Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.
Almindelige problemer i behandlingen af biologiske prøver for observationer med scanning elektron mikroskop (SEM) omfatter celle sammenbrud, behandling af prøver fra våde mikromiljøer og celle ødelæggelse. Brug unge blomster væv, ægsporesvampe cyster og svampesporer (BLADHATTE) som eksempler, specifikke protokoller til at behandle sarte prøver er beskrevet her, der kan overvinde nogle af de vigtigste udfordringer i prøve behandling for billedoptagelse under SEM.
Blomster dannelsesvæv fast med FAA (formalin-eddikesyre-Alkohol) og forarbejdet med det kritiske punkt Dryer (CPD) ikke udviser kollapsede cellulære vægge eller forvrænget organer. Disse resultater er afgørende for genopbygningen af blomster udvikling. En lignende CPD-baserede behandling af prøver fra våde mikromiljøer, såsom glutaraldehyd-fikseret ægsporesvampe cyster, er optimalt at teste forskellen vækst af diagnostiske egenskaber (f.eks, cyste pigge) på forskellige typer af substrates. Ødelæggelse af sygeplejerske celler knyttet til svampesporer blev undgået efter rehydrering, dehydrering, og CPD behandling, et vigtigt skridt til yderligere funktionelle studier af disse celler.
Protokollerne beskrevet her repræsenterer lave omkostninger og hurtige alternativer for erhvervelse af god kvalitet billeder til rekonstruere vækstprocesser og studere diagnostiske egenskaber.
I biologi, er brugen af scanning elektronmikroskopi (SEM) blevet udvidet til studier af strukturelle udvikling, sammenlignende morfologi, orgel udvikling og karakterisering af populationer eller arter 1. Med sin todimensionale visning af mikroskopiske strukturer, områder som Mikromorfologisk og systematik profiteret af SEM Teknik fremskridt siden anden halvdel af det 20. århundrede. For eksempel indførelsen af katodeforstøvningscoatingssystem metoden i 1970'erne gjort mulige observationer af sarte materialer såsom skyde spidser og blomster øger billeddannelse af ikke-ledende væv 2, 3. SEM bruger elektroner skubbes ud fra overfladen af prøven til at reproducere topografien i en høj-vakuum miljø 4.
Undersøgelser med SEM er fokuseret i både slutning af strukturelle karakterer og genopbygningen af growth processer. Nye strukturelle tegn relevante for taksonomi og systematik i en bred vifte af organismer er blevet opdaget fra SEM observationer. For eksempel, plante træk bruges for arter, diagnose eller supraspecific klassifikationer, såsom vestured gruber af træ 5, stigmatisering mangfoldighed 6, nectary og blomster morfologi 7, 8, trichome detaljer 9 og pollenkorn 10, 11, kan ikke sigtes ordentligt uden SEM. Succesfulde observationer med konventionelle SEM er også opnået for lang tid formalin-fikserede organismer 12 og plante herbarium prøver 13.
På den anden side, studier af rekonstruktion af vækst processer ved hjælp af SEM involvere en bred vifte af emner, såsom organudvikling 14, infeKTIONER fremkaldt af bakterier 15, plante rod fysiologi 16, parasit-vært vedhæftede mekanismer 17, 18, narkotika virkninger på parasitter 19, mycoparasitism og antibiotiske 20, 21, vækst misdannelse 22, sammenlignende udvikling af vilde og mutant individer 23, og hele livscyklus 24. Selvom scanning miljømæssige elektronmikroskoper (ESEM) 25 kan have vigtige fordele til observation af våde biologiske prøver i vækstprocesser, kan delikat materiale stadig blive kompromitteret, selv i lavt vakuum tilstand ESEM), og skal behandles tilstrækkeligt for at undgå tab af værdifulde morfologiske observation.
I dette papir, en gennemgang af specifikke protokoller for SEM-observation af tre different typer prøver præsenteres: blomster meristemer, Oomycetes (Saproleqnia) og svampe materiale. Disse protokoller kompilere oplevelsen af vores tidligere SEM-baserede studier 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, hvor der er fundet særlige vanskeligheder og alternative løsninger. I tilfælde af anlæg sammenlignende udviklingsmæssige og strukturelle studier, brug af SEM startede i 1970'erne 34, 35, og siden da, opdagede forskerne, at visse blomster funktioner er mere labile end tidligere antaget 36. Rekonstruktion af blomster udvikling indebærer opsamling af alle stadier mellem unge blomster meristemer og anthesis. For at nå dette mål, er det essential at prøven topografi og cellevæggen integritet ikke kompromitteres efter optagelsen og efterfølgende dehydrering. Unge blomster meristem er særligt sårbare over cellevæggen kollaps (figur 1a, 1b). Ligeledes sarte strukturer såsom nectaries, kronblade, stigmata og sporangier kræver effektive og undamaging protokoller. Denne anmeldelse opsummerer en optimal protokol til at holde unge og sarte væv intakt for SEM billeddannelse.
I tilfælde af oomyceter (Stramenopiles) -on af de mest forskelligartede og udbredte grupper af parasitter, med værter lige fra mikrober og planter til invertebrater og vertebrater 37 – der er sporer, der vokser og udvikles i et vådt miljø. Denne betingelse er en udfordring for SEM-observation, fordi sporerne har brug for en tilstrækkelig substrat ikke egnet til standard SEM-protokoller. Blandt Oomycetes, arter af Saproleqnia er af særlig interesse, fordi de can forårsage alvorlige reduktioner i akvakulturer, fiskeri og padder befolkninger 38. Micromorphological karakteristika, såsom de krogede spines af cyster, har vist sig at være nyttigt at identificere arter af Saproleqnia, som er grundlæggende for at etablere infektion kontrol og potentielle behandlinger 39. Her er der en forsøgsprotokol for at sammenligne de mønstre af rygsøjlen vækst af cyster på forskellige substrater og til at manipulere prøven til kritiske punkt tørretumbler (CPD) forberedelse og efterfølgende SEM-observation.
I en tredje sag, der er interessante fund, der kom op efter en inspektion af sporer af svampe Phellorinia herculanea f. stellata f. nova (BLADHATTE) 31. Sammen med de sporer, blev en gruppe af uventede planteskole celler identificeret under SEM. Med tidligere traditionelle protokoller og ubehandlet materiale, kom de sygeplejerske celler out fuldstændig sammen (figur 1c). Yderligere slutninger om særlige væv associeret med sporerne kan fremstilles med de enkle, men vigtige ændringer til standardmetoder beskrevet her (figur 1d).
I denne gennemgang er der detaljerede SEM protokoller, der kan anvendes til at behandle forskellige problemer forbundet med SEM-observation i dækfrøede, Oomycetes, og BLADHATTE, såsom celle sammenbrud og meristemvæv krympning, ikke-optimal vækst af cyster spines, og destruktion af flygtige væv henholdsvis.
Figur 1: Sammenligning af prøver behandlet uden (a, c) og med (b, d) protokollen FAA-ethanol-CPD. (A – b) Blomster knopper af Anacyclus clavatus, mid-udvikling. Bud behandlet med osmiumtetroxid 46 </ sup> (a) og knop behandlet med FAA-CPD-protokol (b). (C – d) Sygeplejerske celler med sporer af Phellorinia herculanea f. stellata. Tørrede prøver uden nogen behandling (C) og med protokollen her beskrevet for BLADHATTE (d). Sporer i orange. Skalaer: (ab) 100 um, (CD) 50 um. Billeder er taget af Y. Ruiz-León. Klik her for at se en større version af dette tal.
Med hensyn til standard SEM-protokoller, de procedurer, der præsenteres her omfatter forholdsvis hurtig, let at følge, og billige metoder. Afhængigt af mængden af prøver og på den lette behandling, tager det fire til fem dage til at erhverve billeder af god kvalitet. Herunder passende forholdsregler til byggevaredirektivet og SEM drift sikkerhed, procedurerne er let at håndtere. Særlig forsigtighed bør tages med formalin og glutaraldehyd (se trin 1.1.1 til 1.1.3 og 2.1.5 i protokollen). Der er visse trin,…
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt har modtaget støtte fra Den Europæiske Unions Horisont 2020 forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftale nr 634429. Denne publikation forpligter kun forfatteren, og Kommissionen kan ikke holdes ansvarlig for enhver brug, der kan gøres af oplysningerne indeholdt deri. Vi anerkender også den finansielle bidrag fra Real Jardín Botánico, CSIC. SR er taknemmelig for Den Europæiske Union [ITN-SAPRO-238.550] til støtte af hendes forskning i Saproleqnia. Vi vil også gerne takke Francisco Calonge for venlig at give de Phellorinia herculanea billeder og B. Pueyo for behandling af prøver (figur 5). Alle billeder blev taget af SEM service på Real Jardín Botánico-CSIC i Madrid.
Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
D (+) Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
Double sided sellotape | No specific supplier | ||
Ethanol absolute | No specific supplier. | Flammable | |
European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
Filter paper | No specific supplier | ||
Forceps | No specific supplier | ||
Formalin 4% | No specific supplier. | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
Glass cover slips | No specific supplier | ||
Glass hermetic container | No specific supplier | ||
Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
needles | No specific supplier | ||
Petri dishes | No specific supplier | ||
Plastic containers | No specific supplier | ||
Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
scalpels | No specific supplier | ||
Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
Software for SEM | |||
Solution A: NaH2PO4 | |||
Solution B: Na2HPO4 | |||
Specimen holders | No specific supplier | ||
Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
Stereomicroscope | No specific supplier | ||
Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
Tweezers | No specific supplier |