Introduction
Högre organismer innehåller komplexa samhällen av olika celltyper som samverkar för att åstadkomma mer komplexa funktioner. Till exempel, tumörer innehåller inte bara cancerceller, men även fibroblaster, celler som utgör blodkärlen, och ofta immun cellinfiltrat 1; blod innehåller en komplex blandning av dussintals immunceller subtyper 2; och till och med odlade cellinjer kan bestå av multipla subpopulationer, såsom den luminala och basal subtyper av bröstcancerceller 3. Dessutom, distinkta celltyper som samexisterar kan uppvisa metabola "samarbete". Till exempel, i hjärnan, är astrocyter tänkt att omvandla glukos till laktat, som sedan "fed" till neuroner som oxiderar detta substrat 4; T-lymfocyter är i vissa sammanhang är beroende av intilliggande dendritiska celler som en källa till cystein 5; och cancerceller kan samarbeta med assoförbundna fibroblaster i tumörer 6. För att förstå den metaboliska beteendet hos sådana system, är det väsentligt att separera och mäta de metaboliska aktiviteterna av olika celltyper som är närvarande.
Överlägset mest använda metoden för att separera celltyper är fluorescensaktiverad cellsortering. Denna metod är brett tillämpbar, under förutsättning att celltypen eller tillståndet av intresse kan "märkas" med hjälp av fluorescerande antikroppar, uttryck av manipulerade fluorescerande proteiner, eller andra färgämnen. Ett alternativ är att initialt separata celltyper genom en cellsorterare, åter kultur de enskilda celltyper som erhållits, och utför sedan metabolismstudier av dessa kulturer 7. Detta är dock endast möjligt om den celltyp eller fenotyp är stabil i odlingsbetingelser, och kan inte fånga övergående beteende såsom cellcykeltillstånd, eller det metabola samarbete i co-kulturer. För sådana fall måste ämnesomsättning mätas direkt på sårted celler. Detta är en utmaning, eftersom cellsortering förfarande utsätter celler för påfrestningar som kan förändra deras metabolism 8, och vi är medvetna om endast ett fåtal studier som denna metod 9, 10. I synnerhet, har vi funnit att huvudmetaboliter såsom aminosyror kan läcka från celler som hålls i cellsortering buffert, så att mätningar av absoluta metabolit överflöd är inte längre tillförlitliga 11 (även om relativ jämförelse mellan sorterade fraktioner kan fortfarande vara värdefull).
För att kringgå dessa frågor, märker vi celler med stabila isotoper före sortering och fokusera på MID i cellulära metaboliter, snarare än metabolit bestånd. Eftersom MID bildas över längre tidsskalor, bör de påverkas mindre av kortvarig exponering för sorteringsvillkor. Vi kvantifiera MID använder fullscan högupplösande masspektrometri, vilket är tillräckligt känslig för att ge daTA på hundratals metaboliter som börjar från cirka 500.000 sorterade celler, som kräver ca 30-60 min av cellsortering tid. En jämförelse mellan en "mock sorteras" kontroll (celler passerade genom cellsorteringsinstrument utan grind någon specifik population) och metabolit extraktion direkt från odlingsskålen görs för att säkerställa att de observerade MID är representativa för dem i den ursprungliga kulturen. Beroende på valet av stabila isotopspårämnen kan olika metaboliska vägar studeras med denna metod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Metabolit Extraktion
- Extraktion från skålen
- Kulturceller i en 6-brunnsplatta i triplikat i stabila isotopmärkta odlingsmedia + dialyse kosttillskott (serum eller andra tillväxtsupplement) tills cellerna blir 75% konfluenta.
OBS: Här kultur HeLa-celler under 48 timmar i RPMI innehållande 40% U 13 C-glukos och 70% U 13 C, 15 N2-glutamin och 5% dialyserat FBS (fetalt bovint serum). Dialys FBS används för att bli av med de små molekylvikt metaboliter som kan förorena den märkta media. Odling av celler i dialys tillägg före den verkliga experiment rekommenderas för att säkerställa celler växer normalt i mediet. Kosttillskott dialyseras i 0,15 M NaCl-lösning under natten med hjälp av ormskinn dialysrör. - På dagen för utvinning kasseodlingsmedier, skölj brunnar två gånger med 500 mikroliter kall HBSS och sedan kasta den.
OBS: Här använder HBSS innehållande 40% U-13 C-glukos eftersom det också i odlingsmedia. - Lägg 600 mikroliter 100% metanol förkyld på torris.
- Överför skålen torris och avlägsna cellmaterial med en cellskrapa.
- Försiktigt pipett cellextrakt till ett mikrocentrifugrör och förvara vid -80 ° C tills masspektrometrianalys.
- Kulturceller i en 6-brunnsplatta i triplikat i stabila isotopmärkta odlingsmedia + dialyse kosttillskott (serum eller andra tillväxtsupplement) tills cellerna blir 75% konfluenta.
- Extraktion av mock sorterade celler
- Kultur celler i en 100 mm skål i tre exemplar i stabila isotopmärkta kultur media + dialyse tillskott.
OBS: Här kultur HeLa-celler under 48 h i 100 mm skål, eftersom ett stort antal celler (~ 4 x 10 6) behövs för att erhålla 500.000 sorterade celler. Detta antal HeLa-celler extrakt krävdes för att erhålla god mätning av metaboliter. Odlingsmedia som användes var RPMI innehållande 40% U 13 C-glukos och 70% U 13 C, 15 N2-glutamin och 5% dialyserat FBS. - Vid dagen för extraktion, kassera odlingsmedier, skölj brunnar wed 1,5 ml varm HBSS och sedan kasta den.
- Lösgöra celler genom att tillsätta 1,5 ml trypsin / EDTA under 4 min vid 37 ° C. Utför följande steg i 4 ° C eller på is.
- Deaktivera trypsin genom tillsats av 3 ml iskall HBSS (Hanks balanserade saltlösning) + dialyse tillägg.
- Samla in celler i ett 15 ml rör och centrifugera vid 750 xg under 3 min.
- Suspendera pelleten i HBSS + dialys tillägg + 1 mM EDTA vid en koncentration 1-2 x 10 6 celler / ml, passerar genom 40 um cell silar för att erhålla enstaka celler, och överför till en 5 ml rör.
- Sorterings celler genom cellsorterings gating endast för singletter, och centrifugera sorterade cellerna vid 750 xg under 3 min vid 4 ° C.
OBS: Här sortera HeLa-celler med en hastighet 1000 händelser / s, med instrumenttryck 27 psi, och med hjälp av en 100 um munstycke. HeLa-celler är stora så att de ska sorteras på en långsam händelsehastigheten och stora munstycke för att få så intakt pellet som möjligt. Hålla cellerna i kalla block throughout sortering att minska ämnesomsättningen. En utförlig beskrivning av sorterings procedur beskrivits tidigare 12. - Kassera supernatanten och suspendera pelleten i 50 mikroliter iskall dH 2 O för att erhålla en homogen pellet innan tillsats av metanol. Tillsats av kall metanol direkt till pellets bildar en fast pellet som är svårt att återsuspendera.
- Utdrag metaboliter genom att tillsätta 540 mikroliter metanol förvaras i torris och hålla extrakt vid -80 ° C tills vätskekromatografi - högupplösande masspektrometri (LC-HRMS) analys.
- Kultur celler i en 100 mm skål i tre exemplar i stabila isotopmärkta kultur media + dialyse tillskott.
- Extraktion av cellcykeln sorteras cellerna
- Kultur celler i en 100 mm skål i tre exemplar på odlingsmedia + dialyse kosttillskott.
OBS: Här kultur HeLa-celler som innehåller Geminin Fucci Green (mAG1-hGem) sond 13 som medger sortering av G1 (negativ) och SG2M (positiva) celler. Celler kan odlas i stabila isotop spåra media för enlånga som krävs. Här har vi odlade dem i 46 timmar i omärkt media, då vi har bytt till RPMI innehållande 40% U 13 C-glukos och 70% U 13 C, 15 N2-glutamin 2 timmar innan sortering. Detta gjordes i syfte att kunna studera de cellcykelfaser som kräver en kort pulsmärkning. - På dagen för utvinning, kassera odlingsmedier, skölj brunnar med 1,5 ml varm HBSS och sedan kasta den.
- Lösgöra celler genom att tillsätta 1,5 ml trypsin / EDTA under 4 min vid 37 ° C. Utför följande steg i 4 ° C eller på is.
- Avaktivera trypsin genom tillsats av 3 ml iskall HBSS + dialys tillägg.
- Samla in celler i ett 15 ml rör och centrifugera vid 750 xg under 3 min.
- Suspendera pelleten i HBSS + dialys tillägg + 1 mM EDTA vid en koncentration 1-2 x 10 6 celler / ml, passerar genom 40 um cell silar för att erhålla enstaka celler, och överför till en 5 ml rör.
- Sorterings celler genom cellsorterings grande ut skräp och dubletter, därefter grindning för cellmarkör av intresse och centrifugera sorterade cellerna vid 750 xg under 3 min vid 4 ° C.
OBS: Här sortera HeLa-celler med en hastighet 1000 händelser / s, med instrumenttryck 27 psi, och med hjälp av en 100 um munstycke. Hålla cellerna i kalla block hela sortering för att minska ämnesomsättning. - Kassera supernatanten och suspendera pelleten i 50 mikroliter iskall dH 2 O för att erhålla en homogen pellet innan tillsats av metanol. Tillsats av kall metanol direkt till pellets bildar en fast pellet som är svårt att återsuspendera.
- Extrahera metaboliter genom att tillsätta 540 mikroliter metanol hålls i torris och hålla extrakt vid -80 ° C tills LC-HRMS analys.
- Kultur celler i en 100 mm skål i tre exemplar på odlingsmedia + dialyse kosttillskott.
2. masspektrometri Analys
Obs: Här beskriver vi protokoll för analys av cellextrakt på en LC-HRMS systemet. Eventuella metabolomik metoder för analys av cellextrakt kan användas. Fullständig genomsökninganalys kan vara användbar för detektering av ett brett spektrum av metaboliter.
- Kalibrera instrumentet med en masspektrometri referenskalibreringsblandning.
- Tö cellextrakt på is under 30 min och vortexa i 15 s.
- Överföra 100 mikroliter av cellextraktet till en spinnfiltret och centrifugera i 10 minuter vid 13.000 xg vid 4 ° C.
- Injicera 12,5 mikroliter av filtratet på LC-HRMS systemet.
- Separata metaboliter som använder ett zwitterjoniskt Hydrofil Interaction vätskekromatografi (zic-HILIC) kolonn (150 mm x 4,6 mm, 5 | im partikelstorlek) försedd med en zic-HILIC skyddskolonn (20 mm x 2,1 mm) med användning av en gradienteluering av 0,1% myrsyra syra i vatten (lösningsmedel A) och acetonitril (lösningsmedel B). Starta gradienteluering vid 20% av lösningsmedel A och öka upp till 80% under 17 min. Behåll denna procentsats under 4 min med ett flöde av 400 mikroliter min -1 och kolonntemperaturen och provbricka vid 23 ° C och 4 ° C, respektive.
- Använd en instrument kopplad till den kromatografiska separationen för metaboliter upptäckt, en uppvärmd elektro (H-ESI II) i både positiva och negativa lägen som jonisering källa, och en fullständig genomsökning förvärv läge på en massa upplösningsförmåga 70.000 Full bredd halvt maximum (FWHM) ( m / z 200).
- Använda kväve (renhet> 99,995%) för mantelgasen och hjälpgasen vid en flödeshastighet av 45 och 10 au (godtyckliga enheter) och ställ vaporizer temperatur vid 350 ° C och elektrospray spänningen vid 4 kV i positiv mod och -3,5 kV i negativ-läge.
3. Dataanalys
- Välj ett antal metaboliter för vilka normer finns och som visar god kvalitet toppar i proverna. God kvalitet toppar har hög signal-brusförhållande. Det är viktigt att kontrollera topp kvalitet och se till att inte inkludera falska isotoper. Isotop toppar som skiljer sig i form och / eller uppehållstid sannolikt falskt.
- För isotopmärkta prover beräkna mass isotopomer (MI) fraktioner genom att dividera topparean för varje MI med totala toppytorna för alla hjärtinfarkter.
- Beräkna de märkta kol / kvävefraktioner, anrikning av 13 C och 15 N, respektive, som
där n är det totala antalet kolatomer (eller kväveatomer, respektive) i metaboliten och blanda är Ml fraktionen av x.
NOTERA: Alla beräkningar kan utföras med hjälp programmeringsspråk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som ett exempel, här beskriver vi ett experiment undersöker metabolismen av HeLa-celler sorterade enligt cellcykelfasen. Att märka ett stort antal centrala metaboliter både kol och kväve, odlade vi celler under 48 timmar med hjälp av U 13 C-glukos och U 13 C, 15 N-glutamin som spårämnen. För att få rika MID för validering experimentet här valde vi en blandning av 40% U 13 C-glukos och 70% U 13 C, 15 N2-glutamin, som mellanliggande nivåer av isotoper tenderar att generera mer varierade MI mönster 14.
För validering experiment vi en riktad analys av 85 metaboliter. Efter kvalitetskontroll åtgärder för att ta bort dålig kvalitet LC-MS-toppar, kunde vi upptäcka 69 toppar i de direkta cellextrakt, varav 66 var närvarande i mock sorterade celler (96%). 60 av dessa visade sig märkas(isotop anrikning över naturligt förekommande), och i de flesta fall sina MID liknade mellan maträtt extrakt och mock sorterade celler (Figur 2A). Till exempel, är MID av glutamat (som inkluderar både 13 C och 15 N MIS) likartad mellan skålen och mock sorterade extrakt (figur 2b), vilket indikerar att glutamat MID är tillförlitlig även i sorterade cellpopulationer. Men vissa metaboliter tydligt påverkas av sorteringsproceduren, till exempel, laktat hade mindre 13 C 3 i mock sorterade celler, av okänd anledning. Sådana metaboliter ska ses med försiktighet vid att analysera data från verkliga sorterade fraktioner. I mock sorterade celler, hade 91% av det uppmätta MI-fraktionen en standardavvikelse mindre än 1% genom biologiska triplikat, vilket indikerar att MID var mycket reproducerbar i sorterade celler.
Vi analyserade nästa HeLa sorteras i antingen G0 / G1 eller S / G2 / M cellcykel sTages använder Fucci Geminin sonden 12. Eftersom dessa cellcykelsteg sista bara ~ 10 h, vi här "puls" märkt kulturer för 2 timmar för att uppnå olika isotopmärkning mellan stegen. Till exempel, noterade vi att cytidin är märkt i båda populationerna, men till en högre anrikning i S / G2 / M stadium, i överensstämmelse med ökade de novo syntes av nukleotider under S-fasen (Figur 3). I detta fall visar MID samma mönster i båda fraktionerna, vilket tyder på att samma syntesväg användes, men är mer aktiv i S / G2 / M skede. Dessa data visar att metaboliska skillnader är lätt detekterbar genom denna metod även mellan närbesläktade subpopulationer.
Figur 1: Experimentell design. Arbetsflöde för framställning av skålen, mock sorteras och sorterade subpopulation extract. Skålen och mock sorterade extrakten användes i valideringsexperiment MID av skålen och mock sorterade extrakten jämfört med testet för eventuella ändringar på grund av sortering. Komplex population av celler sorteras baserat på markör för celltypen av intresse och sedan extraheras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Validering av MID mot direkta extraktioner. Spridningsdiagram av (A) 13 C och 15 N anrikning i skålen och mock sorterade prover. Varje punkt representerar en replikat. Triplikat förenas med linjer. (B) 13 C 15 N MID av glutamat. (C) 13 C MID av laktat. Felstaplarna är standardavvikelser av trippel measurements. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Metabola skillnader mellan cellcykelfaser i HeLa-celler. Cytidin märks på olika sätt i G 1 -G 0 och SG 2 -M celler. (A) cytidin 13 C anrikning i G 1 -G 0 och SG 2 -M faser av cellcykeln. Streckad linje står för kol anrikning av naturlig massa isotop. (B) cytidin MID visas som matris tomter i G 1 -G 0 och SG 2 -M faser. Felstaplarna är standardavvikelser av trippelmätningar. Klicka här för att visa b en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår metod bygger på principen att MID i cellulära metaboliter spegla "historia" av metaboliska aktiviteter i en cell. Detta gör det möjligt att undersöka metaboliska aktiviteter i subpopulation av celler, eftersom de inträffade i den komplexa samhället av celler, före cellsorteringsproceduren. I kontrast, toppytorna för metaboliter skiljer sig markant mellan extrakt av sorterade celler och direkt extraktion från odlingsskålen 11. Delvis beror detta på att de olika kemiska kompositionen förändrar signalsvaret i masspektrometri, en så kallad "matriseffekt", men vi har också visat att aminosyror går förlorade från celler under sortering, medan celler hålls i bufferten 11. Detta kan förändra metabola tillstånd och aktiviteter av celler under sortering, men detta är i sig irrelevant för vår metod: under förutsättning att MID är någorlunda nära de som observerats i direkt extraktion förblir uppgifter en valid mätning av metaboliska tillståndet hos varje subpopulation i den ursprungliga, komplexa kultur.
Vi testade först en metod där celler sorterades direkt i extraktionslösningen (metanol) för att snabbt släcka ämnesomsättningen. Tyvärr, de resulterande extrakten var svåra att analysera, eftersom de innehöll höga halter av salter och eventuellt andra föroreningar från cellsorterare omslutande vätska, vilket resulterar i massiv jon undertryckande på vår mass systemet spektrometri. Vi bosatte sig därför det protokoll som beskrivs här, där överskottsvätska deponerats av cellsorterare instrumentet tvättas ut före extraktion.
Våra protokoll innebär sortering i HBSS, en fysiologisk saltlösning kompletterad med glukos för att upprätthålla cellviabilitet. På vissa sätt, kan det vara föredraget att sortera celler i själva odlingsmediet för att minimera metabolisk stress, såsom aminosyra läckage. Det är emellertid svårt att tvätta den lilla pellet av sorterade celler, och therefmalm metaboliter som förekommer i mediet skulle förorena de sökta MID av intracellulära metaboliter. Närhelst 13 C-märkt glukos används som spårämne, bör identiskt märkta glukos användas i HBSS-lösning samt.
Som framgår av Figur 2, många, men inte alla metaboliter, behålla sina MID efter cellsortering förfarande. Vi vet inte varför vissa metaboliter (laktat, till exempel) är speciellt ändras. Detta resultat understryker att det är viktigt att kontrollera att MID av intresse är robusta mot cellsortering förfarande genom mock sortering. Även om det inte är möjligt att direkt kontrollera MID av en sorterade subpopulation bör MID som är opåverkade av mock sortering (glutamat, till exempel) inte påverkas av den faktiska sorterings också, eftersom proceduren är identiska med undantag för val cellen. Denna validering steget bör utföras varje gång en ny celltyp eller odlingsförhållanden används. Det är viktigt att påpeka att oUR metod är begränsad till metaboliter som kan verifieras robusta MID på detta sätt.
Vi räknar med att den metod som beskrivs här kommer att vara användbara i ett antal tillämpningar inom cellbiologi och biomedicin. Som exempel kan nämnas metaboliska fenotyper av samodlade celler såsom stamcells - matarskikt kulturer, neuron-astrocyternas modeller 4, subpopulationer av blodceller 2, och även komplexa cellpopulationer isolerade från djurmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree - MC - VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20 mm x 2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| Myrsyra 99.5% Optima (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
References
- Gregersen, P. K. Cell type-specific eQTLs in the human immune system. Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).
- Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).
- Prat, A., et al. Characterization of cell lines derived from breast cancers and normal mammary tissues for the study of the intrinsic molecular subtypes. Breast Cancer Res. Treat. 142 (2), 237-255 (2013).
- Magistretti, P. J., Allaman, I. A Cellular Perspective on Brain Energy Metabolism and Functional Imaging. Neuron. 86 (4), 883-901 (2015).
- Angelini, G., et al. Antigen-presenting dendritic cells provide the reducing extracellular microenvironment required for T lymphocyte activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1491-1496 (2002).
- Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Harris, A. L., Sivridis, E. Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: A metabolic survival role for tumor-associated stroma. Cancer Res. 66 (2), 632-637 (2006).
- Hollenbaugh, J. A., Munger, J., Kim, B. Metabolite profiles of human immunodeficiency virus infected CD4+ T cells and macrophages using LC-MS/MS analysis. Virology. 415 (2), 153-159 (2011).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytom. Part A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Moussaieff, A., et al. High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).
- Johnson, C., et al. A metabolic signature of colon cancer initiating cells. Cancer Metab. 2, 32 (2014).
- Roci, I., et al. Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells. Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).
- Shapiro, H. Practical flow cytometry. , Wiley-Liss. New York. (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Noack, S., Wiechert, W. Quantitative metabolomics: A phantom. Trends Biotechnol. 32 (5), 238-244 (2014).
