Introduction
고등 생물은 더 복잡한 기능에 대해 가지고 협력 별개의 세포 유형의 복잡한 사회를 포함한다. 예를 들어, 종양은 단지 암세포 만, 섬유 아세포, 혈관을 구성하고, 주로 면역 세포가 침투 한 세포를 포함하고; 혈액은 면역 세포 아형 2의 수십의 복잡한 혼합물을 포함, 심지어 배양 세포주는 내강 및 유방암 세포 (3)의 기부 아형 여러 개체군, 구성 될 수있다. 대사 "협력"을 나타낼 수있다 공존 또한, 서로 다른 세포 유형. 예를 들어, 뇌, 성상이 기판 (4)을 산화 한 후 뉴런 "공급"인 락트산 포도당 변환 생각된다; T 림프구는 시스테인 (5)의 소스로 인접 수지상 세포에 의존하는 일부 경우에; 암 세포는 asso과 협력 할 수있다종양 6 ciated 섬유 아세포. 이러한 시스템의 대사 동작을 이해하기 위해서는 본 분리하고 다양한 종류의 세포 대사 활동을 측정하는 것이 필수적이다.
지금까지 세포 유형을 분리하기위한 가장 널리 사용되는 방법은 형광 활성화 세포 분류이다. 이 방법은 세포 유형 또는 관심 상태는 형광 항체, 조작 된 형광 단백질의 발현 또는 다른 염료를 사용하여 "표지"가 제공 될 수 넓게 적용 가능하다. 하나의 옵션은 셀 소터 통해 초기 개별 세포 유형, 다시 배양 얻어진 각 세포 유형이다하고이 배양 물 (7)의 대사 과정을 수행한다. 세포 유형 또는 표현형은 배양 조건에 안정하며, 이러한 세포주기 상태 않으며 공동 배양 물에서 대사 협력으로 과도 행동을 캡처 할 수없는 경우,이 경우에만 가능하다. 이러한 경우를 들어, 신진 대사가 너무 직접 측정해야rted 세포. 이 절차를 선별 세포 신진 대사 8 왜곡 될 응력 세포 주제 때문에 도전이며, 우리는이 방법 (9) (10)를 가지고 단지 약간의 연구 알고있다. 특히, 절대 대사 풍부 측정이 더 이상 신뢰성있게 아미노산 등 주요 대사 산물은 세포 정렬 버퍼에 보관 세포로부터 누출하지 않을 수 있음을 발견 하였다 (11) (정렬 된 분획의 상대 비교가 여전히 유용 할 수 있음).
이러한 문제를 회피하기 위해, 우리는 정렬하기 전에 안정 동위 원소와 셀 라벨, 및 세포 대사보다는 대사 산물 존재비에서의 MID에 초점을 맞 춥니 다. MID를 길게 시간 규모 상에 형성되기 때문에, 그들은 적은 정렬 조건에 단기간 노출에 의해 영향을받을 것이다. 우리는 DA를 제공하기에 충분히 민감 전체 스캔 고분해능 질량 분석법을 이용하여 MID를 정량화셀 정렬 시간의 약 30 ~ 60 분을 필요로하는 약 50 만 분류 세포에서 시작 대사 산물의 수백에 따. 배양 접시가 관찰 된 MID는 원래 배양 대표적되도록 이루어진다에서의 비교를 직접 제어 (특정 인구 게이팅없이 셀 소터 구 통과 세포) 및 대사 추출 "모의 정렬". 안정 동위 원소 추적자의 선택에 따라 다양한 대사 경로는이 방법으로 공부하실 수 있습니다.
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Protocol
1. 대사 추출
- 접시에서 추출
- 안정 동위 원소 표지 된 배양 배지 + 투석 영양 보충제 (혈청 또는 다른 성장 보조제)에서 삼중의 6 웰 플레이트에서 배양 세포는 세포는 75 %의 합류가 될 때까지.
주 : U- 13 C 40 % 글루코스를 함유하는 RPMI에서 48 시간 70 % U- 13 C, 15-N2 글루타민 및 5 % 투석 된 FBS (태아 소 혈청)은 여기 HeLa 세포 배양. 투석 FBS는 레이블이 미디어를 오염시킬 수있는 작은 분자량 대사 물질을 제거하는 데 사용됩니다. 실제 실험 이전에 투석 보충에 세포를 배양하는 세포가 배지에서 정상적으로 성장하고 확인하는 것이 좋습니다. 보충 밤새 뱀 피부 투석 튜브를 사용하여 0.15 M NaCl 용액에서 투석된다. - 추출 폐기 문화 매체의 날에, 500 μL 차가운 HBSS로 두 번 우물을 씻어 후 폐기합니다.
참고 : 여기에 HBSS 40 %를 포함하는 사용 U-13 C 글루코스가 배양 배지에도 때문이다. - 추가 600 μL의 100 % 메탄올을 드라이 아이스에 미리 냉각시켰다.
- 얼음을 건조 세포 스크레이퍼와 세포 물질을 제거 할 수있는 요리를 전송합니다.
- 조심 질량 분광 분석까지 -80 ° C에서 microcentrifuge 관 및 저장소에 세포 추출물 피펫.
- 안정 동위 원소 표지 된 배양 배지 + 투석 영양 보충제 (혈청 또는 다른 성장 보조제)에서 삼중의 6 웰 플레이트에서 배양 세포는 세포는 75 %의 합류가 될 때까지.
- 모의 분류 세포의 추출
- 안정 동위 원소 표지 된 배양 배지 + 투석 보충 교재에서 삼중의 100mm 접시에 배양 세포.
주 : 100mm 접시에 48 시간 동안 배양 여기 HeLa 세포 세포의 높은 번호 (~ 4 × 106)은 50 정렬 세포를 얻기 위해 필요하기 때문이다. 헬라 세포 추출물이 숫자는 대사 산물의 좋은 측정을 받아야했다. 사용되는 배양 배지는 40 % RPMI는 U- 13 C 글루코스 70 % U- 13 C, 15-N2 글루타민 투석 FBS, 5 %를 함유 하였다. - 추출, 폐기 문화 매체의 날에, w 우물을 씻어i 번째 1.5 mL의 따뜻한 HBSS 후 폐기합니다.
- 37 ℃에서 4 분 동안 150 mL의 트립신 / EDTA를 첨가하여 세포를 분리. 4 ° C 또는 얼음에서 다음 단계를 수행합니다.
- 3 mL의 얼음 차가운 HBSS (행크의 균형 소금 솔루션) + 투석 보충을 추가하여 트립신을 비활성화합니다.
- 3 분 동안 750 XG에 15 mL의 튜브와 원심 분리기에서 세포를 수집합니다.
- 1-2 × 10 6 세포 / ㎖가, 단일 세포를 얻기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통과하고, 5 ㎖ 튜브로 전송 농도로 HBSS + 투석 보충 + 1 mM의 EDTA의 펠렛을 재현 탁.
- 정렬 만 단봉들에 대한 셀 소터 게이팅을 통해 세포, 4 ℃에서 3 분 동안 750 XG에 원심 분리기 분류 세포.
참고 : 여기에 정렬 헬라 계기 압력 27 PSI와 속도 1000 이벤트 / s로 세포, 및 100 μm의 노즐을 사용하여. 헬라 세포는 크고 그래서 그들은 가능한 한 그대로 펠렛을 얻기 위해 느린 이벤트 속도와 큰 노즐로 분류되어야한다. throughou 감기 블록 세포 유지t은 신진 대사를 감소 정렬. 정렬 절차의 철저한 설명은 이전 12 설명한다. - 뜨는을 취소하고 메탄올을 추가하기 전에 균일 한 펠렛을 얻기 위해 50 μL 얼음 차가운 DH 2 O의 펠렛을 재현 탁. 직접 펠릿을 냉 메탄올에 첨가 재현 탁 어렵다 고체 펠렛을 형성한다.
- 드라이 아이스에 보관 540 μL 메탄올을 추가하여 대사 물질을 추출하여 액체 크로마토 그래피 때까지 -80 ° C에서 추출물을 유지 - 고해상도 질량 분석 (LC-HRMS) 분석.
- 안정 동위 원소 표지 된 배양 배지 + 투석 보충 교재에서 삼중의 100mm 접시에 배양 세포.
- 세포주기의 추출 세포 정렬
- 문화 미디어 + 투석 보충 교재에서 삼중의 100mm 접시에 배양 세포.
참고 : Geminin Fucci 녹색 G1 (음)과 SG2M (양의) 세포로 정렬 할 수 있습니다 (MAG1-hGem) 탐침 (13)를 포함하는 다음 문화 HeLa 세포. 세포는 안정 동위 원소 추적 미디어에서 배양 될 수있다필요에 따라 긴이야. 여기에 우리가 레이블이없는 미디어에서 46 시간 동안을 배양 한 후, 우리는 RPMI 40 % U- (13) C-포도당 70 % U- (13) C를 함유로 전환 한 15 N2 - 글루타민 2 시간 전에 정렬 시작. 이것은 짧은 펄스 라벨링 필요한 세포주기 단계를 연구 할 수 있도록하기 위해 수행되었다. - 추출, 폐기 문화 매체의 날에, 1.5 mL의 따뜻한 HBSS와 우물을 씻어 후 폐기합니다.
- 37 ℃에서 4 분 동안 150 mL의 트립신 / EDTA를 첨가하여 세포를 분리. 4 ° C 또는 얼음에서 다음 단계를 수행합니다.
- 3 mL의 얼음 차가운 HBSS + 투석 보충을 추가하여 트립신을 비활성화합니다.
- 3 분 동안 750 XG에 15 mL의 튜브와 원심 분리기에서 세포를 수집합니다.
- 1-2 × 10 6 세포 / ㎖가, 단일 세포를 얻기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통과하고, 5 ㎖ 튜브로 전송 농도로 HBSS + 투석 보충 + 1 mM의 EDTA의 펠렛을 재현 탁.
- 셀 소터 g을 통해 정렬 세포다음, 파편과 이중선을 ating 관심의 세포 마커에 대한 게이팅, 원심 분리기 분류 세포를 4 ℃에서 3 분 동안 750 XG에.
참고 : 여기에 정렬 헬라 계기 압력 27 PSI와 속도 1000 이벤트 / s로 세포, 및 100 μm의 노즐을 사용하여. 신진 대사 속도를 감소 정렬을 통해 차가운 블록 세포를 유지합니다. - 뜨는을 취소하고 메탄올을 추가하기 전에 균일 한 펠렛을 얻기 위해 50 μL 얼음 차가운 DH 2 O의 펠렛을 재현 탁. 직접 펠릿을 냉 메탄올에 첨가 재현 탁 어렵다 고체 펠렛을 형성한다.
- 드라이 아이스에 보관 540 μL 메탄올을 추가하여 대사 물질을 추출 및 LC-HRMS 분석 할 때까지 -80 ° C에서 추출물을 유지합니다.
- 문화 미디어 + 투석 보충 교재에서 삼중의 100mm 접시에 배양 세포.
2. 질량 분석 분석
참고 : 여기에 우리가 LC-HRMS 시스템에서 세포 추출물을 분석하기위한 프로토콜을 설명합니다. 세포 추출물의 분석에 대한 대사 체학 방법이 사용될 수있다. 전체 검사분석은 대사 산물의 다양한 검출에 유용 할 수있다.
- 질량 분석 참조 교정 믹스를 사용하여 기기를 보정합니다.
- 15 초 30 분, 소용돌이 얼음에 해동 세포 추출물.
- 4 ℃에서 13,000 × g으로 10 분 동안 스핀 필터 및 원심 분리하여 세포 추출물 100 ㎕를 옮긴다.
- 액정-HRMS 시스템에 여액 12.5 μL를 주입한다.
- (ZIC-HILIC) 칼럼 (150mm X 4.6 mm, 5 ㎛의 입자 크기) 양쪽이 온성 친수성 상호 작용 액체 크로마토 그래피를 이용하여 분리 된 대사 물질 0.1 % 포름산 구배 용출을 이용하여 ZIC-HILIC 가드 컬럼 (20mm mm 2.1 ×) 장착 물에 산 (용매 A) 및 아세토 니트릴 (용매 B). 용매 (A)의 20 % 구배 용출를 시작하고 17 분에서 80 %까지 증가한다. 각각 최소 400 μL의 흐름 -1 컬럼 온도 및 샘플 트레이 23 ° C에서 4 ° C와 4 분 동안이 비율을 유지한다.
- 는 I를 사용하여대사 검출 이온화 소스로서 포지티브 및 네거티브 모드 모두에서 가열 된 전기 분무 (H-ESI II) 및 70,000 전폭 반치 (FWHM)의 질량 분해능의 전체 검사를 획득 모드의 크로마토 그래피 분리에 결합 nstrument ( m / z 200).
- 플로우 (45)의 속도와 350 ° C에서 10 노소 (임의의 단위) 및 설정 증발기 온도와 긍정적 인 모드와 -3.5 kV의 4 kV로에서의 전기 분무 전압에서 시스 가스 및 보조 가스 질소 (순도> 99.995 %)를 사용하여 부정적인 모드입니다.
3. 데이터 분석
- 표준이 가능하며 샘플에서 좋은 품질의 피크를 표시하는 대사 산물의 번호를 선택합니다. 양질의 피크 대 잡음비가 높은 신호. 최고 품질을 확인하고 거짓 동위 원소를 포함하지 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 모양 및 / 또는 체류 시간이 다른 동위 원소 피크 가능성이 false입니다.
- 동위 원소 표지 샘플 (질량 동위 원소를 계산을 위해MI) 모든 잘못의 총 피크 면적과 각 MI의 피크 면적을 나누어 분수.
- 로 각각 13 C, 15 N의 농축을 표지 탄소 / 질소 분수를 계산
여기서 n은 대사 산물의 탄소의 총 수 (또는 질소 각각은)이며, 혼합 x의 MI 분율이다.
주 : 모든 계산은 프로그래밍 언어를 사용하여 수행 될 수있다.
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Representative Results
일례로서, 우리가 세포주기의 단계에 따라 정렬 HeLa 세포의 신진 대사를 조사하는 실험을 기술한다. 모두 탄소와 질소에 중앙 대사의 다양한 레이블을 지정하려면, 우리는 U- (13) C-포도당과 U-13 C, 추적자로 15 N 글루타민을 사용하여 48 시간 동안 세포를 배양. 동위 원소의 중간 수준보다 다양한 MI 패턴 (14)을 생성하는 경향이 검증 실험에 대한 풍부한 MID를 얻으려면, 우리는 여기에, 40 % U- (13) C-포도당 70 % U- 13 C, 15 N2 - 글루타민의 혼합물을 선택했다.
검증 실험을 위해 우리는 85 대사의 대상으로 분석을 수행 하였다. 품질이 좋지 품질 LC-MS 피크를 제거하는 단계를 제어 후, 우리는 (66)가 모의 분류 세포 (96 %)에 존재하는의 직접적인 세포 추출물에 69 봉우리를 감지 할 수 있었다. 이들 중 60 레이블이 등장자신의 MID를 접시 추출물 및 모의 분류 세포 (그림 2A) 사이에 유사했다, 대부분의 경우 (자연 풍부 위의 동위 원소 농축). 예를 들어, (13 C, 15 N 잘못을 모두 포함) 글루타메이트의 MID는 글루타메이트 MID는 정렬 된 세포 집단에서 또한 신뢰할 수있는 것을 나타내는, 요리 및 모의 분류 추출물 (그림 2B)와 유사하다. 그러나 일부 대사 명확히 분류 절차에 의해 영향을 받는다 예를 들어, 락트산 불명 이유로 모의 정렬 셀 13 이하 C 세였다. 실제 분류 분수에서 데이터를 분석 할 때 이런 대사는주의를 볼 수 있습니다. 모의 분류 세포에서 측정 된 MI 분획의 91 %는 MID를 정렬 세포에서 높은 재현성했다 나타내는 생물학적 삼중에서 1 %보다 표준 편차 덜했다.
우리는 다음 헬라 중 하나를 G0 / G1 또는 S / G2로 분류 분석 / M 세포주기의FUCCI Geminin 프로브 (12)를 사용하여 TAGES. 이러한 세포주기 단계에 있기 때문에 2 시간 동안 마지막 만 ~ 10 시간, 여기에 우리 "펄스"이라는 문화는 단계 사이의 서로 다른 동위 원소 라벨을 달성했다. 예를 들어, 우리는 시티 딘이 두 집단으로 분류되지만 것을 언급 S 단계에서 뉴클레오티드의 증가 드 노보 합성과 일관되는 S / G2 / M 단계에서 높은 농축에 (도 3). 이 경우, MID는 동일한 합성 경로를 사용하는 것을 제안하는 두 분획에서 동일한 패턴을 도시하지만, S / G2 / M 단계에서 더 활성화된다. 이러한 데이터는 신진 대사의 차이도 밀접한 관련이 개체군 사이에이 방법으로 쉽게 검출 있음을 보여줍니다.
그림 1 : 실험 설계. 요리의 준비를위한 워크 플로우, 모의 정렬 및 추가 하위 집단을 분류캐럿. 접시 및 모의 분류 추출물 분류에 의한 변화 가능성에 대한 테스트에 비교 요리와 모의 분류 추출물의 검증 실험의 MID에 사용됩니다. 세포의 복잡한 인구 관심 세포 유형의 마커에 기초하여 정렬 한 후 추출된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 직접 추출에 대한 MID를의 검증. 분산 형 (A) (13) C의 플롯과 접시에 15 N 농축 및 모의 분류 샘플. 각 점은 복제를 나타냅니다. 삼중는 선으로 연결된다. (B) 글루타메이트의 13 C- 15 N의 MID. 락 테이트 (C) 13 C의 MID. 오류 막대는 세중 measu의 표준 편차입니다rements. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 : HeLa 세포에서 세포주기 상간 대사 차이. 시티 딘은 G 1 -G 0 SG 2 -M 세포에서 다르게 표시된다. (A) 시티 딘 (13) C의 G-G 1 0에서 농축하고 SG 세포주기의 단계 2 -M. 점선은 자연 질량 동위 원소에서 탄소 농축을 의미합니다. (B) 시티 딘의 MID는 배열 G 1 -G 0 플롯과 SG (2) -M 단계로 표시. 오차 막대는 삼중 측정의 표준 편차이다. V 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 서평.
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Discussion
우리의 방법은 세포의 대사에서의 MID는 세포 대사 활동의 "히스토리"를 반영한다는 원리에 기초한다. 이것은 그들이 이전 셀 정렬 절차 세포의 복잡한 지역에서 발생으로 가능 세포의 하위 집단에서 대사 활동을 조사 할 수있다. 반면, 대사 산물의 피크 지역 분류 세포와 배양 접시 (11)에서 직접 추출 추출 사이에 현저하게 다르다. 일부 다른 화학 성분은 질량 분석, 소위 "매트릭스 효과"의 신호 응답을 변경하기 때문이다, 그러나 또한 세포가 버퍼 (11)로 유지하면서 아미노산이 정렬 동안 세포로부터 손실 된 것으로 나타났다. 이 정렬 동안 신진 대사 상태와 세포의 활동을 변경할 수 있지만,이 자체가 우리의 방법과 관련이 : MID를 직접 추출에서 관찰 된 것과 합리적으로 가까운 것을 제공, 데이터는 VALI 남아원래 복잡한 문화의 각 모집단의 대사 상태 라 측정.
우리는 처음에 세포가 빠른 속도로 신진 대사를 해소하기 위해 직접 추출 용액 (메탄올)로 분류 된 방법을 시험했다. 그들은 우리 질량 분석기 시스템에서 대규모 이온 진압 결과, 셀 소터 시스 유체로부터 가능한 염 및 기타 오염 물질의 다량 함유 불행히도, 얻어진 추출물을 분석하기 어려웠다. 따라서 우리는 셀 소터 장비에 의해 증착 초과 유체 추출하기 전에 세척 여기에 설명 된 프로토콜에 정착했다.
우리 프로토콜 HBSS, 세포 생존을 유지하기 위해 글루코오스가 보충 생리 식염수 정렬 수반한다. 어떤면에서, 실제의 배지에서 세포는 아미노산으로 누설 대사성 스트레스를 최소화하도록 정렬하는 것이 바람직 할 수있다. 그러나, 정렬 된 셀의 작은 펠릿을 세척하기 어렵고, theref매체에 존재하는 광석 대사는 세포 내 대사 산물의 노력의 MID를 오염시킬 것이다. 13 C 표지 글루코스 트레이서로서 사용될 때마다, 동일한 분류 글루코스뿐만 아니라 HBSS 용액에 사용되어야한다.
도 2에 도시 된 바와 같이, 전부는 아니지만 많은 대사, 세포 선별 과정 후에도 MID를 유지한다. (예를 들어, 젖산) 특정 대사 산물은 특별히 변경하는 이유를 우리는 모른다. 이 결과는 관심의 MID를 모의 정렬하여 순서를 정렬 셀을 향해 강력한 있는지 확인하는 것이 중요 있음을 강조한다. 그것은 직접 정렬 모집단의 MID를 확인하는 것은 불가능하지만, (예를 들어, 글루탐산) 모의 정렬에 영향을받지 MID는이 절차는 셀의 선택을 제외하고 동일하다으로서뿐만 정렬은 실제에 의해 영향을받지 않을 것이다. 새로운 세포 유형 또는 배양 조건이 이용 될 때마다 검증 단계가 수행되어야한다. 오 것을 지적하는 것이 중요하다UR 방법은 강력한 MID는 이러한 방식으로 확인 될 수있는 대사 물질로 제한된다.
우리는 여기에 설명 된 방법은 세포 생물학 및 생물 의학에서 응용 프로그램의 숫자에 도움이 될 것으로 기대하고 있습니다. 피더 계층 문화, 신경 세포 성상 세포 모델 4, 혈액 세포 2의 소집단, 또한 동물 모델에서 분리 된 복잡한 세포 집단 - 예를 들면 대사 등 줄기 세포로 공 배양 세포의 표현형을 포함한다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree - MC - VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20 mm x 2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| Myrsyra 99.5% Optima (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
References
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