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Biochemistry

जटिल सेल समुदाय स्थिर आइसोटोप ट्रेसिंग के प्रयोग के आधार पर छाँटे गए उप-जनसंख्या में मापने चयापचय के लिए एक विधि

Published: February 4, 2017 doi: 10.3791/55011
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 4, 3, 1,2
1Department of Medicine, Unit of Computational Medicine, Karolinska Institutet, 2Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 3Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Division of Physiological Chemistry 2, Karolinska Institutet, 4Department of Medicine, University of California San Diego

Introduction

उच्च जीवों अलग प्रकार की कोशिकाओं है कि और अधिक जटिल कार्यों के बारे में लाने के लिए सहयोग करने की जटिल समुदायों होते हैं। उदाहरण के लिए, ट्यूमर न केवल कैंसर कोशिकाओं, लेकिन यह भी fibroblasts, कोशिकाओं है कि रक्त वाहिकाओं का गठन, और अक्सर प्रतिरक्षा सेल पैठ 1 होते हैं; रक्त प्रतिरक्षा सेल उपप्रकार 2 के दर्जनों का एक जटिल मिश्रण होता है; और यहां तक कि सुसंस्कृत सेल लाइनों ऐसे ल्यूमिनल और स्तन कैंसर की कोशिकाओं 3 के बेसल उपप्रकार के रूप में कई उप-जनसंख्या, से मिलकर कर सकते। इसके अलावा, अलग सेल प्रकार है कि एक समय में होना चयापचय "सहयोग" प्रदर्शन कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, मस्तिष्क में, astrocytes लैक्टेट, जो तब न्यूरॉन्स कि इस सब्सट्रेट 4 oxidize के लिए "फेड" है ग्लूकोज में परिवर्तित करने के लिए लगा रहे हैं; टी lymphocytes कुछ संदर्भों सिस्टीन 5 का एक स्रोत के रूप में आसन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं पर निर्भर कर रहे हैं; और कैंसर कोशिकाओं एसोसिएट्स के साथ सहयोग कर सकते हैंट्यूमर 6 में ciated fibroblasts। इस तरह की व्यवस्था की चयापचय व्यवहार को समझने के लिए, यह अलग है और वर्तमान में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के चयापचय गतिविधियों को मापने के लिए आवश्यक है।

अब तक सेल प्रकार को अलग करने के लिए सबसे अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल विधि प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई है। इस विधि प्रदान की है कि सेल प्रकार या ब्याज की राज्य कर सकते हैं फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी, इंजीनियर फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति, या अन्य रंगों का उपयोग "लेबल" हो सकता है, मोटे तौर पर लागू है। एक विकल्प के लिए एक सेल सॉर्टर के माध्यम से शुरू में अलग कोशिकाओं प्रकार, फिर से संस्कृति अलग-अलग प्रकार की कोशिकाओं से प्राप्त करने के लिए है, और फिर इन संस्कृतियों 7 के चयापचय अध्ययन करते हैं। बहरहाल, यह केवल संभव है अगर सेल प्रकार या phenotype संस्कृति की स्थिति में स्थिर है, और इस तरह के सेल चक्र राज्यों, और न ही सह संस्कृतियों में चयापचय सहयोग के रूप में क्षणिक व्यवहार पर कब्जा नहीं कर सकते हैं। इस तरह के मामलों के लिए, चयापचय इतने पर सीधे मापा जाना चाहिएrted कोशिकाओं। इस के बाद से सेल छँटाई प्रक्रिया जोर दिया है कि उनके चयापचय 8 को विकृत कर सकता करने के लिए कोशिकाओं विषयों चुनौती दे रहा है, और हम केवल कुछ इस दृष्टिकोण 9, 10 लेने के अध्ययन के बारे में पता कर रहे हैं। विशेष रूप से, हमने पाया है कि इस तरह के अमीनो एसिड के रूप में प्रमुख चयापचयों सेल छँटाई बफर में रखा कोशिकाओं से रिसाव हो सकता है, ताकि पूर्ण मेटाबोलाइट बहुतायत के माप नहीं रह विश्वसनीय हैं 11 (हालांकि हल अंशों के बीच सापेक्ष तुलना में अभी भी मूल्यवान हो सकता है)।

इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, हम छँटाई करने से पहले स्थिर आइसोटोप के साथ कोशिकाओं लेबल, और सेलुलर चयापचयों, बजाय मेटाबोलाइट प्रचुरता में MIDs पर ध्यान केंद्रित। चूंकि MIDs लंबे समय के तराजू से अधिक का गठन कर रहे हैं, वे कम से छंटाई की स्थिति के लिए लघु अवधि के जोखिम से प्रभावित किया जाना चाहिए। हम पूर्ण स्कैन उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री है, जो काफी संवेदनशील दा प्रदान करने के लिए है का उपयोग कर MIDs योंटा चयापचयों के सैकड़ों चारों ओर 500,000 हल कोशिकाओं से शुरू, सेल छँटाई समय के बारे में 30-60 मिनट की आवश्यकता पर। एक के बीच एक तुलना सीधे "नकली क्रमबद्ध" नियंत्रण (कोशिकाओं किसी भी विशिष्ट आबादी gating बिना सेल सॉर्टर साधन के माध्यम से पारित कर दिया) और मेटाबोलाइट निकासी संस्कृति पकवान से सुनिश्चित करने के लिए कि मनाया MIDs मूल संस्कृति में उन लोगों के प्रतिनिधि हैं बना है। स्थिर आइसोटोप ट्रेसर की पसंद पर निर्भर करता है, विभिन्न चयापचय मार्ग इस विधि के साथ अध्ययन किया जा सकता है।

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Protocol

1. Metabolite निष्कर्षण

  1. पकवान से निकासी
    1. स्थिर आइसोटोप लेबल संस्कृति मीडिया + dialyzed की खुराक (सीरम या अन्य विकास की खुराक) में triplicates में 6 अच्छी तरह से थाली में संस्कृति कोशिकाओं तक कोशिकाओं 75% मिला हुआ हो जाते हैं।
      नोट: RPMI में 48 घंटे में 40% से युक्त यू 13 सी ग्लूकोज और 70% यू 13 सी, 15 एन 2 Glutamine और 5% dialyzed FBS (भ्रूण गोजातीय सीरम) के लिए यहां संस्कृति हेला कोशिकाओं। Dialyzed FBS छोटे आणविक वजन चयापचयों जो लेबल मीडिया को दूषित हो सकता है छुटकारा पाने के लिए प्रयोग किया जाता है। dialyzed पूरक वास्तविक प्रयोग करने से पहले में संवर्धन कोशिकाओं सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं के माध्यम में सामान्य रूप से बढ़ रहे हैं सिफारिश की है। की खुराक 0.15 एम NaCl समाधान में dialyzed रात भर साँप त्वचा डायलिसिस ट्यूबिंग का उपयोग कर रहे हैं।
    2. निकासी त्यागने संस्कृति मीडिया के दिन, 500 μL ठंड HBSS के साथ दो बार कुल्ला कुओं और फिर इसे त्यागने।
      नोट: यहाँ HBSS 40% से युक्त का उपयोग यू13 सी ग्लूकोज के बाद से यह संस्कृति मीडिया में भी है।
    3. जोड़े 600 μL 100% मेथनॉल सूखी बर्फ पर पूर्व ठंडा।
    4. बर्फ सूखी और एक सेल खुरचनी के साथ सेल सामग्री हटाने के लिए पकवान स्थानांतरण।
    5. ध्यान से -80 डिग्री सेल्सियस मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण तक पर एक microcentrifuge ट्यूब और स्टोर करने के लिए सेल के अर्क पिपेट।
  2. नकली हल कोशिकाओं की निकासी
    1. स्थिर आइसोटोप लेबल संस्कृति मीडिया + dialyzed की खुराक में triplicates में एक 100 मिमी डिश में संस्कृति कोशिकाओं।
      नोट: 100 मिमी डिश में 48 घंटे के लिए यहाँ संस्कृति हेला कोशिकाओं क्योंकि कोशिकाओं के एक उच्च संख्या (~ 4 x 10 6) 500,000 हल कोशिकाओं प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। हेला कोशिकाओं निकालने की यह संख्या चयापचयों का अच्छा माप प्राप्त करने के लिए आवश्यक था। संस्कृति इस्तेमाल किया मीडिया RPMI 40% यू 13 सी ग्लूकोज और 70% यू 13 सी, 15 एन 2 Glutamine और 5% dialyzed FBS युक्त था।
    2. निकासी, त्यागने संस्कृति मीडिया के दिन पर, कुओं डब्ल्यू कुल्लाith 1.5 एमएल गर्म HBSS और फिर इसे त्यागने।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 1.5 एमएल / trypsin EDTA जोड़कर कोशिकाओं को अलग करें। 4 डिग्री सेल्सियस में या बर्फ में निम्न चरणों का प्रदर्शन।
    4. 3 एमएल बर्फ ठंड HBSS (हांक बैलेंस्ड नमक समाधान) + dialyzed पूरक जोड़कर trypsin निष्क्रिय करें।
    5. 3 मिनट के लिए 750 XG पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं को ले लीजिए।
    6. एक एकाग्रता में HBSS + dialyzed पूरक + 1 मिमी EDTA में गोली Resuspend 1-2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल, एकल कक्षों प्राप्त करने के लिए 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से गुजरती हैं, और एक 5 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण।
    7. केवल singlets के लिए सेल सॉर्टर gating के माध्यम से क्रमबद्ध कोशिकाओं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 750 XG पर अपकेंद्रित्र हल कोशिकाओं।
      नोट: एक दर 1,000 घटनाओं / s पर यहां क्रमबद्ध हेला कोशिकाओं, साधन दबाव 27 साई के साथ, और एक 100 माइक्रोन नोक का उपयोग कर। हेला कोशिकाओं बड़े हैं तो वे संभव के रूप में के रूप में बरकरार गोली पाने के लिए एक धीमी गति से घटना की दर और बड़े नोक पर हल किया जाना चाहिए। throughou ठंड ब्लॉक में कोशिकाओं रखेंटी चयापचय को कम करने के छँटाई। छँटाई प्रक्रिया का एक विस्तृत वर्णन पहले 12 में वर्णित है।
    8. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और मेथनॉल जोड़ने से पहले एक समरूप गोली प्राप्त करने के लिए 50 μL बर्फ के ठंडे DH 2 हे में गोली resuspend। सीधे गोली ठंड मेथनॉल के अलावा एक ठोस गोली जो resuspend करने के लिए कठिन है रूपों।
    9. 540 μL मेथनॉल सूखी बर्फ में रखा जोड़कर चयापचयों निकालें और तरल क्रोमैटोग्राफी तक डिग्री सेल्सियस -80 में अर्क रख - उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा-HRMS) विश्लेषण।
  3. सेल चक्र की निकासी कोशिकाओं को हल
    1. संस्कृति मीडिया + dialyzed की खुराक में triplicates में एक 100 मिमी डिश में संस्कृति कोशिकाओं।
      नोट: Geminin Fucci ग्रीन (mAG1-hGem) जांच 13 जो G1 (नकारात्मक) और SG2M (सकारात्मक) कोशिकाओं की छंटाई के लिए अनुमति देता युक्त यहाँ संस्कृति हेला कोशिकाओं। प्रकोष्ठों एक के लिए स्थिर आइसोटोप अनुरेखण मीडिया में संवर्धित किया जा सकतालंबा के रूप में की आवश्यकता है। यहाँ हम उन्हें लेबल हटाया गया मीडिया में 46 घंटे के लिए सुसंस्कृत है, तो हम RPMI 40% यू 13 सी ग्लूकोज और 70% यू 13 सी से युक्त करने के लिए बंद कर दिया है, 15 एन 2-Glutamine 2 घंटे पहले छंटाई शुरू। इस क्रम में सेल चक्र के चरणों जो एक छोटी नाड़ी लेबलिंग की आवश्यकता का अध्ययन करने के लिए सक्षम होने के लिए किया गया था।
    2. निकासी, त्यागने संस्कृति मीडिया के दिन में 1.5 मिलीलीटर गर्म HBSS के साथ कुओं कुल्ला और फिर इसे त्यागने।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 1.5 एमएल / trypsin EDTA जोड़कर कोशिकाओं को अलग करें। 4 डिग्री सेल्सियस में या बर्फ में निम्न चरणों का प्रदर्शन।
    4. 3 एमएल बर्फ ठंड HBSS + dialyzed पूरक जोड़कर trypsin निष्क्रिय करें।
    5. 3 मिनट के लिए 750 XG पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं को ले लीजिए।
    6. एक एकाग्रता में HBSS + dialyzed पूरक + 1 मिमी EDTA में गोली Resuspend 1-2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल, एकल कक्षों प्राप्त करने के लिए 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से गुजरती हैं, और एक 5 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण।
    7. सेल सॉर्टर जी के माध्यम से क्रमबद्ध कोशिकाओंमलबे और दोहरी बाहर ating, तो ब्याज की सेल मार्कर के लिए gating, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 750 XG पर अपकेंद्रित्र हल कोशिकाओं।
      नोट: एक दर 1,000 घटनाओं / s पर यहां क्रमबद्ध हेला कोशिकाओं, साधन दबाव 27 साई के साथ, और एक 100 माइक्रोन नोक का उपयोग कर। चयापचय दर में कमी करने के लिए छंटाई के दौरान ठंड ब्लॉक में कोशिकाओं रखें।
    8. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और मेथनॉल जोड़ने से पहले एक समरूप गोली प्राप्त करने के लिए 50 μL बर्फ के ठंडे DH 2 हे में गोली resuspend। सीधे गोली ठंड मेथनॉल के अलावा एक ठोस गोली जो resuspend करने के लिए कठिन है रूपों।
    9. 540 μL मेथनॉल सूखी बर्फ में रखा जोड़कर चयापचयों निकालें और नियंत्रण रेखा HRMS विश्लेषण जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर अर्क रहते हैं।

2. मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण

नोट: यहाँ हम एक नियंत्रण रेखा HRMS सिस्टम पर सेल के अर्क का विश्लेषण करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है। सेल के अर्क के विश्लेषण के लिए किसी भी metabolomics तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है। पूर्ण स्कैनविश्लेषण चयापचयों की एक विस्तृत श्रृंखला का पता लगाने के लिए उपयोगी हो सकता है।

  1. एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री संदर्भ अंशांकन मिश्रण का उपयोग साधन जांचना।
  2. 30 मिनट और 15 एस के लिए भंवर के लिए बर्फ पर पिघलना सेल के अर्क।
  3. 100 μL सेल निकालने के 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,000 XG पर 10 मिनट के लिए एक स्पिन फिल्टर और सेंट्रीफ्यूज के लिए स्थानांतरण।
  4. नियंत्रण रेखा HRMS सिस्टम पर छानना की 12.5 μL इंजेक्षन।
  5. एक zwitterionic हाइड्रोफिलिक इंटरेक्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (ZIC-HILIC) स्तंभ (150 मिमी x 4.6 मिमी, 5 माइक्रोन कण आकार) का उपयोग कर अलग चयापचयों एक ZIC-HILIC गार्ड स्तंभ (20 मिमी × 2.1 मिमी) 0.1% चींटी की एक ढाल क्षालन का उपयोग कर के साथ फिट पानी में एसिड (विलायक ए) और acetonitrile (विलायक बी)। विलायक ए के 20% पर ढाल क्षालन शुरू करें और 17 मिनट में 80% तक वृद्धि हुई है। क्रमश: 23 डिग्री सेल्सियस पर न्यूनतम 400 μL का प्रवाह -1 और स्तंभ तापमान और नमूना ट्रे और 4 डिग्री सेल्सियस के साथ 4 मिनट के दौरान यह प्रतिशत बनाए रखें।
  6. एक मैं का उपयोगnstrument चयापचयों का पता लगाने, आयनीकरण स्रोत के रूप में सकारात्मक और नकारात्मक दोनों मोड में एक गर्म electrospray (एच ईएसआई द्वितीय), और 70,000 पूर्ण चौड़ाई आधा अधिकतम (FWHM) के एक जन शक्ति को हल पर एक पूर्ण स्कैन अधिग्रहण मोड के लिए chromatographic जुदाई के लिए युग्मित ( मी / z 200)।
  7. 45 के प्रवाह की दर और 350 डिग्री सेल्सियस पर 10 Au (मनमाना इकाइयों) और सेट vaporizer तापमान और सकारात्मक मोड और -3.5 केवी में 4 केवी पर electrospray वोल्टेज पर म्यान गैस और सहायक गैस के लिए नाइट्रोजन (पवित्रता> 99.995%) का प्रयोग करें नकारात्मक मोड में।

3. डेटा विश्लेषण

  1. चयापचयों जिसके लिए मानकों उपलब्ध हैं और जो नमूने में अच्छी गुणवत्ता चोटियों को दिखाने के एक नंबर का चयन करें। अच्छी गुणवत्ता चोटियों शोर अनुपात करने के लिए उच्च संकेत है। यह शिखर गुणवत्ता को सत्यापित करने और सुनिश्चित करें कि झूठी आइसोटोप शामिल करने के लिए नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है। समस्थानिक चोटियों जो आकार और / या प्रतिधारण समय में मतभेद होने की संभावना झूठे हैं।
  2. आइसोटोप लेबल नमूने बड़े पैमाने पर isotopomer की गणना के लिए (एमआई) सभी एमआईएस की कुल शिखर क्षेत्रों के साथ प्रत्येक एमआई के शिखर क्षेत्र को विभाजित करके अंशों।
  3. क्रमशः लेबल कार्बन / नाइट्रोजन अंशों 13 सी और 15 एन, के संवर्धन की गणना, के रूप में,
    1 समीकरण
    जहाँ n मेटाबोलाइट में कार्बन की कुल संख्या (या nitrogens, क्रमशः) है, और मिश्रण एक्स के एमआई अंश है।
    नोट: सभी गणना प्रोग्रामिंग भाषाओं का उपयोग किया जा सकता है।

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Representative Results

एक उदाहरण के रूप में, यहाँ हम एक प्रयोग सेल चक्र चरण के अनुसार हल हेला कोशिकाओं के चयापचय की जांच का वर्णन है। दोनों कार्बन और nitrogens पर केंद्रीय चयापचयों की एक विस्तृत श्रृंखला के लेबल के लिए, हम यू 13 सी ग्लूकोज और यू 13 सी, 15 ट्रेसर के रूप में एन glutamine का उपयोग कर 48 घंटे के लिए कोशिकाओं सुसंस्कृत। सत्यापन के प्रयोग के लिए अमीर MIDs प्राप्त करने के लिए, हम यहाँ, 40% यू 13 सी ग्लूकोज और 70% यू 13 सी, 15-एन 2 Glutamine का एक मिश्रण चुना आइसोटोप के मध्यवर्ती स्तर और अधिक विविध एमआई पैटर्न 14 उत्पन्न करने के लिए जाते हैं।

सत्यापन के प्रयोग के लिए हम 85 चयापचयों का एक लक्षित विश्लेषण किया। गुणवत्ता को नियंत्रित करता कदम गरीब गुणवत्ता नियंत्रण रेखा एमएस चोटियों को दूर करने के बाद, हम प्रत्यक्ष सेल के अर्क, जिनमें से 66 नकली हल कोशिकाओं (96%) में उपस्थित थे में 69 चोटियों का पता लगाने में सक्षम थे। इनमें से 60 लेबल किया जा दिखाई दिया(आइसोटोप प्राकृतिक बहुतायत ऊपर संवर्धन), और ज्यादातर मामलों में उनकी MIDs पकवान अर्क और नकली हल कोशिकाओं (2A चित्रा) के बीच समान थे। उदाहरण के लिए, ग्लूटामेट के मध्य (जो दोनों 13 सी और 15 एन एमआईएस भी शामिल है) का संकेत है कि ग्लूटामेट मध्याह्न हल सेल आबादी में भी विश्वसनीय है, पकवान और नकली हल किया अर्क (चित्रा 2 बी) के बीच समान है। हालांकि, कुछ चयापचयों स्पष्ट रूप से छँटाई प्रक्रिया से प्रभावित हैं: उदाहरण के लिए, लैक्टेट, नकली हल कोशिकाओं में कम 13 सी 3 था अज्ञात कारणों के लिए। इस तरह के चयापचयों जब वास्तविक हल किया अंशों से डेटा का विश्लेषण सावधानी के साथ देखा जाना चाहिए। नकली हल कोशिकाओं में मापा एमआई अंश के 91% जैविक triplicates भर में 1% की तुलना में एक मानक विचलन कम था, यह दर्शाता है कि MIDs हल कोशिकाओं में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य थे।

हम अगले विश्लेषण किया हेला या तो G0 / G1 या एस / G2 में हल / एम सेल चक्र रोंFUCCI Geminin जांच 12 का उपयोग कर tages। क्योंकि इन कोशिका चक्र के चरणों पिछले केवल ~ 10 h, हम यहाँ "पल्स" लेबल 2 घंटे के लिए संस्कृतियों चरणों के बीच विभिन्न आइसोटोप लेबलिंग प्राप्त करने के लिए। उदाहरण के लिए, हम ने कहा कि cytidine दोनों आबादी में लेबल है, लेकिन एस चरण के दौरान एस / G2 / एम चरण में एक उच्च संवर्धन, न्यूक्लियोटाइड की वृद्धि की नए सिरे से संश्लेषण के अनुरूप (चित्रा 3)। इस मामले में, मध्य, दोनों भागों में एक ही पैटर्न से पता चलता है कि एक ही सुझाव है संश्लेषण मार्ग का इस्तेमाल किया जाता है, लेकिन एस / G2 / एम चरण में अधिक सक्रिय है। इन आंकड़ों से पता चलता है कि चयापचय मतभेद भी बारीकी से संबंधित उप-जनसंख्या के बीच इस विधि द्वारा आसानी से पहचाने जा रहे हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: प्रायोगिक डिजाइन। पकवान की तैयारी के लिए कार्यप्रवाह, नकली हल किया और हल उप-जनसंख्या अतिरिक्तसीटीएस। डिश और नकली हल किया अर्क पकवान और नकली हल किया निष्कर्षों के सत्यापन के प्रयोग MIDs में इस्तेमाल कर रहे हैं छँटाई के कारण संभव परिवर्तनों के लिए परीक्षण करने के लिए तुलना कर रहे हैं। कोशिकाओं के परिसर आबादी ब्याज की सेल प्रकार के मार्कर के आधार पर हल किया जाता है और उसके बाद निकाली गई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: प्रत्यक्ष एक्सट्रेक्शन के खिलाफ MIDs के मान्यकरण। (ए) 13 सी तितर बितर भूखंडों और डिश में 15 एन संवर्धन और नकली हल किया नमूने हैं। प्रत्येक डॉट एक दोहराने का प्रतिनिधित्व करता है। Triplicates लाइनों के साथ शामिल हो गए हैं। (बी) ग्लूटामेट की 13 सी 15 एन MIDs। (सी) 13 सी लैक्टेट का MIDs। त्रुटि सलाखों तीन प्रतियों measu के मानक विचलन कर रहे हैंrements। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: हेला कोशिकाओं में कोशिका चक्र के चरणों के बीच मतभेद मेटाबोलिक। Cytidine जी 1 जी 0 और एसजी 2 एम कोशिकाओं में अलग लेबल है। (ए) जी 1 जी 0 में Cytidine 13 सी संवर्धन और एसजी कोशिका चक्र के 2 एम चरणों। धराशायी लाइन प्राकृतिक बड़े पैमाने पर आइसोटोप से कार्बन संवर्धन के लिए खड़ा है। (बी) Cytidine MIDs जी 1 जी 0 में सरणी भूखंडों और एसजी 2 एम चरणों के रूप में दिखाया गया है। त्रुटि सलाखों तीन प्रतियों माप के मानक विचलन कर रहे हैं। वी के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण iew।

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Discussion

हमारे विधि सिद्धांत है कि सेलुलर चयापचयों में MIDs एक सेल की चयापचय गतिविधियों के "इतिहास" को प्रतिबिंबित पर आधारित है। यह संभव कोशिकाओं के उप-जनसंख्या में चयापचय की गतिविधियों की जांच करने के लिए, के रूप में वे कोशिकाओं के जटिल समुदाय में हुई, पहले सेल छँटाई प्रक्रिया के लिए बनाता है। इसके विपरीत, चयापचयों के शिखर क्षेत्रों हल कोशिकाओं और संस्कृति पकवान 11 से प्रत्यक्ष निकासी के अर्क के बीच स्पष्ट रूप से भिन्न होते हैं। इस भाग में, क्योंकि विभिन्न रासायनिक संरचना मास स्पेक्ट्रोमेट्री, एक तथाकथित "मैट्रिक्स प्रभाव" में बदल संकेत प्रतिक्रिया है, लेकिन हम भी पता चला है कि अमीनो एसिड, छंटाई के दौरान कोशिकाओं से खो रहे हैं जबकि कोशिकाओं बफर 11 में रखा जाता है। इस दौरान छँटाई चयापचय राज्य और कोशिकाओं की गतिविधियों को बदल सकता है, लेकिन यह अपने आप में हमारे विधि के लिए अप्रासंगिक है: बशर्ते कि MIDs यथोचित प्रत्यक्ष निकासी में मनाया उन लोगों के लिए बंद कर रहे हैं, डेटा एक vali रहता हैमूल, जटिल संस्कृति में प्रत्येक उप-जनसंख्या की चयापचय राज्य के डी माप।

हम शुरू में एक विधि जहां कोशिकाओं को सीधे निकासी समाधान (मेथनॉल) में हल किया गया तेजी से चयापचय बुझाने के लिए परीक्षण किया। दुर्भाग्य से, जिसके परिणामस्वरूप अर्क, विश्लेषण करने के लिए मुश्किल थे के रूप में वे सेल सॉर्टर म्यान तरल पदार्थ से लवण और संभवतः अन्य प्रदूषणों से अधिक मात्रा में निहित है, हमारे मास स्पेक्ट्रोमेट्री सिस्टम पर भारी आयन दमन में जिसके परिणामस्वरूप। इसलिए हम प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित है, जहां अतिरिक्त तरल पदार्थ सेल सॉर्टर साधन द्वारा जमा की निकासी के लिए पहले से धोया जाता है पर बसे।

हमारी प्रोटोकॉल HBSS, एक शारीरिक नमक समाधान सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए ग्लूकोज के साथ पूरक में छँटाई पर जोर देता। कुछ मायनों में, यह वास्तविक मध्यम संस्कृति में कोशिकाओं ऐसे एमिनो एसिड रिसाव के रूप में चयापचय तनाव को कम करने के लिए सुलझाने के लिए बेहतर हो सकता है। हालांकि, यह हल कोशिकाओं के छोटे गोली धोने के लिए मुश्किल है, और Therefमध्यम में मौजूद अयस्क चयापचयों intracellular चयापचयों की मांग की MIDs दूषित होता है। जब भी 13 सी लेबल ग्लूकोज एक अनुरेखक के रूप में प्रयोग किया जाता है, समान लेबल ग्लूकोज के रूप में अच्छी तरह से HBSS समाधान में इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

चित्रा 2 में देखा है, कई हैं, लेकिन सभी चयापचयों, सेल छँटाई प्रक्रिया के बाद उनकी MIDs बनाए रखें। हम क्यों कुछ चयापचयों (लैक्टेट, उदाहरण के लिए) विशेष रूप से बदल रहे हैं पता नहीं है। इस परिणाम पर जोर देती है कि यह सत्यापित करने के लिए है कि ब्याज की MIDs सेल नकली छँटाई द्वारा छँटाई प्रक्रिया की दिशा में मजबूत कर रहे हैं महत्वपूर्ण है। हालांकि यह संभव सीधे एक क्रमबद्ध उप-जनसंख्या के मध्य सत्यापित करने के लिए नहीं है, MIDs कि नकली छँटाई (ग्लूटामेट, उदाहरण के लिए) से अप्रभावित रहे हैं वास्तविक रूप में अच्छी तरह से छंटाई, के रूप में प्रक्रिया सेल के चयन के अलावा समान है से अप्रभावित होना चाहिए। यह मान्यता कदम बाहर किया जाना चाहिए, जब भी एक नया सेल प्रकार या संस्कृति हालत प्रयोग किया जाता है। ऐसा नहीं है कि बाहर बात करने के लिए महत्वपूर्ण है ओउर विधि चयापचयों जिसके लिए मजबूत MIDs इस तरीके से सत्यापित किया जा सकता तक सीमित है।

हम आशा करते हैं कि विधि यहाँ वर्णित कोशिका जीव विज्ञान और बायोमेडिसिन भीतर आवेदनों की संख्या में उपयोगी हो जाएगा। फीडर परत संस्कृतियों, न्यूरॉन astrocyte मॉडल 4, रक्त कोशिकाओं 2 की उप-जनसंख्या, और भी जटिल सेल पशु मॉडल से पृथक आबादी - उदाहरण ऐसे स्टेम सेल के रूप में सह-संवर्धित कोशिकाओं के चयापचय phenotypes शामिल हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS Sigma H6648
INFLUX (inFlux v7 Sorter) BD Biosciences
U-13C-Glucose Cambridge isotopes 40762-22-9 / GLC-018
U-13C,15N2-Glutamine Cambridge isotopes CNLM-1275-H-0.1
Methanol (JT Baker), HPLC grade VWR BAKR8402.2500
Ultrafree - MC - VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm Millipore UFC30VV00
Ultimate 3,000 UHPLC Thermo Fisher scientific
Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer Thermo Fisher scientific
Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) Merck KGaA 1.50444.0001
Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20 mm x 2.1 mm) Merck KGaA
Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass Fisher Scientific A955-212
Milli-Q water Millipore Produced with a Milli-Q Gradient system
Myrsyra 99.5% Optima (Formic acid) Fisher Scientific 11423423
X100 Screw Vial 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, amber, 100 units Thermo Fisher scientific 10560053
X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Screw caps) Thermo Fisher scientific 12458636
ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix Sigma-Aldrich MSCAL5 Calibration kit
SNAKESKIN 10K MWCO  Thermo Fisher scientific 88245
Mathematica v.10  Wolfram Research

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Roci, I., Gallart-Ayala, H.,… More

Roci, I., Gallart-Ayala, H., Watrous, J., Jain, M., Wheelock, C. E., Nilsson, R. A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing. J. Vis. Exp. (120), e55011, doi:10.3791/55011 (2017).

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