Introduction
Yeme gereklidir; Bununla birlikte, bulimia, anoreksia ve kıldığını aşın yemesine genel eğilim gibi yeme bozuklukları ile sonuçlanır gıda alımının deregülasyonu bireyler ve toplum, 1, 2, 3 maliyeti. Bu araştırmanın amacı, gıda alımının düzenleyici mekanizmaların ortaya çıkarmak ve bozukluk oluşumunu engellemeyi için bir strateji sağlamaktır. Memeli model organizmalar kullanarak çok sayıda çalışmalar bozuklukları 4, 5, 6 yeme devresi ve sinyal sistemlerinin rolünün yeni anlayışlar sağladı. Bununla birlikte, bu bozuklukların altında yatan nöronal ve moleküler üsleri bilgimiz tam uzaktır. Son yıllarda, meyve Drosophila melanogaster metabolis düzenlenmesi, temel mekanik anlayışlar çözülüyor için değerli bir model sistem haline gelmiştir uçmakm 7, 8, 9. Drosophila melanogaster için kılcal besleyici (CAFE) deneyi blowfly 10, 11 DETHIER tarafından daha önceki bir çalışmadan esinlenerek 2007 yılında Seymour Benzer'in laboratuarda kurulmuştur. CAFE tahlil mümkün doğrudan Drosophila melanogaster gıda alımını ölçmek için yapılan. Bu davranışsal test sistemi, sinekler, bir şişeye içine yerleştirilen kademeli cam kılcal sağlanan sıvı gıdalarla beslenmesidir. Kılcal menisküsün düşüş buharlaşma ve gıda tüketimi yoluyla gıda çözümünün kaybını gösterir. sinekler olmadan şişeleri ile buharlaşma hızının belirlenmesi gıda alımının doğru ölçümü sağlar.
CAFE tahlil Drosophila melanogaster beslenme ölçmek için kullanılan çeşitli davranışsal paradigmalar biridir ve araştırmacılar kendi özel için en uygun olanı seçmek zorundasoru. Aşağıdaki noktaları göz önünde belirli bir tahlil kullanma kararı: sağlanan gıda doğasını; beslenme durumu; alımı veya besin alımı ve soruşturma gıda tüketimi veya gıda tepki ölçümü.
Bu raporda açıklanan şekilde CAFE tahlil dik besleme koşullarında bir sıvı gıda kaynağının gıda alımını takip için idealdir. Seçenek olarak gıda alımı, bir şişe içinde ya da plaka üzerinde renkli bir besin kaynağı bir uçucu grup için ölçülebilir. Sinekler normalde öldürülmüş ya da anestezi beslendikten sonra ve yutulur boya miktarı spektrometresi veya lekeli karın görsel muayene ile belirlenir edilir. Sinekler sadece 30 dk alımından sonra yutulur gıda salgılanmasını başlatmak, bu nedenle bu yaklaşım, sürekli uzun beslenme analizi için kullanımının zor 13, 12 davranışlar.
Buna karşılık sinekler zaman emilebilir boya bozulmadan tutulurRadyoaktif işaretleyicilerle s kullanılmış ve radyoizotopun tüketim bir parıldama sayacı 14, 15 puanlanmıştır. sinek sindirim sistemi tarafından radyoaktif emilimi uzun vadeli gıda alımı ölçümü mümkün kılan, ancak çünkü olmayan emilir ve atılır izleyici moleküllerinin tüketim küçümsemeye yol açabilir. Başka bir yaklaşım melanogaster normalde gıda alımının 16 oluşur hortum uzatma yanıtı (PER) 'dir Drosophilia'daki gıda tepkisini ölçmek için. Bu zarif yöntem bir gıda uyarana ilk tepkiyi ölçen ama alımının miktarını yazmaz. Gıda alımı dinamik besleme 17, 18 düzenlenmesi için önemli olan birkaç post-sindirim geribildirim sinyallerini kullanarak beslenme sırasında ayarlanır. Birçok deneme başına deneyinde yarı otomatikleştirmek veri toplama son yıllarda yapılmış
CAFE deneyi, yukarıda tarif edilen diğer deneylerden dezavantajlarının bazılarının önler ve gıda alımının güvenilir ölçümler ile kullanım sadeliği birleştirir. Burada, CAFE tahlilinde ayrıntılı bir açıklaması temin edilmiştir ve buharlaşmayı azaltmak için basit bir ayar değişikliği göstermektedir. İki gıda seçimi deneyi (kısa ve uzun vadeli) ve sineklerin sakaroz alımı da dahil olmak üzere Temsilcisi sonuçlar gösterilmiştir. tartışmada biz CAFE tahlil gerçekleştirmek ve potansiyel sınırlamaları vurgulamak için alternatif yollar ile tarif edilen yöntem karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. CAFE Deneyi
NOT: Bir deney şişesi, belirli bir kapak ve mikro kılcal: deney üç bileşenden oluşur. kapaklı bir plastik kutu hazırlanan şişeleri taşımak için daha verimli bir şekilde nem kontrol etmek için kullanılır.
- Tahlil için bir tüp gibi Drosophila melanogaster kültürü plastik şişe (isteğe 8 cm yükseklik, 3.3 cm çapında) kullanın.
- O-halkası (Şekil 1A, 1B) ihtiva eden bir imal pleksiglas kapaklı şişe contasına. Yük dokunarak veya ayrıca hava sirkülasyonu ve su temini sağlayan kapağın merkezi açıklık (0.9 cm çapında), üzerinden bir blowpipe ile uçar ve bir sünger tapa deliği kapatın. Altı küçük konik açıklıkları (0.4 cm üst çapı, 0.3 cm iç çapı) merkezi deliği çevreleyen ve 2 pipet uçları uygun - yerinde kılcal tutmak için 20 uL hacmi. (Kapağın teknik detaylar için ek şekillere bakınız.)
NOT: kullanımbunun yerine Metinde kullanılan ölçüye kapak kılcal açıklıklar ile bir sünger durdurucunun mümkündür. Bizim özel kapak capillaries düşme riskini en aza indirmek hazırlanan şişeleri güvenli kullanım sağlar. - Sıvı gıdalar sunmak için, 1 uL işaretleri ile 5 uL mikrokapilerler kullanın. Delik (kırmızı kenarı ile işaretlenmiş Şekil 1B) içine ucu 20 uL pipet ve ekleme - 2 üst keserek kapağındaki konik açıklıklar kılcal yerleştirin. Aynı ağzına 20 uL pipet - kaçmasını sinekler önlemek için, bir kesilmemiş 2 yerleştirin.
- Güvenli, çoklu hazırlanan şişeleri ele bir ızgarah kakma (Şekil 2A) ile bir plastik kutu içine koyun.
Sineklerin 2. Hazırlık
- 25 ° C,% 60 bağıl nem ve 12 saat / 12 saatlik aydınlık ve karanlık döngüsü standart gıda sinekler tutun.
- , Üreme koşullarını kontrol 35 bakire kadın tanıtmak için bir50 mL içeren plastik kültür şişenin içine her bir deney grubu d 15 erkek (9.8 cm yükseklik, 4.8 cm çapında) gıda sinek. sinekler sonra yetişkin taze gıda şişeleri uçar aktarmak ve onları iki gün daha yumurtalarını izin ilk 3 gün yumurtalarını bırakmak için izin verin. Bundan sonra tekrar transferi tekrarlayın. Iskarta yetişkin 2 gün daha sonra uçar.
- Gıda alımı uçucu büyüklüğüne bağlıdır gibi, 3 günlük bir yetişkine 2- anestezi 100 sinekler grubunun ağırlığını belirlemek CO2 uçucu takımını kullanarak ve bir 1.5 mL'lik bir plastik tüp içine toplanması ve standart ölçme sinekler laboratuar ölçekli. Seks (Tablo 1) olanlar en az dört bağımsız sinek gruplarının ıslak ağırlığını belirlemek; mg sinek başına uL gıda tüketimi hesaplamak için ağırlık kullanın. Tek bir sinek deney başına besleyen gıda miktarını belirlemek ve besleyerek kılcal damarların boşaltılmasını önlemek için buna göre gıda dolu kılcal damarların sayısını ayarlamak için değeri kullanın.
- 3 saatlik deney, kullanım için20 sinek ve iki dolu kapilerlere. uzun vadeli bir deney (> 3 saat ve en fazla 9 güne kadar) için, (güvenilir sonuçlar anlatılan koşullarda az sekiz sinekler elde edilemez) dört doldurulmuş kılcal damarların bir kaynağı ile sekiz sinekler bir grup kullanın.
- CO 2 maruz altında ağırlıkları ölçüldükten sonra gruplar (8 veya 20 sinekler) içine ayrı sinekler. CO2 sedasyon 48 saat deney öncesinde geri dönüşüne verecek şekilde (15 mL standart gıda ihtiva eden) yeni bir gıda şişeye grubu aktarın. CAFE tahlil için 4 ila 6 günlük bir sinekler kullanın.
- Olmayan aç vahşi tip sinekleri sadece marjinal besleme olarak 19, 21, ön açlıktan 3H beslenme deneyleri için gider. Gıda tüketimi birkaç gün içinde takip edildiğinde hiçbir açlık gereklidir. açlık transfer yavaşça ~ 0.5 mL GKD'li nemlendirilmiş sadece 45 mm çaplı filtre kağıdından ihtiva eden bir şişe içine dokunarak testten önce 16 ila 20 saat uçan2 O (distile su-double) ve bir takılı CAFE tahlil kapaklı yakın.
Sıvı Gıda 3. hazırlanması
- 100 mL GKD 2 O Pipet 3 uL, 33 uL, 333 uL, 3.3 mL ve 6.6 mL 102.6 gr sakaroz (Cı 12H 22 o 11) doldurarak (ağ / hac% 10), sakroz stok çözeltisi, 3 M hazırlanması 15 ml plastik tüp içine stok çözeltisi; 2 mL Gıda renk eklemek (kırmızı için: Cochineal [E124]; mavi: Indigo karmin [E132]) ve GKD 2 O. ile 10 ml doldurmak sonuçlanan konsantrasyonları 0.001, 0.01, 0.1, 1, ve 2 M sukroz vardır .
NOT: gıda boyası daha kolay menisküs görselleştirme sağlar. Ancak boya gıda alımı üzerinde bir etkiye sahip olabilir. boya, gıda boyası dağıtmak veya deney ve gruplar sırasında gıda numunelerine boyaların kullanımını randomize nedeniyle önyargı önlemek için. - Alkol tercih pipet için bir 15 ml plastik bir tüp içinde 3 M sukroz stok çözeltisi 333 uL test etmek için.% 100 EtOH (etanol), 1.5 mL (2.3 mL) ilave edilir ve% 15 (0.25 mM) ve% 23 (0.39 mM) çalışma çözeltileri neden 10 mL'ye GKD 2 O ekleyin.
- 4 ° C'de stok -20 ° C'de çözüm ve çalışma çözümleri tutun; 1 hafta içinde kullanın.
- kılcal zorla, renkli bir gıda solüsyonu ile aynı anda 10 kılcal doldurun. sakaroz çözeltisini (çözelti 45 ° açıyla kılcal tutarak) içine kılcal damarların uçlarını takın. Sıvı üst kılcal (5 uL) işareti ulaşırsa durdurun ve kağıt mendil ile dış ve iç aşırı çözüm kaldırmak.
4. Montaj ve kapiller Besleyici Testi Sahne
- oruç gerekli değilse, dokunarak ya da darbe-borusu ile tahlil deneysel sinekler aktarın. buharlaşmasını ölçmek için sinekler olmadan üç kontrol şişeleri dahil ettiğinizden emin olun.
- Dış openin birini kapatıyor - (20 uL hacmi 2) dikkatli bir pipet kaldırmakgs ve ilk bir dolu cam kapiller, dip-ucunu. geri ileri kılcal pipet koyarak kılcal sabitleyin. çeşitli gıda çözümleri test ediliyor ise, buna göre bu işlemi tekrarlayın.
- Yerleştirin kılcal besin kaynakları farklı yüksekliklerde bulunan sanki oluşabilir önyargı önlemek için aynı düzeydeki tüm şişeleri içinde biter (3 - kapaktan 4 cm); kaza filtre kağıtları veya gıda kaynaklarının farklı viskozitelere dokunarak sızmasını kılcal önlemek için filtre kağıdı için mesafe tutun.
- Bir işaretleyici kalem (başlangıç işareti) kullanarak renkli sıvının üst ucunu Etiket. Onları tek tek bir renk veya çizgili kodunu kullanarak etiket, farklı kılcal damarlar tespit edilebilir sağlamak.
- Gridlenmiş kakma bir plastik kutu içinde birden hazırlanan CAFE deneyleri yerleştirin ve laboratuar koşullarında veya ısıya, ışığa ve nem kontrollü clim güvenli bir konuma (Şekil 2A) kutusunu transferiDeney süresi (örneğin 3 saat veya gün): odacık (25 ° C,% 60 bağıl nem, 12 saat / 12 saat ışık-karanlık döngüsü parametreleri) yedi.
- Tahlil birkaç gün içinde yapılırsa alt filtre kağıdı kurur gibi, sünger tapa (100 uL) üzerinden 24 saatte tahlil içindeki nem sabit tutmak için tatlı su uygulayın. Nem cihazları gibi 30 ml GKD 2 O ile dolu dört ayrı şişeleri (8 cm yükseklik, 3.3 cm çapında) kullanın ve plastik kutu CAFE deneyleri yanında koyun. Deney (Şekil 2A) sırasında nem kontrollü bir ortam oluşturmak için plastik kutu için bir kapak kullanın.
NOT: Geniş değişkenlik laboratuar şartlarında oluşur; ancak, (bir sınıfta, örneğin.), oda sıcaklığında CAFE tahlil gerçekleştirmek için mümkündür. (Plastik kutu su şişeleri ve kapağı dolu ya da ıslak bir sünger tapa olmadan filtre kağıdı,) bir nemlendirme cihazının kullanımı son derece (buharlaşmayı azaltmak için teşvik edilmektedir- Uzun süreli deneylerde her 24 saat için taze doldurulmuş olanlarla kılcal değiştirin. Her 24 saat arayla önce ölü sinekler not edin ve bir sonraki dönem için sinek başına tüketimi hesaplamak için canlı sineklerin numarasını kullanabilirsiniz. menisküsün düşüş (5.1 bakınız) ölçüldükten sonra eski kılcal atın.
NOT: biz neredeyse hiç ölü sinekler bkz 3 saat Deney sırasında. 3 ölü sinekler - 4 gün çalışma sırasında biz genellikle 1 bulabilirsiniz.- CAFE tahlil dik konumda iken bu testin veya kılcal değiştirmeden önce sonunda, bir marker kalem ile kılcal (işareti sonu) alt menisküs işaretleyin. Işareti sonu (başlangıç işareti) ilk işaretinin altında değilse veri atın. Bu menisküs değişebilir olarak, kapağını çıkarmayın.
- Dikkatle testte kılcal damarları kaldırmak ve veri toplama için saklayın. Discar değilse kılcal içindeki sıvı alt ucunu ulaştı olmadığını kontrol edind veriler, gıda sinekler için erişilebilir değildi. Bir grup olarak şişe başına tüm kılcal toplayın. kaçmasını sinekler önlemek için tüm açıklıklar içine kesilmemiş pipet uçları takın. setup dağıtın ve daha sonra kullanılmak üzere oda sıcaklığında sabun banyosu kuru gece boyunca şişe, kapakları ve sünger tapalar yıkayın.
NOT: Sinekler ayrıca tahlil sonra analiz edilebilir. gözle veya bir diseksiyon mikroskobu altında gıda alımını onaylayın.- en az üç farklı günlerde aynı genotipleri ile tekrarlayın deneyler.
- Uzun süreli deneylerde her 24 saat için taze doldurulmuş olanlarla kılcal değiştirin. Her 24 saat arayla önce ölü sinekler not edin ve bir sonraki dönem için sinek başına tüketimi hesaplamak için canlı sineklerin numarasını kullanabilirsiniz. menisküsün düşüş (5.1 bakınız) ölçüldükten sonra eski kılcal atın.
5. Veri Toplama ve Analizi
- Bir kumpas veya cetvel kullanarak kapiller işareti başında ve işareti sonu arasındaki mesafeyi ölçün. Bir e-tabloya doğrudan veri aktarmak için, dijital kumpas (Şekil 1E) bağlı bir USB (Universal Serial Bus) kullanın. ölçümden sonra kılcal atın.
- kılcal boyutu için hesap gıda alımını veya buharlaşma hesaplamak için. Örneğin, bir kap dikkateUzun 73 mm ve gıda çözüm 5 mcL içeren Illary. menisküs bir 14.6 mm azalarak 1 uL solüsyonu alımını yansıtmaktadır. Aşağıdaki formülü kullanarak gıda alımını hesaplayın:
Gıda alımı (uL) = ölçülen mesafe (mm) / 14.6 mm - gıda alımı üzerindeki buharlaşma etkisini dışlamak için, sinekler olmadan üç (en azından) kontrol şişelerini buharlaşma ortalama hesaplamak. sinekler tarafından gıda tüketimi için elde edilen değerden bu ortalama değeri çıkartın.
- sinek başına toplam tüketim belirlemek için aşağıdaki formülü kullanın:
Gıda tüketimi (uL) = (Gıda alımı [ul] - Evaporatif kayıp [ul]) / flakon sineklerin toplam sayısı. uzun vadede deneyler 24 saat aralığının başlamadan önce canlı sineklerin numarasını kullanabilirsiniz. - Böyle erkek ve dişi sinekler arasında olduğu gibi vücut büyüklüğü farklılıkları, hesaba katılması için, vücut ağırlığı gıda tüketimi (ul yiyecek / mg sinek) normalleştirmek.
- Veri analizi için istatistiksel yazılım kullanın. normmüttefiki dağıtık veri, kullanım öğrencinin T-test, iki sinek gruplar arasındaki farklılıkları belirlemek ve ikiden fazla gruplar için post hoc Tukey Cramer testleri ile ANOVA (varyans analizi) kullanın. Bir seçim durumda, bir parametrik olmayan tek örnek işareti testi kullanılarak rastgele seçim farklılıkları analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
W 1118 genotip sinekler test yapılır göstermek için kullanılır. W 1118 mutantlan genellikle transjenik çizgiler üretmek ve transgenlerin genetik arka planı beyaz gen ile işaretlenmiş kontrol etmek için kullanılır. Normal olarak, davranış deneyler için, bütün transjenik soylarda deneysel kontrol olarak kullanılan aynı ağırlık 1118 stoklar, beş kuşaktır backcrossed edilir. Biz farklı deneyler gösteriyor: Modifiye kurulum için buharlaşma kaybı bir karşılaştırma, kısa vadeli bir gıda seçimi deneyi, uzun vadeli bir gıda alımı deney ve farklı sakaroz dilüsyonları üzerinde bir deney.
Buharlaşma CAFE deneyinin performansında önemli bir rol oynar. Biz buharlaşmayı azaltmak için bizim tahlil ek yaklaşımlar şunlardır: i) merkezi sünger tapa su her 24 saat ile doldurulmuş; ii) addintional su (4.6) nem muhafaza oluşturmak için kutu için taşıma kutusu içinde şişeleri ve bir kapak iii) kullanımını doldurdu. olmayan ve yukarıda bahsedilen cihazların bir kurulum arasında buharlaşmanın karşılaştırıldığında, buharlaştırma önemli bir azalma görülür. Bir etanol içeren çözeltinin yüksek volatilite bile etkisi yeni kurulumu kullanarak saptanabilir değildir.
İki seçim gıda deneyde 20 sinekler bir grup 3 saat besleyebilir. Doğal ortamlarda, meyve sinekleri alkol 22 meyve fermantasyon üzerine tercihen yem ve sinekler etanol 23 olmadan maya sakaroz çözümler üzerinde etanol ile maya-sukroz çözümler tercih ettiğini, benzer bir kurulumu kullanarak, gösterilmiştir. Burada, iki gıda seçenekleri sunulmaktadır, kırmızı gıda boyası ile etiketlenmiş 0.1 M sükroz çözeltisi ve mavi gıda boyası (Şekil 1A, C) ile işaretlenmiş% 15 EtOH ile 0.1 M sukroz çözümü. görsel exKarın aminasyon sinekler iki çözeltiler (Şekil 1D) beslenen gösterir. Sinek başına gıda tüketimi EtOH (Şekil 3A) ihtiva eden sukroz çözeltisi için (yaklaşık 2 kat) önemli ölçüde daha büyüktür.
Bir sonraki deneyde, uzun vadeli bir çalışmada, sekiz sinekler bir grup 4 gün boyunca benzeri gıda kaynaklarına erişimi vardır ve sinekler her gün (Şekil 3B) üzerinde etanol içeren gıda daha fazla tüketmek. Etanol için tercih endeksi ([Suc + EtOH] - [Suc] / toplam tüketim) bu dönemde (ortalama = 0.29, Tablo 4) boyunca sabit kalır. Gözlenen etanol tercihi farklı besin kaynakları 24, 25, 26 ayırt edebilirsiniz sinekler birkaç diğer yayınlar ve gösteriler ile uyumludur. gözlenen etanol Görülecek farklı kalori içerikleri bir sonucu olabilirsunulan çözümler ve etanol 24 ödüllendirici özellikleri. Tahlil, aynı zamanda gıda takviyeleri olumsuz etkilerini ölçmek için kullanılabilir. Ja ve arkadaşları paraquat (bir oksitleyici ilaç) uygulama gıda tüketimini 10 azalır, bu yöntemin ilk yayında gösterdi.
Bir sonraki deneyde, cinsiyetler arasında gıda alımı farkı gösterilmektedir. Metabolik gereksinimler erkek ve kadın D. melanogaster arasında farklılık gösterir. Örneğin, erkek sinekler kadın karbonhidrat açısından zengin diyetler 27 üzerinde protein bakımından zengin diyetler tercih, yumurta üretimi sırasında, artan protein biyosentezini gerektiren bir faz karbonhidrat açısından zengin yiyecekleri tercih ederken. Şeklindeki erkek ve dişi sinekler bu deneyde kullanıldı. 20 erkek ve 3 saat besleme aralığında 20 kadın sinekler arasında gıda alımı farklılıkları analiz etmek, bir kafe tahlil sükroz concent kullanılarak yapılırrasyon serisi. Beş kılcal 10 arasında değişen çözeltiler ile sağlanan 3 - 2M sakaroz ve her çözeltisi tüketimi (Şekil 4A) ölçülmüştür. Sonuçlar her iki cinsiyette bir besin kaynağı (Şekil 4A) gibi yüksek konsantrasyon sakaroz çözümleri tercih ettiğini gösterdi. Ancak, kadınlar erkeklerden (p <0.05) ile karşılaştırıldığında en düşük iki konsantrasyon sakaroz çözümleri önemli ölçüde daha fazla tüketilen; Diğer taraftan, erkek yüksek konsantrasyon çözeltiler (p <0.001) önemli ölçüde daha fazla tüketilmesi. bu veriler vücut büyüklüğü farklılıkları hesaba olmadığını unutmayın. Kadın D. melanogaster erkeklerde (Tablo 1) göre genellikle daha büyük ve ağırdır. gıda tüketim kütlesini uçmak için normalize edildiğinde, düşük sukroz solüsyonunun tüketiminde kadın ve erkeklerin arasındaki farklar artık önemlidir. Özetle, erkekler daha önceki veriler ile tutarlı evlendirilen kadınlardan daha sakaroz çözeltisini, tüketmek, reflolası farklı metabolik talepleri, besin tercihleri ya da iki cinsiyet arasındaki kılcal damarlar üzerinde beslemek için yeteneği basit farklılıkları ecting.
Şekil 1: Drosophila melanogaster Kılcal Besleyici Deneyi. A) sinekler besleme deneyi. Nemlendirilmiş bir filtre kağıdı şişenin dibinde su sağlar. Dört kılcal damarların deney (zıt kapillerde kırmızı- mavi renkli gıda) içinde verilir. kılcal damarların ikinci pipet ile konumda sabitlenebilir unutmayın ve kullanılmayan pozisyonları pipet uçları kullanılarak kapalı edilmektedir. Kapağın merkezinde bir köpük fiş hava değişimini sağlar. B) kapağın Ayrıntılı görünüm. Kesme pipet uçları (2-20 mL, kırmızı sınırları) kullanılmayan pozisyonların konik açıklık ve bir ikinci PI sokulurPette ucu deliği kapatmak için kesme ucu içine sokulmuştur. kesim pipet uçları mikrokapilerler yerleşimini kontrol etmek için kullanılır, ve kesilmemiş ipuçları sıkı kılcal tutmak için kullanılır. C) D melanogaster sineği kılcal beslenir. Beslemeden sonra D), gıda boyası sinek karın açıkça görülebilir. E) Bir dijital kumpas başlayan işareti arasındaki mesafeyi ölçmek ve menisküsün sonunu işaretlemek için kullanılır. Veri USB üzerinden bir Excel elektronik tablosu doğrudan aktarılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Kılcal Besleyici Deneyinde Buharlaşma etkisi. A) Birden CAFE tahlil içine yerleştirilenbir ızgarah kakma ile plastik kutu. Deney dört su dolu şişeleri sırasında nem kontrol etmek için (kırmızı jantları) ızgara içine yerleştirilir. buharlaşma denetimleri bu şişelere doğrudan yakınlığı yerleştirilir. Bütün kurulum için bir kapak arka gösterilmiştir. Buharlaşma yoluyla hacim kaybı B) Karşılaştırma. buharlaşma 4 gün boyunca ortalama değer gösterilir. Nem, merkezi bir sünger tapa (24 H aralığı) su uygulanması (i) ile kontrol edilir; (Ii) ızgara içine dört su dolu şişeleri eklenmesi; ve (iii) tüm kurulum için plastik bir kapak kullanarak. Nem Test edilen her iki çözüm için kontrol edilir, eğer buharlaştırma önemli ölçüde daha düşüktür (*** p ≤ 0,001; n = 48). EtOH içeren ve sakaroz çözeltisini olmayan içeren arasındaki volatilite herhangi bir fark kullanılan nem cihazları ile saptanabilir. Büyük halini görmek için buraya tıklayınızbu figür.
Şekil 3: Sakaroz içinde çözümü sükroz içeren Etanol tercihi (EtOH). 1118 sinekler w erkek A) Gıda tüketimi gösterilmektedir. Erkekler düz sukroz çözeltisi daha sükroz çözeltisi içeren bir% 15 EtOH önemli ölçüde daha fazla tüketir. *** P ≤ 0,001; N = 27 B) belirgin bir 4 günlük deneme sırasında% 23 EtOH içeren sakaroz çözümü tercih Sinekler. *** P ≤ 0,001; ** P ≤ 0.01; N = 16 bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Cıonsumption (ul / sinek ve mL / mg sinek) Erkek ve Kadın, Farklı Sakaroz Konsantrasyonlardaki 1118 Sinekler w. A) sukroz solüsyonunun farklı konsantrasyonlarının tüketim erkek ve kadınlar arasında anlamlı farklılık göstermektedir. Kadın sinekler düşük sakaroz konsantrasyonlarında daha fazla tüketmek ve erkek sinekler yüksek konsantrasyonlarda daha fazla tüketmek. * P <0.05; *** P <0.001; 20 erkek her N = 20 kadın her biri) ile 30 çalışmalarda N = 27 denemeler. Bir kütle bazında B) Gıda alımı. kitle uçmak için normalize zaman tüketiminde önemli bir artış 0.1 M 2 sükroz çözümleri için erkek ve kadın sinekler arasında oluşur. *** P ≤ 0,001; N 27 erkek, N = 30 kadın =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1: Male Vücut Ağırlığı ve 1118 Sinekler w Kadın. 100 sinekler dört ila beş grup ölçüldü ve vücut ağırlığı (mg / sinek) hesaplandı. (STDSAPMA (standart sapma) ve STERROR (standart hata) ile birlikte) Ortalama değerler gösterilmiştir. Ortalama değerler kütle (mL / mg sinek) uçmak için gıda tüketimi normalleştirmek için kullanılır. Bu e-tabloyu indirmek için tıklayınız.
Tablo 2: CAFE Testi buharlaştırma Kaybı (ul). buharlaştırma kaybolan sıvının miktarı, 4 gün boyunca gösterilmiştir. Nem kontrollü (+) veya hayır olduğunut (-), Şekil 2'de tarif edildiği gibi. İki farklı çözümler (sakaroz ve sükroz artı EtOH) için Buharlaşma verileri gösterilmiştir. Ortalama değerler her gün için ve (STDSAPMA ve STERROR ile) süre boyunca sunulmuştur. sakaroz dilüsyonları deney buharlaşma kaybı (ortalama değerleri) ayrı ayrı altına gösterilir. Bu e-tabloyu indirmek için tıklayınız.
Tablo 3: 1118 w ile 0.1 M sukroz /% 15 EtOH olmadan Erkek tüketimi 3 saat Fed Sinekler. 20 sinekler gruplar tarafından çözeltilerin tüketimi 3 gün, 3 saat için ölçüldü. sinek grupları için tüketim değerleri sinek başına mikrolitre alımını tahmin için test sinek sayısına bölünür Evaporatif kaybı çıkarıldıktan sonra. (STDSAPMA ve STERROR ile) Ortalama değerler gösterilmiştir. Bu e-tabloyu indirmek için tıklayınız.
Tablo 4: 0.1 M sükroz ile Tüketimi ve 1118 Sinekler w Erkek Dört gün için% 23 EtOH olmadan. 8 sinekler gruplar tarafından çözeltilerin tüketimi, 4 gün boyunca 24 saat boyunca ölçülür. etanol Tercih endeksi aşağıdaki formülü (- [Suc] / toplam tüketim [Suc + EtOH]) kullanılarak hesaplandı. sinek grupları için tüketim değerleri evaporatif kaybı çıkarıldıktan sonra sinek başına uL alımını tahmin için test sinek sayısına bölünür. (STDSAPMA ve STERROR) ile ortalama değerler her bir gün için gösterilmiştir..jove.com / files / ftp_upload / 55024 / JoVE55024R1-Diegelmann-Tablo-4.xlsx "target =" _ "blank> Bu e-tabloyu indirmek için tıklayınız.
Tablo 5: Erkek Sakkaroz Beş konsantrasyonlarının Tüketim ve 1118 Sinekler w Kadın. Her bir çözeltiye, ve sükroz alımı toplamı değeri alımı gösterilmiştir. her bir konsantrasyon için ortalama değerler (STDSAPMA ve STERROR) ile her bir kolon aşağıda verilmiştir. Uçucu kütle (anında her miligramı için mikrolitre alımı) göre alımını hesaplamak için, besin tüketimi (sağ tarafta gösterildiği Tablo 1 'den), erkek veya dişi sinekler, ortalama ağırlığı ile bölünür. Bu e-tabloyu indirmek için tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Raporda, teknik kurulum ve laboratuvarda başarılı performansına odaklanarak, bir adım-adım moda CAFE deneyi açıklamaktadır. Kolaylığından dolayı, bu deney aynı zamanda bir okul deney olarak eğitimsel kullanılabilir. Örnekler tahlil kısa ve uzun süreler (gün saat) üzerinde Drosophila melanogaster gıda algılama, tercih ve tüketim soruşturma izin verdiğini göstermektedir. CAFE tahlil gıda ve ilaç tüketimi, madde bağımlılığı, enerji dengesini ve beslenme 16 nöronal kontrolüyle, 18, 24, 25 de dahil olmak üzere konuları araştırmak için sahada yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır.
CAFE deneyde, deney sinekler başarıyla gibi yiyecek arama, algılama ve hareket olarak gıda elde etmek için çeşitli görevleri gerçekleştirmek gerekir; Bu görevleri gerçekleştirmek için yetersizlik az tüketimle neden olabilir. İçindavranışı yaşlanma sinekler açlık durumuna bağlıdır ve bu 19, 21, açlık arttırılabilir. Algılama ve besin kaynağına dolayısıyla lokalizasyonu, koku veya tat için sinek yeteneği etkilenebilir ve dolaylı olarak bir düşük tüketim oranına 28 neden olabilir. Bir kılcal sonunda gıda ekran aşağı tırmanmaya ve aktif beslemek için baş aşağı pozisyonda kendini tutmak için sineği zorlar. kapiller içme konumda tutun, sinek kas kasılması koordine etmelidir. yaşlanmaya bağlı lokomosyon eksiklikleri gibi hareketin düşüklüğü ya da hiperaktivite açıkça gıda alımını etkileyecektir. Buna ek olarak, bu manevra sırasında diğer sinekler tarafından parazit gıda alımından erken fesih yol açar. Bu nedenle, kullanılan sinek sayısı deney öncesinde belirlenmelidir. Bu sayı, tüm sinekler doğru beslenmek sağlamak olmalı ve f kontrol etmelidir(8 bizim D. melanogaster CAFE deney şişesine 20 sinekler maksimum) şişede ly yoğunluğu. Besleme yemek besin değeri etkilenir ve dinamik, buna göre 29 24 kendi yutmayı ayarlamak sinekler. Bu nörotransmitter octopamine eksik mutantlar, normal başına tepki puanları göstermiştir, ancak, aynı zamanda, gıda alımı 14 önemli bir azalma göstermektedir edildi. Ayrıca, beslenme sırasında, motivasyon yeme düşüşler devam etmeyi ve davranış fesih yol açar.
Yukarıda belirtilen hususlar CAFE tahlile, onlar da diğer test sistemlerinde ölçülen beslenme davranışını etkileyen çeşitli değil geçerlidir. gıda alımını ölçümü, bu nedenle, tahlilin gerçekleştirilmesi için sinekler kabiliyeti dikkate alınmalıdır. bu teknik açıdan zor olmamasına rağmen, CAFE tahlil bazı potansiyel pratik sakıncaları vardır. menisküsün düşüşkapiller içindeki sinekler tarafından buharlaşma kaybı ve gıda alımı bağlıdır. Yüksek buharlaşma sinyal gürültü oranını ilgili sorunlu ve bu nedenle en aza indirilmelidir. Biz deney süresi (Bakınız 4.6) sırasında nem kontrolü için birkaç ek yaklaşımlar ve aygıtları uyguladı. Bu aksesuarlar buharlaşma kullandığımız gıda kaynaklarının farklı oynaklığı anlamlı ve hatta ortadan etkileri azaltmak için bize yardımcı oldu. Resim iklim odası varsa Bununla birlikte, deney bir dezavantaj olarak daha yüksek bir buharlaşma değerleri (bir sınıf olarak, örneğin), oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir.
Protokolde belirtildiği gibi, kılcal damarların uçları nedeniyle yiyecek kaynağına farklı mesafelere sineğin seçiminde önyargı önlemek için şişenin içinde aynı seviyede yerleştirilmesi gerekir. Bunu başarmak için, kılcal konumu, ikinci bir pipet ucu ile tespit edilir. kılcal uzunluğu yabani olarak beslenmesi için bir kriter olarak görünmemektedirtip 10 uçar. herhangi bir sıvı dökülmesi besin tüketiminin doğru okuma sarsar (4.3 ve 4.9); titreşimsiz bir ortam dökülmelerini önler. çözüm blok kılcal partiküller akış ve gıda tüketimini önlemek. Gıda çözeltisi, maya içeren, özellikle de tam bir tıkanmayı önlemek için çözülmesi gerekmektedir. suda çözünür maya ekstresi kullanımı, bu sorunun üstesinden gelmek için ancak bir besin kaynağı olarak tam olmayan ek Spor maliyetlere neden olabilir. Gıda erişilebilirlik deney öncesi ve sonrası değerlendirilmesi gerekir. analize dahil edilmelidir sadece sinek veri gıda erişimi Tüm deney sırasında mevcut nerede (4.9 bakınız) elde olmasıdır. ters besleme pozisyonu deney kritik bir özelliktir. meyve ağaçlardan sarkar ve bir çürük meyve tırmanmaya olabilir gibi doğal koşullar altında, bu beslenme pozisyonu, sinek yabancı değildir. Bu karş deneyler ile desteklenmektedir(i) MAFE deneyinde immobilize sinek yatay yeme pozisyon ve (ii) sağ kanattan-up konumunu besleyen radyoaktif işaretli gıda 13 kullanılarak, 21 CAFE deneyinde baş aşağı pozisyonda besleme sinekler yemek boyutları ing . baş aşağı gıda ekran sinekler için bir sorun görünmüyor olsa da, kapiller içindeki gıda kompozisyonu etkileyebilir. Böyle maya hücreleri gibi Asma takviyeleri kılcal dibine yerçekimi aracılığıyla batırabilir ve bu nedenle altta daha konsantre olabilir ya da kılcal fiş olabilir. Bu sinek davranış ve böylece sonuçları etkileyecektir. Besleme çözeltisi bileşenleri tamamen çözündürülür sağlanması, ve sık sık uzun süreli deneyler sırasında taze kılcal sokulması, gıda alımı üzerine, bu etki en aza indirir.
Süre açıklıklı burada tarif edilen CAFE tahlilinin kullanımı uçucu grup gıda alımının ölçümü sağlarsaat veya gün. Daha ayrıntılı analizi gereklidir (örneğin., Bir sinek ya da davranış dakika aralığında davranışı), örneğin MAFE deneyi gibi diğer besleme deneyleri, daha uygundur. Sineklerin sayısı daha 1.5 mL mikrosantrifüj tüp ve tek bir kılcal 30 kullanılarak azaltılabilir için mümkün olabilir.
Örnek sonuçlar elde etmek için kullanılan deney, literatürde 17, 24 tarif edilen deneyler ile tutarlı olarak 15 ile 27 arasında değişir. Deney deneyci potansiyel önyargı kurallar klasik kör gerçekleştirilebilir ve normal olarak birden fazla günden her birinde en az 4-5 kez tekrarlanır. CAFE tayini ile elde edilen veriler vücut büyüklüğü ile ilgili beslenme davranış farklılıkları hesaba vücut ağırlığına normalize edilebilir. Bu tahlilde elde edilen sonuçlar, böylece sağlam ve tekrarlanabilir buyüksek lisans öğrencileri için uygulamalı derslerde başarılı girmiştir.
CAFE testinin yaygın Drosophila melanogaster metabolik ve tat araştırma alanında kullanılır; Bu beslenme davranışı üzerinde gıda takviyesi ve / veya uyuşturucu rolü test bir çok uygulamaya sahiptir, ve belirli bir besin kaynağı 24 dozunun tepkisini incelemek için kullanılabilir. D. melanogaster nöronal devreleri işlemek için kullanılan teknikler olağanüstü çeşitliliği ile birlikte, bu tahlil de araştırmacılar davranış 12, 17, 18 yedirme üzerinde takviye sistemlerinin rolünü araştırmak için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vials (breeding) | Greiner Bio-One | 960177 | www.greinerbioone.com |
| Vials (CAFE assay) | Greiner Bio-One | 217101 | www.greinerbioone.com |
| Lid-CAFE assay | Workshop | – | – |
| Plastic box, low wall | Plastime | 353 | www.plastime.it |
| Cover for the plastic box | Workshop | – | – |
| Capillaries | BLAUBRAND | REF 7087 07 | www.brand.de |
| Pipette tips | Greiner Bio-One | 771290 | www.greinerbioone.com |
| Filter paper circles | Whatman | 10 311 804 | www.sigmaaldrich.com |
| D(+)-Sucrose | AppliChem | 57-50-1 | www.applichem.com |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 20,821,330 | www.vwr.com |
| Food color (red, E124) | Backfun | 10027 | www.backfun.de |
| Food color (blue, E133) | Backfun | 10030 | www.backfun.de |
| Soap solution (CVK 8) | CVH | 103220 | www.cvh.de |
| Digital caliper | GARANT | 412,616 | www.hoffmann-group.com |
| Vials (breeding) | Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm | ||
| Vials (CAFE assay) | Height 8 cm, diameter 3.3 cm | ||
| Lid-CAFE assay | Produced in university workshop, technical drawing supplied Please click here to download this file. |
||
| Plastic box, low wall | A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions | ||
| Cover for the plastic box | Dimensions (37 x 29 x 18 cm) | ||
| Capillaries | DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished | ||
| Pipette tips | Pipettes for the outer circle are cut according to the lid | ||
| Filter paper circles | 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used | ||
| D(+)-Sucrose | Not harmful | ||
| Ethanol absolute | Highly flammable liquid and vapor | ||
| Food color (red, E124) | Not stated | ||
| Food color (blue, E133) | Not stated | ||
| Soap solution (CVK 8) | Odor neutral soap | ||
| Digital caliper | |||
| Standard fly food | (for 20 L) | ||
| Agar | 160 g | ||
| Brewer's Yeast | 299.33 g | ||
| Cornmeal | 1,200 g | ||
| Molasses | 1.6 L | ||
| Propionic acid | 57.3 mL | ||
| Nipagin 30% | 160 mL |
References
- Krauth, C., Buser, J., Vogel, K. How high are the costs of eating disorders - anorexia nervosa and bulimia nervosa - for German society. Eur. J. Health Econ. 3 (4), 244-250 (2002).
- Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity and instrumental variables approach. J. Health Econ. 31, 219-230 (2012).
- PriceWaterhouse Coopers LLP. The costs of eating disorders: Social, health and economic impacts. Assessing the impact of eating disorders across the UK on behalf of BEAT. PwC. , Available from: https://www.beat.co.uk/assets/000/000/302/The_costs_of_eating_disorders_Final_original.pdf (2015).
- Lenard, N. R., Berthoud, H. R. Central and peripheral regulation of food intake and physical activity: pathways and genes. Obesity. 16, S11-S22 (2008).
- Magni, P., et al. Feeding behavior in mammals including humans. Trends in Comp. Endocrinology and Neurobiology. 1163, 221-232 (2009).
- Morton, G. J., Meek, T. H., Schwartz, M. W. Neurobiology of food intake in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 15, 367-378 (2014).
- Bharuchka, K. N. The epicurean fly: using Drosophila melanogaster to study metabolism. Pediatr. Res. 65 (2), 132-137 (2009).
- Smith, W. W., Thomas, J., Liu, J., Li, T., Moran, T. H. From fat fruit fly to human obesity. Physiol. Behav. 136, 15-21 (2014).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biology. 11, (2013).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Dethier, V. G. The Hungry Fly: A Physiological Study of the Behavior Associated with Feeding. , Harvard Univ Press. Cambridge, MA. (1976).
- Albin, S. D., Kaun, K. R., Knapp, J., Chung, P., Heberlein, U., Simpson, J. H. A subset of serotonergic neurons evokes hunger in adult Drosophila. Curr. Biol. 25, 2435-2440 (2015).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat. Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Geer, B. W., Olander, R. M., Sharp, P. L. Quantification of dietary choline utilization in adult Drosophila melanogaster by radioisotope methods. J. Insect Physiol. 16, 33-43 (1970).
- Thompson, E. D., Reeder, B. A., Bruce, R. D. Characterization of a method for quantitating food consumption for mutation assays in Drosophila. Environ. Mol. Mutagen. 18, 14-21 (1991).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Scheiner, R., Steinbach, A., Classen, G., Strudthoff, N., Scholz, H. Octopamine indirectly affects proboscis extension response habituation in Drosophila melanogaster by controlling sucrose responsiveness. J. Insect Physiol. 69, 107-117 (2014).
- Liu, Y., Luo, J., Carlsson, M. K., Nässel, D. R. Serotonin and insulin-like peptides modulate leucokinin-producing neurons that affect feeding and water homeostasis in Drosophila. J. Comp. Neurol. 523, 1840-1863 (2015).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), e101107 (2014).
- Itskov, P. M. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behavior in Drosophila. Nat. Commun. 5, 4560 (2014).
- Qi, W., Yang, Z., Lin, Z., Park, J. Y., Suh, G. S. B., Wang, L. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol. Brain. 8, 87 (2015).
- Marx, V. Metabolism: feeding fruit flies. Nat. Methods. 12 (7), 609-612 (2015).
- Spieth, H. T. Courtship behavior in Drosophila. Annu. Rev. Entomol. 19, 385-405 (1974).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Curr. Biol. 19 (24), 2126-2132 (2009).
- Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (7), 2498-2503 (2008).
- Pohl, J. B., et al. Ethanol preference in Drosophila melanogaster is driven by its caloric value. Alcohol Clin. Exp. Res. 36 (11), 1903-1912 (2012).
- Vargas, M. A., Luo, N., Yamaguchi, A., Kapahi, P. A role for S6 kinase and serotonin in postmating dietary switch and balance of nutrients in D. melanogaster. Curr. Biol. 20 (11), 1006-1011 (2010).
- Masek, P., Scott, K. Limited taste discrimination in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (33), 14833-14838 (2010).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr. Opin. Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Luo, J. N., Lushchak, O. V., Goergen, P., Williams, M. J., Nässel, D. R. Drosophila insulin-producing cells are differentially modulated by serotonin and octopamine receptors and affect social behavior. Plos One. 9 (6), e99732 (2014).
