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Neuroscience

Capillaire Feeder Assay mesures prise alimentaire dans Published: March 17, 2017 doi: 10.3791/55024
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1, 1, 1
1Institute of Zoology, Albertus-Magnus University of Cologne, 2Department of Veterinary Biomedical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan

Introduction

Manger est essentielle; Cependant, la déréglementation de l' apport alimentaire entraînant des troubles de l' alimentation tels que la boulimie, l' anorexie ou la tendance générale à suralimenter impose des coûts aux individus et à la société 1, 2, 3. L'objectif de la présente recherche est de découvrir les mécanismes de régulation de la prise alimentaire et de fournir une stratégie pour contourner la formation de trouble. De nombreuses études utilisant des organismes modèles de mammifères ont fourni de nouvelles informations sur les circuits et le rôle des systèmes de signalisation dans les troubles de 4, 5, 6 alimentation. Néanmoins, notre connaissance des bases neuronales et moléculaires qui sous-tendent ces troubles reste loin d'être complète. Au cours des dernières années, la mouche Drosophila melanogaster est devenu un système de modèle utile pour démêler des idées mécanistes de base dans le règlement de METABOLIm 7, 8, 9. Le test capillaire Feeder (CAFE) pour Drosophila melanogaster a été créé dans le laboratoire de Seymour Benzer en 2007 inspiré par une œuvre plus tôt par Dethier dans blowfly 10, 11. L'essai CAFE a permis de mesurer directement la consommation de nourriture chez Drosophila melanogaster. Dans ce système de test de comportement, les mouches se nourrissent d'aliments liquides fournis dans des capillaires en verre graduées placées à l'intérieur d'un flacon. Le déclin du ménisque capillaire indique une perte de solution alimentaire par évaporation et de la consommation alimentaire. La détermination du taux d'évaporation par des flacons sans mouches permet la quantification précise de la prise alimentaire.

Le dosage de CAFE est l' un de plusieurs paradigmes comportementaux utilisés pour mesurer l' alimentation chez Drosophila melanogaster et les chercheurs doivent choisir le plus approprié pour leur proprequestion. La décision d'utiliser un certain dosage doit tenir compte des points suivants: la nature de la nourriture fournie; l'état d'alimentation; la mesure de la consommation ou de l'absorption des nutriments et l'enquête de la consommation alimentaire ou de la réponse à la nourriture.

L'essai de CAFE tel que décrit dans le présent rapport est idéal pour suivre l'apport alimentaire d'une source de nourriture liquide sous une condition d'alimentation verticale. En variante, l'apport alimentaire peut être mesurée pour un groupe de mouche sur une source d'alimentation colorée dans un flacon ou dans une assiette. Les mouches sont normalement tuées ou anesthésiés après le repas et la quantité de colorant ingéré est déterminée par spectrométrie ou une inspection visuelle de l'abdomen teinté. Les mouches commencent à excréter la nourriture ingérée seulement 30 min après l' ingestion, par conséquent , cette approche est difficile à utiliser pour l'analyse de l' alimentation continue plus les comportements 12, 13.

A l'opposé les mouches sont conservés intacts lors de colorant absorbables avec des traceurs radioactifs sont utilisés et leur consommation de radioisotopes est marqué dans un compteur à scintillation 14, 15. L'absorption du radiomarqueur par le système digestif mouche rend la mesure de la prise alimentaire à long terme possible, mais pourrait conduire à une sous-estimation de la consommation en raison des molécules non absorbées et excrétées traceurs. Une autre approche pour mesurer la réponse à l' alimentation dans Drosophila melanogaster est la réponse proboscis d'extension (PER), qui se produit normalement pour la prise alimentaire 16. Cette méthode élégante mesure la réponse initiale à un stimulus alimentaire, mais ne comptabilise pas la quantité d'admission. L' apport alimentaire est ajustée de façon dynamique lors de l' alimentation en utilisant plusieurs signaux de rétroaction post-digestifs qui sont essentiels pour la régulation de l' alimentation 17, 18. Plusieurs tentatives ont été faites ces dernières années pour la collecte des données semi automatisent dans le dosage PAR 19, 20. Le PER est détectée par un plot électrique ou une combinaison d'électrodes et comptées par ordinateur. La combinaison de l'essai PER avec radioisotope absorption a révélé que cette analyse est limitée par une faible sensibilité à la détection de différences quantité d'alimentation 18. Le dosage d'alimentation manuelle (Mafe) 21, dans lequel une mouche est introduite manuellement à l' aide d' un capillaire en verre, a récemment été développé pour mesurer l' absorption alimentaire chez une mouche immobilisée. Le dosage MAFE élimine les interférences de la recherche de nourriture et d'alimentation d'initiation et a une résolution temporelle de secondes, et le début du PER et de la consommation alimentaire peut être contrôlée indépendamment dans le dosage. Cependant, la façon dont l' immobilisation de la mouche sur certains aspects du comportement alimentaire (par exemple , la locomotion, la motivation) doit encore être étudiée. Pour d' excellentes critiques comparatifs des différents tests de mesure de la consommation alimentaire chez la drosophile melanogaster et pour aider les chercheurs à trouver la plus appropriée, voir les rapports de Deshpande et Marx 13, 22.

L'essai CAFE évite certains des inconvénients des autres dosages décrits ci-dessus et combine la simplicité d'utilisation avec une mesure fiable de la prise alimentaire. Ici, une description détaillée de l'essai CAFE est fourni et nous montrent une modification de configuration simple pour réduire l'évaporation. Les résultats représentatifs, y compris un choix dosage deux aliments (à court et à long terme) et l'absorption du saccharose de mouches est démontrée. Dans la discussion que nous comparons notre méthode décrite avec d'autres moyens pour effectuer le test de CAFE, et mettre en évidence les limites potentielles.

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Protocol

1. Le dosage de CAFE

NOTE: Le test se compose de trois éléments: un flacon expérimental, un couvercle spécifique et capillaires micro. Une boîte en plastique avec couvercle est utilisé pour transporter les flacons préparés et de contrôler l'humidité plus efficacement.

  1. Utiliser un flacon de culture de Drosophila melanogaster en plastique ( en option 8 cm de hauteur, 3,3 cm de diamètre) en tant que tube pour l'essai.
  2. Sceller le flacon avec un couvercle en plexiglas manufacturé contenant un joint torique (Figures 1A, 1B). Charge vole en tapotant ou avec un chalumeau à travers l'ouverture du couvercle central (0,9 cm de diamètre), ce qui permet également pour la circulation de l'air et de l'approvisionnement en eau, et fermer le trou avec un bouchon en éponge. Six ouvertures coniques plus petits (0,4 cm de diamètre supérieur, 0,3 cm de diamètre intérieur) entourent le trou central et le montage des embouts de pipette de 2-20 volume de pi pour maintenir les capillaires en place. (Voir les chiffres supplémentaires pour les détails techniques du couvercle.)
    NOTE: L'utilisationd'un bouchon d'éponge avec des ouvertures pour les capillaires à la place du couvercle sur mesure utilisé dans notre manuscrit est possible. Notre couvercle personnalisé permet une manipulation sûre des flacons préparés en minimisant le risque de capillaires tomber.
  3. Pour présenter la nourriture liquide, utiliser 5 microcapillaires uL avec 1 marque uL. Positionner les capillaires dans les ouvertures coniques dans le couvercle en coupant la partie supérieure d'un 2 - pointe 20 pi de pipette et insérer la pointe dans le trou (figure 1B, marqué avec le bord rouge). Pour empêcher les mouches de s'échapper, insérer un 2 uncut - 20 pi pointe de la pipette dans la même ouverture.
  4. Pour gérer en toute sécurité des flacons préparés, placez - les dans une boîte en plastique avec un insert maillé (figure 2A).

2. Préparation des Mouches

  1. Gardez les mouches sur la nourriture standard à 25 ° C, 60% d'humidité relative et un cycle de lumière-obscurité / 12 h 12 h.
  2. Pour contrôler les conditions d'élevage, d'introduire 35 femelles vierges uned 15 mâles pour chaque groupe expérimental, dans un flacon de culture en matière plastique (9,8 cm de hauteur, 4,8 cm de diamètre) contenant 50 ml mouche alimentaire. Permettre aux mouches pondent des œufs pour les 3 premiers jours, puis transférer les mouches adultes dans des flacons de produits frais et de les laisser pondre pendant deux jours. Après cette répéter le transfert. adulte Jeter vole au bout de 2 jours.
  3. Comme l' apport alimentaire dépend de la taille de la mouche, déterminer le poids d'un groupe de 100 mouches par anesthésier 2 à 3 jours d'âge adulte vole en utilisant un tampon de mouche CO 2 et les recueillir dans un tube en plastique de 1,5 mL et mesurer avec une norme échelle du laboratoire. Déterminer le poids humide d'au moins quatre groupes de mouches indépendants classés par sexe (tableau 1); utiliser le poids pour calculer pi la consommation alimentaire par mouche mg. Utilisez la valeur pour déterminer la quantité de nourriture qu'une seule mouche se nourrit par expérience et d'ajuster le nombre de capillaires alimentaires remplis en conséquence pour éviter la vidange des capillaires par l'alimentation.
    1. Pour un 3 h test, l'utilisation20 mouches et les deux capillaires remplis. Pour une expérience à long terme (> 3 h et jusqu'à 9 jours), utiliser un groupe de huit mouches avec un approvisionnement de quatre capillaires remplis (des résultats fiables ne peuvent être obtenus avec moins de huit mouches dans les conditions décrites).
  4. Mouches séparés en groupes (8 ou 20 mouches) après la mesure du poids sous CO 2 exposition. Transférer le groupe à un nouveau flacon alimentaire (contenant 15 mL alimentaire standard) pour permettre la récupération du CO 2 sédation pendant 48 h avant l'expérience. Utilisez 4 à 6 jours d'âge des mouches pour le dosage de CAFE.
  5. Comme les mouches non-affamés de type sauvage ne se nourrissent que marginalement 19, 21, pré-mourir de faim vole pour des expériences d'alimentation 3 h. Pas de jeûne est nécessaire lorsque la consommation alimentaire est surveillée pendant plusieurs jours. Pour le jeûne, le transfert vole 16 à 20 h avant le test en les tapotant doucement dans un flacon contenant seulement un diamètre plié papier filtre de 45 mm humidifié avec ~ 0,5 ml ddH2 O (double eau distillée), et fermer avec un couvercle de dosage de CAFE branché.

3. Préparation des aliments liquides

  1. Préparer un 3 M (10%, p / v) solution de saccharose stock en remplissant 102,6 g de saccharose (C 12 H 22 O 11) à 100 mL ddH 2 O. Pipette 3 pi, 33 pi, 333 pi, 3,3 mL et 6,6 mL de la solution mère dans un tube en plastique de 15 ml; ajouter 2 mL de colorant alimentaire (pour le rouge: cochenille [E124]; pour le bleu: indigo carmin [E132]) et compléter à 10 ml avec ddH 2 O. Les concentrations obtenues sont 0,001, 0,01, 0,1, 1 et 2 M de saccharose .
    NOTE: Le colorant alimentaire permet de visualiser le ménisque plus facilement. Cependant, le colorant peut avoir une incidence sur la consommation de nourriture. Afin d'éviter un biais dû au colorant distribuer le colorant alimentaire ou aléatoire l'utilisation des colorants pour les échantillons de produits alimentaires au cours de l'expérience et les groupes.
  2. Pour tester la pipette de préférence d'alcool 333 pl de la solution mère de 3 M de saccharose dans un tube de 15 ml en plastique.Ajouter 1,5 ml (2,3 ml) de 100% EtOH (éthanol) et ajouter ddH 2 O jusqu'à 10 ml pour aboutir à 15% (0,25 mM) et 23% (0,39 mM) de solutions de travail.
  3. Gardez des solutions mères à -20 ° C et des solutions de travail à 4 ° C; utiliser dans 1 semaine.
  4. Remplir jusqu'à 10 capillaires en même temps avec une solution alimentaire colorée, par une force capillaire. Insérer les extrémités des capillaires dans la solution de saccharose (en maintenant les capillaires à un angle par rapport à la solution à 45 °). Arrêtez si le liquide atteint le sommet (5 pi) marque du capillaire, et enlever l'excès de solution à l'extérieur et à l'intérieur avec du papier de soie.

4. Montage et réalisation du test capillaire Feeder

  1. Si le jeûne est pas nécessaire, transférer les mouches expérimentales à l'essai en tapotant ou en chalumeau. Assurez-vous d'inclure trois flacons de contrôle sans mouches pour quantifier l'évaporation.
  2. Retirez délicatement une pointe de pipette (2-20 en volume pi) qui ferme l'un des openin externegs, et insérez un capillaire en verre, en bas-end rempli d'abord. Fixer le capillaire en plaçant la pointe de la pipette de retour à côté du capillaire. Si plusieurs solutions alimentaires sont testées, répétez cette procédure en conséquence.
  3. Placez les extrémités du capillaire à l'intérieur de tous les flacons au même niveau pour éviter les biais qui pourraient se produire si les sources de nourriture étaient situés à des hauteurs différentes (3 - 4 cm du couvercle); garder une distance sur le papier filtre pour empêcher le capillaire de fuir en touchant accidentellement le papier filtre ou différentes viscosités de sources alimentaires.
  4. Etiqueter l'extrémité supérieure du liquide coloré en utilisant un stylo marqueur (marque début). Pour assurer les différents capillaires peuvent être identifiés, les étiqueter individuellement en utilisant un code de couleur ou d'une bande.
  5. Placez plusieurs dosages CAFE préparés dans une boîte en plastique avec incrustation maillées et transférer la boîte (figure 2A) à une position de sécurité dans des conditions de laboratoire ou dans un en température, clim lumière et humidité contrôléeate chambre (paramètres: 25 ° C, humidité relative de 60%, le cycle lumière-obscurité / 12 h 12 h) pour la période expérimentale (par exemple 3 h ou jours).
  6. Comme papier filtre bas dessèche si le dosage est effectué sur plusieurs jours, appliquer de l' eau fraîche toutes les 24 h par l'éponge bonde (100 pi) pour maintenir constante l' humidité à l' intérieur du dosage. Utilisez quatre flacons séparés (8 cm de hauteur, 3,3 cm de diamètre) remplis de 30 ml ddH 2 O en tant que dispositifs d'humidité et de les placer à côté des essais CAFE dans la boîte en plastique. Utilisez un couvercle pour la boîte en plastique pour créer un environnement contrôlé d'humidité pendant l'expérience (figure 2A).
    REMARQUE: La variabilité plus large se produit dans des conditions de laboratoire; cependant, il est possible d'effectuer le test CAFE à la température ambiante (par ex., dans une classe). L'utilisation d'un dispositif d'humidification (papier filtre, avec ou sans une éponge humide bonde, rempli des flacons d'eau et le couvercle de la boîte en plastique) est fortement encouragée pour diminuer l'évaporation (
  7. Remplacez les capillaires avec ceux fraîchement remplis pour des expériences à long terme toutes les 24 h. Prenez note de mouches mortes avant chaque h intervalle de 24 et d'utiliser le nombre de mouches vivantes pour calculer la consommation par la mouche pour la période suivante. Jeter les vieux capillaires après la mesure de la baisse du ménisque (voir 5.1).
    NOTE: Au cours d'une expérience de 3 h, nous voyons guère de mouches mortes. Au cours d'une étude de 4 jours, nous trouvons habituellement 1 - 3 mouches mortes.
  8. A la fin de l'essai ou avant de remplacer le capillaire, marquer les ménisque inférieur du capillaire (marque de fin) avec un stylo marqueur tandis que le test de CAFE est toujours en position verticale. Jeter les données si marque de fin ne sont pas en dessous de la marque initiale (marque le début). Ne pas retirer le couvercle, car cela pourrait changer le ménisque.
  9. Retirez soigneusement les capillaires de l'essai et de les stocker pour la collecte de données. Vérifiez si le liquide à l'intérieur du capillaire a atteint l'extrémité inférieure sinon Discard les données, car la nourriture était pas accessible aux mouches. Recueillir tous les capillaires par flacon en tant que groupe. Insérez les embouts de pipette non coupés dans toutes les ouvertures pour empêcher les mouches de s'échapper. Démonter la configuration et laver les flacons, les couvercles et bouchons en éponge dans un bain de savon et sécher pendant la nuit à la température ambiante pour une utilisation ultérieure.
    NOTE: Les mouches peuvent être analysées plus loin après le dosage. Confirmer l'absorption de nourriture à l'oeil nu ou sous un microscope de dissection.
  10. Répéter les expériences avec les mêmes génotypes sur au moins trois jours différents.

5. Collecte et analyse des données

  1. Mesurer la distance entre la marque début et la fin marque sur le capillaire à l' aide d' un étrier ou une règle. Pour transférer des données directement à une feuille de calcul, utilisez un port USB (Universal Serial Bus) connecté étrier numérique (figure 1E). Jeter les capillaires après la mesure.
  2. Compte pour la taille capillaire pour calculer l'absorption ou l'évaporation des aliments. Par exemple, considérons un bouchonIllary qui est de 73 mm de long et contient de 5 pi d'une solution alimentaire. Une diminution de 14,6 mm dans le ménisque reflète l'absorption de 1 pi de solution. Calculer l'absorption d'aliments en utilisant la formule suivante:
    l'absorption d'aliments (pi) = distance mesurée (mm) / 14,6 mm
  3. Pour exclure l'effet de l'évaporation sur la prise alimentaire, calculer l'évaporation dans les trois (au minimum) des flacons de contrôle sans mouches signifie. Soustraire cette valeur moyenne de la valeur obtenue pour la consommation alimentaire des mouches.
  4. Utilisez la formule suivante pour déterminer la consommation totale par la mouche:
    La consommation alimentaire (pi) = (Food absorption [ul] - perte par évaporation [pi]) / nombre total de mouches dans le flacon. Pour long terme des expériences utilisent le nombre de mouches vivantes avant le début de l'intervalle de 24 h.
  5. Pour tenir compte des différences dans la taille du corps, comme entre les hommes et les mouches femelles, de normaliser la consommation alimentaire au poids corporel (ul alimentaire / fly mg).
  6. Utilisez un logiciel statistique pour l'analyse des données. Pour la normedonnées distribuées, allié T de -Tests utilisation de l' étudiant afin de déterminer les différences entre les deux groupes de mouches, et utilisent ANOVA (analyse de variance) avec les tests post hoc de Tukey Cramer pour plus de deux groupes. Dans une situation de choix, d'analyser les différences de choix aléatoire en utilisant un nonparametric un échantillon signe test.

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Representative Results

Les mouches du génotype w 1118 sont utilisés pour démontrer comment le dosage est effectué. Les mutants w 1118 sont couramment utilisés pour générer des lignées transgéniques et pour contrôler l'arrière - plan génétique de transgènes marqué avec le gène blanc. Normalement, pour des expériences comportementales, toutes les lignées transgéniques sont rétrocroisement depuis cinq générations à la même w 1.118 actions, qui est utilisé comme un contrôle expérimental. Nous montrons différentes expériences: une comparaison de la perte d'évaporation pour notre configuration modifiée, une expérience de choix alimentaire à court terme, une expérience de la prise alimentaire à long terme, et une expérience sur différentes dilutions de saccharose.

L'évaporation joue un rôle essentiel dans la performance du test CAFE. Nous avons inclus des approches supplémentaires à notre test pour diminuer l'évaporation: i) l'éponge bonde centrale est rempli d'eau toutes les 24 h; ii) addieau inter- flacons au sein de la boîte de transport et iii) l'utilisation d'un couvercle rempli pour la boîte pour créer une enceinte d'humidité (voir 4.6). On compare l'évaporation entre une configuration sans et avec des dispositifs mentionnés ci-dessus, une réduction significative de l'évaporation est visible. Même l'effet de la volatilité plus élevée d'une solution d'éthanol contenant est non détectable en utilisant la nouvelle configuration.

Dans une expérience alimentaire à deux choix un groupe de 20 mouches peut nourrir pendant 3 h. Dans les milieux naturels, les mouches des fruits se nourrissent de préférence sur la fermentation de fruits avec de l' alcool 22, et il a été montré, en utilisant une configuration similaire, que les mouches préfèrent les solutions de levure et de saccharose avec de l' éthanol par rapport aux solutions de levure et de saccharose sans éthanol 23. Ici, deux choix alimentaires sont proposés, une solution 0,1 M de saccharose marqué avec un colorant alimentaire rouge et une solution 0,1 M de saccharose à 15% de EtOH marquée avec du bleu de colorant alimentaire (figure 1A, C). visuel examination de l'abdomen indique que les mouches se nourrissent sur les deux solutions (figure 1D). La consommation alimentaire par la mouche est significativement plus élevée (près de 2 fois) pour la solution de saccharose contenant EtOH (figure 3A).

Dans une expérience suivante, une étude à long terme, un groupe de huit mouches a accès à des sources d'alimentation similaires pendant 4 jours, et les mouches consomment plus de la nourriture contenant de l' éthanol, chaque jour (figure 3B). L'indice de préférence pour l' éthanol ([Suc + EtOH] - [Suc] / consommation totale) reste constante au cours de cette période (moyenne = 0,29, tableau 4). La préférence de l' éthanol observée est compatible avec plusieurs autres publications et montre que les mouches peuvent distinguer entre les différentes sources alimentaires 24, 25, 26. L'attraction de l'éthanol observée pourrait être le résultat des différentes teneurs en calories deles solutions proposées et des propriétés gratifiants de l' éthanol 24. Le dosage peut également être utilisé pour mesurer les effets négatifs des compléments alimentaires. Ja et ses collègues ont montré dans la première publication de cette méthode que l' application de paraquat (un médicament oxydant) diminue la consommation alimentaire 10.

Dans l'expérience suivante, la différence entre l'apport alimentaire entre les sexes est représenté. Exigences métaboliques diffèrent entre mâle et femelle D. melanogaster. Par exemple, alors que les mouches mâles préfèrent les aliments riches en glucides, lors de la production d'œufs, une phase qui nécessite une augmentation de la biosynthèse des protéines, les femelles préfèrent les régimes alimentaires riches en protéines sur les régimes riches en glucides 27. mâle Accouplé et mouches femelles ont été utilisés dans cette expérience. D'analyser les différences dans l'apport alimentaire entre 20 mâles et 20 mouches femelles dans un intervalle d'alimentation de 3 heures, un dosage de CAFE est effectuée en utilisant une concent saccharosesérie de rationnement. Cinq capillaires ont été prévus, avec des solutions allant de 10 - 3 à 2 M de saccharose, et de la consommation de chaque solution a été mesurée (figure 4A). Les résultats ont montré que les deux sexes ont préféré les solutions de saccharose à haute concentration en tant que source de nourriture (figure 4A). Toutefois, les femmes consommaient significativement plus de deux solutions de saccharose plus faible concentration par rapport aux hommes (P <0,05); d'autre part, les mâles ont consommé nettement plus des solutions à concentration plus élevée (P <0,001). Notez que ces données ne tiennent pas compte des différences dans la taille du corps. Femme D. melanogaster sont généralement plus grands et plus lourds que les hommes (tableau 1). Lorsque la consommation alimentaire est normalisée pour voler de masse, les différences entre les hommes et les femmes dans la consommation de solutions à faible saccharose ne sont plus significatives. En résumé, les mâles consomment une solution de saccharose plus de femelles fécondées, compatibles avec les données précédentes, reflète possibles différents besoins métaboliques, les préférences d'éléments nutritifs ou de simples différences dans la capacité à se nourrir sur les capillaires entre les deux sexes.

Figure 1
Figure 1: La Drosophila melanogaster Capillaire Feeder Assay. A) Le test d'alimentation avec des mouches. papier filtre humecté fournit de l'eau au fond du flacon. Quatre capillaires sont fournis lors de l'expérience (alimentaire rouge- et de couleur bleue dans les capillaires opposés). Notez que les capillaires sont fixés en position par une deuxième pointe de la pipette, et les positions non utilisées sont fermées à l'aide des embouts de pipette. Un bouchon de mousse dans le centre du couvercle permet un échange d'air. B) Vue détaillée du couvercle. Coupez les pointes des pipettes (2-20 uL, bordures rouges) sont insérés dans les ouvertures coniques des positions non utilisées, et une seconde pipointe pette est inséré dans la pointe de coupe pour fermer le trou. Les embouts de pipette de coupe sont utilisés pour contrôler le placement des microcapillaires et des conseils non coupés sont utilisés pour maintenir les capillaires serrés. C) A melanogaster mouche D. se nourrit d'un capillaire. D) Après l' alimentation, la couleur des aliments est clairement visible dans l'abdomen de la mouche. E) Un compas numérique est utilisé pour mesurer la distance entre la marque de début et de marquer la fin du ménisque. Les données sont transférées directement à une feuille de calcul Excel via USB. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Influence de l' évaporation dans le Capillaire Feeder Assay. A) dosage multiple CAFE placé à l' intérieurune boîte en plastique avec une incrustation quadrillée. Pour le contrôle de l'humidité au cours des quatre flacons remplis d'eau d'expérimentation (jantes rouges) sont placés à l'intérieur de la grille. Les commandes d'évaporation sont placés à proximité immédiate de ces flacons. Une couverture pour l'ensemble de l'installation est représentée en arrière-plan. B) La comparaison de la perte de volume par évaporation. La valeur moyenne pour l'évaporation sur 4 jours est affiché. L'humidité est contrôlée par (i) appliquer l'eau à la bonde d'épongé centrale (24 h d'intervalle); (Ii) l'ajout de quatre flacons remplis d'eau dans le réseau; et (iii) à l'aide d'un couvercle en plastique pour l'ensemble de l'installation. L'évaporation est nettement plus faible si l' humidité est contrôlée pour les deux solutions testées (*** P ≤ 0,001; N = 48). Aucune différence de volatilité entre l'EtOH contenant ou non contenant une solution de saccharose est détectable avec les dispositifs d'humidité utilisé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grandecette figure.

figure 3
Figure 3: La préférence pour l' éthanol (EtOH) contenant du saccharose sur sucrose Solution. A) La consommation d'aliments pour les hommes w 1118 mouches est montré. Les mâles consomment beaucoup plus d'un EtOH à 15% contenant une solution de saccharose à une solution de saccharose ordinaire. *** P ≤ 0,001; N = 27. B) Flies préfèrent nettement une solution de saccharose contenant 23% EtOH pendant un essai de 4 jours. *** P ≤ 0,001; ** P ≤ 0,01; N = 16. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Consommation (pl / mouche et pl / fly mg) de différentes concentrations de sucrose par mâle et femelle w 1118 Flies. A) La consommation de différentes concentrations de solutions de saccharose diffère significativement entre les mâles et les femelles. Les mouches femelles consomment plus à des concentrations de saccharose inférieurs, et les mouches mâles consomment plus à des concentrations plus élevées. * P <0,05; *** P <0,001; N = 27 essais avec 20 hommes chacun, N = 30 essais avec 20 femelles chacun). B) l' absorption des aliments sur une base de masse. Une augmentation significative de la consommation se produit entre les hommes et les mouches femelles pour les solutions de 0,1 à 2 M de saccharose lorsque normalisé pour voler de masse. *** P ≤ 0,001; N = 27 hommes, N = 30 femelles. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1
Tableau 1: Poids du mâle et femelle w 1118 Flies. Quatre à cinq groupes de 100 mouches ont été mesurées et le poids corporel (mg / vol) a été calculée. Les valeurs moyennes (avec STDEV (écart-type) et STERROR (erreur standard)) sont présentés. Les valeurs moyennes sont utilisées pour normaliser la consommation de nourriture pour voler de masse (ul / mg mouche). S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger cette feuille de calcul.

Tableau 2
Tableau 2: Perte d'évaporation (pi) dans le CAFE Assay. La quantité de liquide perdue par évaporation est montré pendant 4 jours. L'humidité est contrôlée (+) ou nont (-) , comme décrit dans la figure 2. données d'évaporation pour deux solutions différentes (saccharose et de saccharose, plus EtOH) sont présentés. Les valeurs moyennes sont présentées pour chaque jour et sur la période (avec ECARTYPE et STERROR). La perte de l'expérience des dilutions de saccharose d'évaporation est représenté sous séparément (valeurs moyennes). S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger cette feuille de calcul.

Tableau 3
Tableau 3: Consommation de 0,1 M de sucrose avec / sans 15% EtOH par Male w 1118 Flies Fed pendant 3 h. La consommation de ces deux solutions par groupes de 20 mouches a été mesurée pendant 3 h sur 3 jours. Valeurs de consommation pour les groupes de mouches sont divisés par le nombre de mouches testées pour estimer l'absorption microlitres par mouche après avoir soustrait les pertes par évaporation. Les valeurs moyennes (avec ECARTYPE et STERROR) sont présentés. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger cette feuille de calcul.

tableau 4
Tableau 4: Consommation de 0,1 M de sucrose avec et sans 23% EtOH pendant quatre jours par Male w 1118 Flies. La consommation de ces deux solutions par groupes de 8 mouches a été mesurée pendant 24 h pendant 4 jours. indice de préférence pour l'éthanol a été calculé en utilisant la formule suivante ([Suc + EtOH] - [Suc] / consommation totale). Valeurs de consommation pour les groupes de mouches sont divisés par le nombre de mouches testées pour estimer uL absorption par la mouche après soustraction de la perte par évaporation. Les valeurs moyennes (avec ECARTYPE et STERROR) sont indiqués pour chaque jour..jove.com / fichiers / ftp_upload / 55024 / JoVE55024R1-Diegelmann-Table-4.xlsx "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger cette feuille de calcul.

tableau 5
Tableau 5: Consommation de cinq concentrations de sucrose par Male and Female w 1118 Flies. L'apport de chaque solution, et la valeur de la somme des apports de saccharose, est représenté. Les valeurs moyennes pour chaque concentration sont donnés ci-dessous chaque colonne (avec ECARTYPE et STERROR). Pour calculer la consommation en fonction de la masse de la mouche (d'absorption microlitres par milligramme de mouche), la consommation alimentaire est divisé par le poids moyen des mouches mâles ou femelles (du tableau 1, montré à la droite). S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger cette feuille de calcul.

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Discussion

Le rapport décrit le dosage de CAFE dans un mode étape par étape, en se concentrant sur la configuration technique et sa performance réussie dans le laboratoire. En raison de sa simplicité, ce test pourrait également être utilisé éducatif comme une expérience scolaire. Les exemples montrent que le dosage permet d' étudier la détection de la nourriture, la préférence et la consommation dans Drosophila melanogaster sur de courtes périodes et plus longs (heures à quelques jours). L'essai de CAFE a été largement utilisé dans le domaine d'enquêter sur des sujets tels que l' alimentation et la consommation de drogues, la toxicomanie, l' homéostasie énergétique et le contrôle neuronal de l' alimentation 16, 18, 24, 25.

Dans l'essai de CAFE, les mouches expérimentales doivent réussir effectuer plusieurs tâches pour obtenir de la nourriture, tels que la recherche de nourriture, de détection et de la locomotion; incapacité à effectuer ces tâches pourrait entraîner une consommation réduite. Pourcomportement au vieillissement dépend principalement de l'état de vol de la faim et peut être augmentée par le jeûne 19, 21. Sensing, et ainsi la localisation, de la source alimentaire peuvent être influencées par la capacité de la mouche à l' odorat ou le goût et pourrait indirectement entraîner un taux de baisse de la consommation 28. L'affichage de la nourriture à la fin d'un capillaire force la mouche à descendre et activement se tenir dans une position de tête en bas pour se nourrir. Pour maintenir la position de boire sur le capillaire, la mouche doit coordonner sa contraction musculaire. Dépréciation ou l'hyperactivité de la locomotion seraient clairement une incidence sur l'absorption des aliments, comme les carences de locomotion dues au vieillissement. En outre, l'interférence par d'autres mouches pendant cette manoeuvre conduit à l'arrêt prématuré de l'ingestion d'aliments. Par conséquent, le nombre de mouches à utiliser doit être déterminée avant l'expérience. Ce nombre doit veiller à ce que toutes les mouches peuvent se nourrir correctement et doit contrôler pour fdensité ly dans le flacon (de 8 à un maximum de 20 mouches dans notre D. melanogaster CAFE dosage flacon). L' alimentation est influencée par la valeur nutritive du repas, et les mouches ajuster dynamiquement leur ingestion en conséquence 24, 29. Il a été montré que les mutants manquants du octopamine neurotransmetteur ont des scores de réponse de PER normales , mais en même temps montrent une diminution significative de l'apport alimentaire 14. En outre, lors de l'alimentation, la motivation pour continuer à manger diminue et conduit à la cessation du comportement.

Les considérations qui précèdent sont applicables non seulement à l'essai de CAFE, ils influencent le comportement mesuré dans d'autres systèmes de test et l'alimentation. Par conséquent, la capacité de vol pour réaliser le dosage doit être pris en compte lors de la mesure de la prise alimentaire. Bien qu'il ne soit pas techniquement difficile, le dosage de CAFE présente quelques inconvénients pratiques potentielles. La baisse du ménisqueà l'intérieur du capillaire dépend de la perte par évaporation et la prise alimentaire des mouches. La forte évaporation est problématique en ce qui concerne le rapport signal sur bruit et devrait donc être réduit au minimum. Nous avons appliqué plusieurs approches et des dispositifs supplémentaires pour contrôler l'humidité pendant la période expérimentale (voir 4.6). Ces accessoires nous ont permis de réduire l'évaporation des effets significativement et même éliminés de différentes volatilité des sources de nourriture que nous avons utilisées. Cependant, si aucune chambre climatique est disponible , le dosage peut être effectué à la température ambiante (par exemple dans une salle de classe) avec des valeurs plus élevées d'évaporation comme un inconvénient.

Comme il est mentionné dans le protocole, les extrémités des capillaires doivent être placés au même niveau à l'intérieur du flacon pour éviter un biais dans le choix de la volée en raison des différentes distances à la source de nourriture. Pour ce faire, la position du tube capillaire est fixé à une seconde extrémité de la pipette. La longueur du capillaire ne semble pas être un critère d'alimentation en sauvageType vole 10. Tout déversement du liquide peut nuire à la lecture précise de la consommation alimentaire (voir 4.3 et 4.9); un environnement exempt de vibrations empêche les déversements. Les particules dans le bloc de solution capillaire flux et de prévenir la consommation de nourriture. La solution alimentaire, surtout si elle contient de la levure, doit être complètement dissous pour éviter un tel blocage. L'utilisation d'un extrait de levure soluble dans l'eau peut surmonter ce problème, mais en tant que source de nutrition incomplète, il peut entraîner des frais de conditionnement supplémentaires. l'accessibilité alimentaire doit être évaluée avant et après l'expérience. Les seules données de vol qui doivent être inclus dans l'analyse est celle obtenue lorsque l'accès à la nourriture était présent pendant toute l'expérience (voir 4.9). La position d'alimentation à l'envers est une caractéristique essentielle de l'expérience. Dans des conditions naturelles, cette position d'alimentation ne sont pas familiers à la volée, les fruits pendent des arbres et ils pourraient descendre un fruit pourri. Ceci est soutenu par des expériences comparation des tailles de repas de mouches se nourrissent dans une position à l'envers dans l'essai de CAFE (i) une position de l' alimentation horizontale de mouches immobilisés dans l'essai de MAFE et (ii) une droite-up position d' alimentation à l' aide alimentaire radiomarqué 13, 21 . Bien que l'affichage de la nourriture à l'envers ne semble pas être un problème pour les mouches, il pourrait affecter la composition de la nourriture à l'intérieur du capillaire. des suppléments en suspension telles que des cellules de levure peut couler par gravité vers le fond du capillaire et donc susceptible d'être plus concentrée au fond ou pourrait boucher le capillaire. Cela influence sur le comportement de la mouche et donc les résultats. Faire en sorte que les composants de la solution d'alimentation sont complètement dissous, et l'introduction de nouveaux capillaires fréquemment au cours des expériences à long terme, minimise cette influence sur la prise alimentaire.

L'utilisation du test de CAFE décrit ici permet de mesurer la consommation de nourriture dans un groupe de mouche au fil du temps couvre desdes heures ou des jours. Si une analyse plus détaillée est nécessaire (par exemple., Le comportement d'une seule mouche ou de comportement dans la plage de minutes), d' autres essais d'alimentation, tels que le dosage MAFE, sont plus appropriés. Il serait peut - être possible pour le nombre de mouches à être encore réduite en utilisant un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml et un seul capillaire 30.

Le nombre d'essais utilisés pour obtenir les résultats représentatifs varie de 15 à 27, en accord avec les expériences décrites dans la littérature , 17, 24. Le dosage peut être réalisé de façon classique aveugler qui exclut la possibilité de biais de l'expérimentateur, et il est normalement répété au moins quatre à cinq fois sur chacune de plusieurs jours. Les données obtenues avec le dosage CAFE peuvent être normalisées au poids corporel pour tenir compte des différences dans le comportement alimentaire liée à la taille du corps. Les résultats obtenus avec cet essai sont robustes et reproductible, de sorte quea été introduit avec succès dans des cours pratiques pour les étudiants diplômés.

Le test de CAFE est largement utilisé dans le domaine de la recherche métabolique et de goût dans Drosophila melanogaster; il a de multiples applications en testant le rôle des compléments alimentaires et / ou de la drogue sur le comportement alimentaire, et il peut être utilisé pour étudier la réponse de dose à une source alimentaire spécifique 24. En combinaison avec la remarquable variété de techniques utilisées pour manipuler des circuits neuronaux dans D. melanogaster, ce test permet également aux chercheurs d'étudier le rôle des systèmes de renforcement sur le comportement alimentaire 12, 17, 18.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vials (breeding) Greiner Bio-One 960177 www.greinerbioone.com
Vials (CAFE assay) Greiner Bio-One 217101 www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assay Workshop – –
Plastic box, low wall Plastime 353 www.plastime.it
Cover for the plastic box Workshop – –
Capillaries BLAUBRAND  REF 7087 07 www.brand.de
Pipette tips Greiner Bio-One 771290 www.greinerbioone.com
Filter paper circles Whatman 10 311 804 www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sucrose AppliChem 57-50-1 www.applichem.com
Ethanol absolute VWR Chemicals 20,821,330 www.vwr.com
Food color (red, E124) Backfun 10027 www.backfun.de
Food color (blue, E133) Backfun 10030 www.backfun.de
Soap solution (CVK 8) CVH 103220 www.cvh.de
Digital caliper GARANT 412,616 www.hoffmann-group.com
Vials (breeding) Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm 
Vials (CAFE assay) Height 8 cm, diameter 3.3 cm
Lid-CAFE assay Produced in university workshop, technical drawing supplied
Please click here to download this file.
Plastic box, low wall A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions 
Cover for the plastic box Dimensions (37 x 29 x 18 cm)
Capillaries DIN ISO 7550 norm,  IVD-guideline 98/79 EG, ends polished
Pipette tips Pipettes for the outer circle are cut according to the lid
Filter paper circles 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used
D(+)-Sucrose Not harmful
Ethanol absolute Highly flammable liquid and vapor
Food color (red, E124) Not stated
Food color (blue, E133) Not stated
Soap solution (CVK 8) Odor neutral soap
Digital caliper
Standard fly food (for 20 L)
Agar 160 g
Brewer's Yeast 299.33 g
Cornmeal 1,200 g
Molasses 1.6 L
Propionic acid 57.3 mL
Nipagin 30% 160 mL

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References

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