilsætte 1,5 ml trypsin / EDTA i 4 minutter ved 37 ° C. Udfør følgende trin i 4 ° C eller i is.
- Deaktivere trypsin ved tilsætning af 3 ml iskold HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) + dialyseret supplement.
- Indsamle celler i et 15 ml rør og centrifugeres ved 750 xg i 3 min.
- Pellet resuspenderes i HBSS + dialyseret supplement + 1 mM EDTA ved en koncentration 1-2 x 10 6 celler / ml, passere gennem 40 um celle sier at opnå enkelte celler, og overføres til en 5 ml rør.
- Sorter celler gennem celle sorteringsanlæg gating kun for slåbrokker og centrifuge sorteres celler ved 750 xg i 3 minutter ved 4 ° C.
BEMÆRK: her Sortér HeLa-celler med en hastighed 1.000 begivenheder / s, med instrument pres 27 psi, og ved hjælp af en 100 um dyse. HeLa-celler er store, så de skal sorteres ved en langsom begivenhed sats og stor dyse at få så intakt pellet som muligt. Opbevar cellerne i kolde blokke throughout sortering til nedsætte metaboliseringen. En grundig beskrivelse af sortering procedure er beskrevet tidligere 12. - Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 50 pi iskold dH2O at opnå en homogen pellet før tilsætning af methanol. Tilsætning af kold methanol direkte til pellet danner en fast pellet som er svært at resuspendere.
- Uddrag metabolitter ved at tilsætte 540 pi methanol holdes i tøris og holde ekstrakter ved -80 ° C indtil væskekromatografi - højopløsningsmassespektrometri (LC-HRMS) analyse.
- Kultur celler i en 100 mm skål i tre eksemplarer i stabile isotoper mærket kultur medier + dialyserede kosttilskud.
- Ekstraktion af cellecyklus sorteres cellerne
- Kultur celler i en 100 mm skål i tre eksemplarer på dyrkningsmedier + dialyserede kosttilskud.
BEMÆRK: Her kultur HeLa celler, der indeholder Geminin Fucci Green (mAG1-hGem) sonde 13, som giver mulighed for sortering af G1 (negativ) og SG2M (positive) celler. Celler kan dyrkes i stabile isotop sporing medier til ens længe påkrævet. Her har vi dyrket dem i 46 timer i umærket medier, så har vi skiftet til RPMI indeholdende 40% U 13 C-Glucose og 70% U- 13 C, 15 N2-glutamin 2 timer før start sortering. Dette blev gjort for at kunne studere cellecyklusfaser som kræver en kort impuls mærkning. - På dagen for udvinding, discard dyrkningsmedier, skylles brønde med 1,5 ml varm HBSS og derefter kassere det.
- Frigør celler ved at tilsætte 1,5 ml trypsin / EDTA i 4 minutter ved 37 ° C. Udfør følgende trin i 4 ° C eller i is.
- Deaktiver trypsin ved at tilsætte 3 ml iskold HBSS + dialyseret supplement.
- Indsamle celler i et 15 ml rør og centrifugeres ved 750 xg i 3 min.
- Pellet resuspenderes i HBSS + dialyseret supplement + 1 mM EDTA ved en koncentration 1-2 x 10 6 celler / ml, passere gennem 40 um celle sier at opnå enkelte celler, og overføres til en 5 ml rør.
- Sorter celler gennem celle sorteringsanlæg gating ud debris og dubletter, derefter gating for cellen markør af interesse, og centrifuger sorteret celler ved 750 xg i 3 minutter ved 4 ° C.
BEMÆRK: her Sortér HeLa-celler med en hastighed 1.000 begivenheder / s, med instrument pres 27 psi, og ved hjælp af en 100 um dyse. Holde cellerne i koldt blokke hele sortering at sænke stofskiftet sats. - Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 50 pi iskold dH2O at opnå en homogen pellet før tilsætning af methanol. Tilsætning af kold methanol direkte til pellet danner en fast pellet som er svært at resuspendere.
- Uddrag metabolitter ved at tilsætte 540 pi methanol holdes i tøris og holde ekstrakter ved -80 ° C indtil LC-HRMS analyse.
- Kultur celler i en 100 mm skål i tre eksemplarer på dyrkningsmedier + dialyserede kosttilskud.
2. massespektrometri Analyse
Bemærk: Her beskriver vi protokol for analyse celleekstrakter på en LC-HRMS system. kan bruges Eventuelle metabolomik metoder til analyse af celleekstrakter. Fuld scanninganalyse kan være nyttigt til påvisning af en lang række metabolitter.
- Kalibrer instrumentet ved hjælp af en massespektrometri henvisning kalibrering mix.
- Tø celleekstrakter på is i 30 minutter og vortex i 15 s.
- Overfør 100 pi af cellen ekstrakt til et spin-filter og centrifugeres i 10 minutter ved 13.000 xg ved 4 ° C.
- Injicer 12.5 pi af filtratet på LC-HRMS system.
- Separate metabolitter ved anvendelse af en zwitterionisk Hydrofil Interaction Liquid Chromatography (ZIC-HILIC) søjle (150 mm x 4,6 mm, 5 um partikelstørrelse) forsynet med en ZIC-HILIC guard søjle (20 mm x 2,1 mm) under anvendelse af en gradienteluering med 0,1% myresyre syre i vand (opløsningsmiddel A) og acetonitril (opløsningsmiddel B). Start gradienteluering ved 20% opløsningsmiddel A og øges op til 80% i 17 min. Oprethold denne procentdel under 4 min med et flow på 400 pi min -1 og søjletemperatur og prøvebakke ved 23 ° C og 4 ° C.
- Brug en instrument koblet til kromatografisk separation for metabolitter afsløring, en opvarmet elektrospray (H-ESI II) i både positive og negative tilstande som ionisering kilde, og en fuld scanning erhvervelse tilstand ved en masse opløsningsevne på 70.000 Fuld bredde Half Maximum (FWHM) ( m / z 200).
- Brug nitrogen (renhed> 99,995%) for hylsteret gas og hjælpeudstyr gas ved en strømningshastighed på 45 og 10 au (arbitrære enheder) og indstille vaporizer temperatur ved 350 ° C, og elektrospray spænding ved 4 kV i positiv modus og -3.5 kV i negativ modus.
3. Data Analysis
- Vælg en række metabolitter for hvilke standarder der er tilgængelige, og som viser god kvalitet toppe i prøverne. God kvalitet toppe har højt signal-støj-forholdet. Det er vigtigt at kontrollere peak kvalitet og sørg for ikke at medtage falske isotoper. Isotopiske toppe, som er forskellige i form og / eller tilbageholdelse tid sandsynligvis falske.
- For isotopmærkede prøver beregne masse isotopomer (MI) fraktioner ved at dividere toparealet for hver MI med samlede toparealer for alle myokardieinfarkter.
- Beregn de mærkede carbon / nitrogen-fraktioner, berigelse af 13C og 15N, henholdsvis, som
hvor n er det totale antal carbonatomer (eller nitrogenatomer, henholdsvis) i metabolitten, og bland er MI brøkdel af x.
BEMÆRK: kan udføres Alle beregninger ved hjælp programmeringssprog.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som et eksempel her beskriver vi et eksperiment undersøger metabolismen af HeLa-celler sorteret efter cellecyklus fase. At mærke en lang række centrale metabolitter på begge carbonatomer og nitrogenatomer, vi dyrkede celler i 48 timer under anvendelse af U- 13 C-glucose og U- 13 C, 15 N-glutamin som sporstoffer. Til opnåelse rige MIDs for validering eksperiment, vi her valgte en blanding af 40% U- 13 C-Glucose og 70% U- 13 C, 15 N2-glutamin, som mellemliggende niveauer af isotoper tendens til at generere mere varierede MI mønstre 14.
Til validering forsøg udført vi en målrettet analyse af 85 metabolitter. Efter kvalitet styrer skridt til at fjerne dårlige kvalitet LC-MS toppe, var vi i stand til at opdage 69 toppe i de direkte celleekstrakter, hvoraf 66 var til stede i mock sorteres celler (96%). 60 af disse viste sig at være mærket(isotop berigelse over naturlig overflod), og i de fleste tilfælde deres MIDs var ens mellem parabol ekstrakter og mock sorteret celler (Figur 2A). For eksempel MID af glutamat (som omfatter både 13C og 15N MIS) er sammenlignelig mellem skålen og mock sorteret ekstrakter (figur 2B), hvilket indikerer, at glutamat MID er også pålidelig i sorterede cellepopulationer. Men nogle metabolitter klart påvirket af den sortering procedure: f.eks laktat havde mindre 13C 3 i mock sorteret celler, af ukendte årsager. Sådanne metabolitter skal ses med forsigtighed, når analysere data fra faktiske sorteret fraktioner. I mock sorterede celler, 91% af den målte MI andel havde en standardafvigelse på mindre end 1% over biologiske tre eksemplarer, hvilket indikerer, at MIDs var meget reproducerbar i sorterede celler.
Vi analyserede næste HeLa sorteret i enten G0 / G1 eller S / G2 / M cellecyklus slene ved hjælp af Fucci Geminin sonden 12. Fordi disse cellecyklus faser sidste kun ~ 10 h, vi her "puls" mærket kulturer til 2 timer for at opnå forskellige isotop mærkning mellem trin. For eksempel har vi bemærket, at cytidin er mærket i begge populationer, men til en højere berigelse i S / G2 / M fase, konsistent med forøget de novo syntese af nukleotider i S-fasen (figur 3). I dette tilfælde, MID viser det samme mønster i begge fraktioner, hvilket antyder, at samme syntesevej anvendes, men er mere aktive i S / G2 / M fase. Disse data viser, at metaboliske forskelle er let påviselige ved denne fremgangsmåde, selv mellem tæt beslægtede subpopulationer.
Figur 1: Eksperimentel design. Workflow til forberedelse af parabol, mock sorteres og sorteres delpopulation ekstracts. Skål og mock Language ekstrakter anvendes i valideringsforsøget MIDs af skålen og mock Language ekstrakter sammenlignet med test for eventuelle ændringer som følge af sortering. Kompleks population af celler sorteres baseret på markør af celletypen af interesse og derefter ekstraheret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Validering af MIDs mod direkte ekstraktioner. Scatter plots af (A) 13C og 15N berigelse i skålen og mock sorteret prøver. Hver prik repræsenterer en gengivelse. Triplikater er forbundet med linjer. (B) 13 C- 15 N MIDs af glutamat. (C) 13 C MIDs af lactat. De fejl barer er standardafvigelser af tre eksemplarer measuvandskravene. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Metaboliske forskelle mellem cellecyklusfaser i HeLa-celler. Cytidin er mærket forskelligt i G 1 -G 0 og SG 2 -M celler. (A) cytidin 13C berigelse i G 1 -G 0 og SG 2 -M faser af cellecyklussen. Stiplede linie står for carbon berigelse fra naturlige masse isotop. (B) cytidin MIDs vist som array-plots i G 1 -G 0 og SG 2 -M faser. Fejlsøjlerne er standardafvigelser af tredobbelte målinger. Klik her for at view en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores metode er baseret på princippet om, at MIDs i cellulære metabolitter afspejler den "historie" af metaboliske aktiviteter af en celle. Dette gør det muligt at undersøge metaboliske aktiviteter i subpopulation af celler, som de fandt sted i den komplekse samfund af celler, før cellesortering procedure. I modsætning hertil toparealer af metabolitter varierer markant mellem ekstrakter af sorterede celler og direkte udtræk fra kultur fad 11. Til dels skyldes dette, at forskellige kemiske sammensætning ændrer signalet respons i massespektrometri, en såkaldt "matrix effekt", men vi har også vist, at aminosyrer er tabt fra celler under sortering, mens celler holdes i bufferen 11. Dette kan ændre metaboliske tilstand og aktiviteter af celler under sortering, men dette er i sig selv irrelevant for vores metode: forudsat at MIDs er rimeligt tæt på dem, der observeres i direkte udvinding, dataene forbliver en valid måling af den metaboliske tilstand af hver delpopulation i den oprindelige, komplekse kultur.
Vi oprindeligt testet en fremgangsmåde, hvor celler blev sorteret direkte i ekstraktionsmiddel (methanol) til hurtigt slukke metabolisme. Desværre resulterende ekstrakter var vanskelige at analysere, da de indeholdt store mængder af salte og eventuelt andre kontaminanter fra cellen sorteringsanlæg sheathvæske, hvilket resulterer i massiv ion suppression på vores massespektrometri system. Vi har derfor afgjort på protokollen beskrevet her, hvor overskydende væske deponeret af cellen sorteringsanlæg instrument vaskes ud før ekstraktion.
Vores protokol indebærer sortering i HBSS, en fysiologisk saltopløsning suppleret med glucose for at opretholde cellernes levedygtighed. På nogle måder, kan det være foretrukket at sortere celler i selve dyrkningsmediet for at minimere metabolisk stress såsom aminosyre lækage. Det er imidlertid vanskeligt at vaske den lille pellet af sorterede celler, og therefmalm metabolitter til stede i mediet ville forurene de ønskede MIDs af intracellulære metabolitter. Når 13C-mærket glucose anvendes som sporstof bør identisk mærkede glucose anvendes i HBSS opløsning samt.
Som det ses i figur 2, mange, men ikke alle metabolitter, opretholde deres MIDs efter cellesortering procedure. Vi ved ikke, hvorfor visse metabolitter (lactat, for eksempel) er specifikt ændret. Dette resultat understreger, at det er afgørende at kontrollere, at MIDs af interesse er robust over cellen sortering procedure ved mock sortering. Selv om det ikke er muligt direkte at kontrollere MID af en ordnet subpopulation bør MIDs, der er upåvirket af mock sortering (glutamat, for eksempel) være upåvirket af den faktiske sortering så godt, som proceduren er ens, bortset fra valg celle. Denne validering trin skal udføres, når der anvendes en ny celletype eller kultur tilstand. Det er vigtigt at påpege, at our metode er begrænset til metabolitter for hvilke robuste MIDs kan verificeres på denne måde.
Vi forventer, at den her beskrevne fremgangsmåde vil være nyttig i en række anvendelser inden for cellebiologi og biomedicin. Eksempler indbefatter metaboliske fænotyper af co-dyrkede celler, såsom stamceller - fødelag kulturer, neuron-astrocyt modeller 4, subpopulationer af blodceller 2, og også komplekse cellepopulationer isoleret fra dyremodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree - MC - VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20 mm x 2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| Myrsyra 99.5% Optima (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
References
- Gregersen, P. K. Cell type-specific eQTLs in the human immune system. Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).
- Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).
- Prat, A., et al. Characterization of cell lines derived from breast cancers and normal mammary tissues for the study of the intrinsic molecular subtypes. Breast Cancer Res. Treat. 142 (2), 237-255 (2013).
- Magistretti, P. J., Allaman, I. A Cellular Perspective on Brain Energy Metabolism and Functional Imaging. Neuron. 86 (4), 883-901 (2015).
- Angelini, G., et al. Antigen-presenting dendritic cells provide the reducing extracellular microenvironment required for T lymphocyte activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1491-1496 (2002).
- Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Harris, A. L., Sivridis, E. Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: A metabolic survival role for tumor-associated stroma. Cancer Res. 66 (2), 632-637 (2006).
- Hollenbaugh, J. A., Munger, J., Kim, B. Metabolite profiles of human immunodeficiency virus infected CD4+ T cells and macrophages using LC-MS/MS analysis. Virology. 415 (2), 153-159 (2011).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytom. Part A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Moussaieff, A., et al. High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).
- Johnson, C., et al. A metabolic signature of colon cancer initiating cells. Cancer Metab. 2, 32 (2014).
- Roci, I., et al. Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells. Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).
- Shapiro, H. Practical flow cytometry. , Wiley-Liss. New York. (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Noack, S., Wiechert, W. Quantitative metabolomics: A phantom. Trends Biotechnol. 32 (5), 238-244 (2014).
