Introduction
高等生物は、より複雑な機能をもたらすために協力異なる細胞型の複雑なコミュニティを含みます。例えば、腫瘍は、癌細胞だけでなく、線維芽細胞、血管を構成する細胞だけでなく、を含み、多くの場合、免疫細胞は、1浸潤します;血液は、免疫細胞サブタイプ2の数十の複雑な混合物が含まれています。さらには培養細胞株は、乳癌細胞3の管腔および基底サブタイプなどの複数の亜集団、から構成されてもよいです。また、共存する異なる細胞型は、代謝、「コラボレーション」を示すことができます。例えば、脳内で、アストロサイトは、この基板4を酸化ニューロンへのその後「摂食」である乳酸にグルコースを変換するために考えられています。 Tリンパ球は、システイン5の供給源として、隣接する樹状細胞に依存して、いくつかの状況です。そして癌細胞はASSOと協力することができます腫瘍6でciated線維芽細胞。このようなシステムの代謝挙動を理解するために、存在する種々の細胞型の代謝活動を分離して測定することが不可欠です。
はるか細胞型を分離するために最も広く使用される方法は、蛍光活性化細胞選別です。この方法は広く適用可能であり、目的の細胞型または状態は、蛍光抗体、操作された蛍光タンパク質の発現、又は他の染料を使用して、「標識された」ことができることを条件とします。 1つのオプションは、次にセルソーター、得られた再培養個々の細胞型、及び貫通最初は別個の細胞タイプは、これらの培養物7の代謝試験を行うことです。細胞型または表現型は、培養条件で安定であり、そのような細胞周期状態を、また、共培養における代謝協力として過渡的な挙動を捕捉することができない場合は、これは実現可能です。このような場合のために、代謝がそうで直接測定されなければなりませんRTED細胞。セルは手順をソートするので、これは困難である彼らの新陳代謝8を歪めることがストレスに細胞を施し、そして我々はこのアプローチ9、10を取るだけ少数の研究を認識しています。特に、我々は絶対的な代謝産物の存在量の測定は、もはや信頼性があるように、アミノ酸等の主要な代謝産物は、細胞ソーティングバッファに保持した細胞から漏れないことを見出した11（ソートされた画分の間の相対的な比較は依然として価値があるかもしれません）。
これらの問題を回避するために、我々は、ソートする前に、安定同位体で細胞を標識し、細胞代謝産物ではなく、代謝物の存在量でのMIDに焦点を当てます。 MIDは長い時間スケール上に形成されているので、それらは以下のソート条件に短期暴露の影響を受けなければなりません。我々は、DAを提供するのに十分な感度でフルスキャンの高分解能質量分析を使用してのMIDを定量化セルソーティング時間の約30〜60分を必要とする50万選別した細胞から始まる代謝物の何百も、上のta。培養皿から直接制御（細胞は、任意の特定の集団をゲーティングすることなく、セルソーター器を通過した）および代謝物の抽出を「モックがソート」との比較は観察のMIDは、元の培養中のものの代表であることを保証するために行われます。安定同位体トレーサーの選択に応じて、様々な代謝経路は、この方法で研究することができます。
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Protocol
1.代謝物の抽出
- 皿からの抽出
- 安定同位体標識された培養培地+透析サプリメント（血清または他の成長サプリメント）で三連で6ウェルプレートで培養細胞は、細胞が75％コンフルエントになるまで。
注：U- 13 C-グルコース40％を含むRPMI中で48時間と70％U- 13 C、15 N2-グルタミンおよび5％透析FBS（ウシ胎児血清）のためにここでは、培養HeLa細胞。透析FBSは、標識されたメディアを汚染する可能性がある低分子量代謝物を取り除くために使用されます。実際の実験の前に透析したサプリメントで細胞を培養する培地で細胞を正常に増殖していることを確認することをお勧めします。サプリメントは、ヘビ肌透析チューブを用いて、0.15 M NaCl溶液で一晩透析します。 - 抽出廃棄培地の日に、500μLの冷HBSSで二回、ウェルを洗浄し、それを捨てます。
注：ここでは40％を含むHBSSを使用U-13 C-グルコースは培地もあるからです。 - 追加600μLの100％メタノールをドライアイス上で予備冷却しました。
- ドライアイスに皿を転送し、セルスクレーパーで細胞材料を除去します。
- 注意深く質量分析まで-80℃でマイクロ遠心チューブとストアに細胞抽出物をピペット。
- 安定同位体標識された培養培地+透析サプリメント（血清または他の成長サプリメント）で三連で6ウェルプレートで培養細胞は、細胞が75％コンフルエントになるまで。
- モック選別細胞の抽出
- 安定同位体標識された培養培地+透析サプリメントで三重100 mmディッシュで培養細胞。
注：100ミリメートル皿で48時間ここで、培養HeLa細胞の細胞の数が多い（〜4×10 6）を 50万選別された細胞を得るために必要とされるからです。 HeLa細胞抽出物のこの数は、代謝物の良好な測定を得るために必要でした。培地は、40％U- 13 Cグルコース、70％U- 13 C、15 N 2グルタミン及び5％透析FBSを含むRPMIを用いました。 - 抽出、廃棄培地の日に、Wウェルをすすぎますi番目の1.5mLの温かいHBSSし、それを捨てます。
- 37℃で4分間、1.5 mLのトリプシン/ EDTAを加えることによって、細胞を切り離します。 4°Cまたは氷で次の手順を実行します。
- 3 mLの氷冷HBSS（ハンクス液）+透析サプリメントを追加することにより、トリプシンを無効にします。
- 3分間750×gで15 mLチューブと遠心分離機で細胞を収集します。
- 濃度1〜2×10 6細胞/ mLのHBSS +透析サプリメント+ 1mMのEDTAでペレットを再懸濁し、単一細胞を得るために40μmのセルストレーナーを通過し、5 mLのチューブに移します。
- ソートのみ一重のためのセルソーター・ゲーティングを介して細胞、および4℃で3分間、750×gで遠心分離選別細胞。
楽器圧力27 psiのと速度千のイベント/秒でここソートHeLa細胞、および100μmのノズルを使用します。注。 HeLa細胞は、それらが可能な限り無傷のペレットを得るために遅い事象率と大ノズルでソートされるべき大です。寒さのブロック内のセルを保つthroughou代謝を減少させるために選別T。手順ソートの完全な説明は、以前12に記載されています。 - 上清を捨て、メタノールを加える前に、均一なペレットを得るために、50μLの氷冷のdH 2 Oにペレットを再懸濁。直接ペレットへの冷メタノールの添加は、再懸濁しにくい固体ペレットを形成しています。
- ドライアイスに保た540μLのメタノールを添加することにより、代謝産物を抽出し、液体クロマトグラフィーするまで-80℃で抽出を維持 - 高分解能質量分析（LC-HRMS）分析。
- 安定同位体標識された培養培地+透析サプリメントで三重100 mmディッシュで培養細胞。
- 細胞周期選別された細胞の抽出
- 培養培地+透析サプリメントで三重100 mmディッシュで培養細胞。
注：GemininのFucciグリーンG1（負）とSG2M（陽性）細胞の選別を可能にします（MAG1-hGem）プローブ13を含む。ここで、培養したHeLa細胞。細胞は用の安定同位体のトレース培地で培養することができます必要に応じて長いですよ。ここでは、我々は40％U- 13 C-グルコースおよび70％U- 13 C、ソート開始する前に、15 N2-グルタミン2時間を含むRPMIに切り替えた、標識されていない培地で46時間のためにそれらを培養しています。これは、短いパルス標識を必要とする細胞周期段階を研究することができるようにするために行きました。 - 抽出、廃棄培地の日に、1.5 mLの温かいHBSSでウェルを洗浄し、それを捨てます。
- 37℃で4分間、1.5 mLのトリプシン/ EDTAを加えることによって、細胞を切り離します。 4°Cまたは氷で次の手順を実行します。
- 3 mLの氷冷HBSS +透析サプリメントを追加することにより、トリプシンを無効にします。
- 3分間750×gで15 mLチューブと遠心分離機で細胞を収集します。
- 濃度1〜2×10 6細胞/ mLのHBSS +透析サプリメント+ 1mMのEDTAでペレットを再懸濁し、単一細胞を得るために40μmのセルストレーナーを通過し、5 mLのチューブに移します。
- セルソーターグラムをソート細胞その後、破片やダブレットをating関心の細胞マーカーのためのゲーティング、および遠心選別細胞を4℃で3分間、750×gで。
楽器圧力27 psiのと速度千のイベント/秒でここソートHeLa細胞、および100μmのノズルを使用します。注。代謝率を減少させるためにソートを通して冷たいブロック内のセルを保管してください。 - 上清を捨て、メタノールを加える前に、均一なペレットを得るために、50μLの氷冷のdH 2 Oにペレットを再懸濁。直接ペレットへの冷メタノールの添加は、再懸濁しにくい固体ペレットを形成しています。
- ドライアイスに保た540μLのメタノールを加えて代謝物を抽出し、LC-HRMS分析まで-80℃で抽出物を保持します。
- 培養培地+透析サプリメントで三重100 mmディッシュで培養細胞。
2.質量分析
注：ここでは、LC-HRMSシステム上の細胞抽出物を分析するためのプロトコルについて説明します。細胞抽出物の分析のための任意のメタボロミクスの方法を用いることができます。フルスキャン分析は、代謝物の広い範囲を検出するのに有用である可能性があります。
- 質量分析基準較正ミックスを使用して、機器のキャリブレーションを行います。
- 15秒間30分間ボルテックス氷上で細胞抽出物を解凍します。
- 4℃で13,000×gで10分間スピンフィルターや遠心分離機に細胞抽出物の100μLを転送します。
- LC-HRMSシステムにろ液の12.5μLを注入します。
- 0.1％のギ酸の勾配溶出を使用して、ZIC-HILICガードカラム（2.1ミリメートル×20ミリメートル）を装着した双性イオン性親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ZIC-HILIC）カラム（150ミリメートル×4.6ミリメートル、5μmの粒子サイズ）を使用して、個別の代謝物水中での酸（溶媒A）およびアセトニトリル（溶媒B）。溶剤Aの20％で勾配溶出を開始し、17分で80％まで増加。それぞれ、4 400μL分の流速で分-1および23℃と4℃のカラム温度とサンプルトレイ中にこの割合を維持します。
- 私を使用してください代謝物の検出、イオン化源として正と負の両方のモードで加熱エレクトロスプレー（H-ESI II）、70,000半値幅（FWHM）の質量分解能でフルスキャン取得モードのためのクロマトグラフィー分離に結合nstrument（ M / Z 200）。
- 45と10のauの流量（任意単位）と設定し、350℃での気化温度とポジティブモードと-3.5 kVの4 kVのでエレクトロスプレー電圧でシースガスおよび補助ガスを窒素（純度> 99.995パーセント）を使用しますネガティブモードインチ
3.データ解析
- 規格が利用可能であり、試料中の良質なピークを示しているために代謝産物の数を選択します。良質のピークは、高い信号対雑音比を有しています。ピークの品質を検証し、偽の同位体を含まないことを確認することが重要です。形状および/または保持時間が異なる同位体ピークはおそらくfalseです。
- 同位体標識されたサンプルについて（質量アイソトポマーを計算MI）すべてのMIの総ピーク面積と各MIのピーク面積を分割することによって画分。
- それぞれ、13 Cおよび15 Nの濃縮をラベルされた炭素/窒素画分を計算します
ここで、nは、代謝物中の炭素の総数（または窒素、それぞれ）は、ミックスは、xのMI分率です。
注：すべての計算は、プログラミング言語を用いて行うことができます。
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Representative Results
一例として、ここでは、細胞周期の段階に応じてソートされたHeLa細胞の代謝を調べる実験を記載します。炭素と窒素の両方に中央代謝物の広い範囲を標識するために、我々はU- 13 C-グルコースおよびトレーサーとしてU- 13 C、15 N-グルタミンを使用して48時間、細胞を培養しました。同位体の中間レベルはより多様MIパターン14を生成する傾向があるとして、検証実験のための豊富なのMIDを得るために、我々はここでは、40％U- 13 C-グルコースおよび70％U- 13 C、15 N2グルタミンの混合物を選びました。
検証実験のために我々は85の代謝産物の標的に分析を行いました。品質が低品質のLC-MSピークを削除する手順を制御した後、我々は66モック選別された細胞（96％）に存在していたそのうちの直接的な細胞抽出物、69のピークを検出することができました。これらの60は、標識されたように見えました（天然存在上記の同位体濃縮）、およびほとんどの場合、彼らのMIDは、皿を抽出し、モックソートされた細胞（ 図2A）との間で同様でした。例えば、（13 Cおよび15 NのMIの両方を含む）グルタミン酸のMIDは、グルタミン酸、MIDは、ソートされた細胞集団でも信頼性があることを示す、皿やモックソート抽出物（ 図2B）との間で同様です。しかし、いくつかの代謝物は、明らかにソート手順によって影響される：例えば、乳酸は、未知の理由のために、モック選別された細胞に少ない13 C 3を持っていました。実際のソートされた画分からのデータを分析するときに、このような代謝産物は、慎重に考えるべきです。モック選別された細胞では、測定されたMI画分の91％は、MIDのは、選別された細胞において高度に再現性があったことを示す、生物学的三重全体の1％よりも標準偏差が少なくありませんでした。
我々は、次のHeLa細胞は、G0 / G1またはS / G2 / M細胞周期のいずれかに分類分析しましたFUCCI Gemininのプローブ12を使用してtages。これらの細胞周期の段階なので2時間の最後にのみ〜10時間、ここで「パルス」と表示された培養物は、ステージ間の異なる同位体標識を達成するために。例えば、我々は、シチジンが両方の集団で標識されているが、ことに留意S相の間のヌクレオチドの増加したデノボ合成と一致してS / G2 / M期においてより高い濃縮度に（ 図3）。この場合、MIDは、同じ合成経路を使用していることを示唆し、両方の画分中の同一のパターンを示しているが、S / G2 / M期においてより活性です。これらのデータは、代謝の差はあっても密接に関連した部分集団の間で、この方法で容易に検出可能であることを示しています。
図1： 実験計画。食器の製造のためのワークフロー、余分なモックソートされ、ソートされた亜集団カラット。料理やモックソート抽出物を仕分けによる変化の可能性のためのテストと比較される料理やモックソート抽出物の検証実験のMIDで使用されています。細胞の複雑な集団は、目的の細胞型のマーカーに基づいてソートし、次に抽出されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：直接抽出に対してのMIDの検証。料理やモックソートされた試料中の（A）13 Cおよび15 N濃縮の散布図。各ドットは複製を表します。トリプリケートの線で接合されています。 （B）グルタミン酸の13 C- 15 NのMID。 （C）乳酸の13 CのMID。エラーバーは、三重measuの標準偏差でありますrements。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：HeLa 細胞における細胞周期の位相間の代謝の違い。シチジンはG 1 -G 0及びSG 2 -M細胞で異なって標識されています。 （A）G 1 -G 0及びSG細胞周期の2 -M相におけるシチジン13 C濃縮。破線は自然の質量同位体からの炭素濃縮の略です。 （B）シチジンのMIDは、アレイG 1 -G 0でプロットとSG 2 -M相として示されます。エラーバーは、3回の測定の標準偏差です。 Vにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版をIEW。
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Discussion
我々の方法は、細胞代謝産物中のMIDは、細胞の代謝活性の「歴史」を反映している原理に基づいています。これは、細胞の複雑なコミュニティで生じたような従来の細胞選別手順と、細胞の亜集団における代謝活性を調査することができます。これとは対照的に、代謝物のピーク面積は、ソートされた細胞と培養皿11から直接抽出の抽出物との間で著しく異なります。部分的に異なる化学組成が質量分析法、いわゆる「マトリックス効果」の信号応答を変化させるためであるが、我々はまた、細胞をバッファ11に保持され、一方のアミノ酸は、選別中の細胞から失われることを示しています。これは、ソートの際に、細胞の代謝状態や活動を変更することができるが、これは我々の方法のために、それ自体には無関係である：MIDの直接抽出で観察されたものにかなり近いあることは、データがVALIのままオリジナルの、複雑な文化の各亜集団の代謝状態のd測定。
私たちは、最初に細胞が急速に代謝をクエンチし、直接抽出溶液（メタノール）に分類されたメソッドをテストしました。それらは我々の質量分析システムに大規模なイオン抑制を生じる、セルソーターシース液から塩およびおそらく他の汚染物質を多量に含有残念ながら、得られた抽出物を、分析が困難でした。したがって、我々は、セルソーター器具によって堆積過剰な液体は、抽出の前に洗浄され、ここで説明されたプロトコル、に定住しました。
我々のプロトコルは、HBSS、細胞生存率を維持するためにグルコースを補充した生理食塩水でのソートを伴います。いくつかの方法で、そのようなアミノ酸の漏れのような代謝ストレスを最小限にするために、実際の培地中で細胞を選別することが好ましい場合があります。しかし、選別された細胞の小さなペレットを洗浄することは困難であり、theref培地中に存在する鉱石の代謝産物は、細胞内代謝物の追求のMIDを汚染します。 13 C標識グルコースをトレーサーとして使用されるときはいつでも、同一の標識グルコースもHBSS溶液中で使用されるべきです。
図2に見られるように、多くの、すべてではない代謝物は、細胞選別手順の後、それらのMIDを維持します。 （例えば、乳酸、）特定の代謝物が具体的に改変されている理由を私たちは知りません。この結果は、興味のあるのMIDはモック選別により手続きを細胞選別に向けて堅牢であることを確認することが重要であることを強調しています。直接ソートされた亜集団のMIDを確認することはできませんが、手順はセル選択を除いて同一であるように、モックソート（例えばグルタミン酸）の影響を受けないのMIDは、同様に実際のソートによる影響を受けないでなければなりません。新しい細胞型または培養条件が使用されるたびに、この確認ステップは、実行されるべきです。 Oのことを指摘することは重要ですURの方法は堅牢のMIDは、このようにして確認することができるれる代謝物質に限定されます。
私たちは、ここで説明する方法は、細胞生物学および生物医学内のアプリケーションの数に有用であろうことを期待しています。フィーダー層培養、ニューロン、星状細胞モデル4、血球2の亜集団、また動物モデルから単離された複雑な細胞集団-としては、例えば、幹細胞などの共培養細胞の代謝表現型を含みます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree - MC - VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20 mm x 2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| Myrsyra 99.5% Optima (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
References
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