Abstract
Veel voorkomende problemen bij de verwerking van biologische monsters voor observaties met de scanning elektronenmicroscoop (SEM) waartoe cel instorten van de monsters uit natte micro-omgevingen en celvernietiging. Met behulp van jonge bloemen weefsels, oömyceet cysten, en schimmels sporen (Agaricales) als voorbeeld, specifieke protocollen om delicate monsters worden hier beschreven dat een aantal van de belangrijkste uitdagingen in de steekproef behandeling voor het vastleggen van beelden onder de SEM overwinnen verwerken.
Bloemen meristemen met FAA vaste (formaline Acetic-Alcohol) en verwerkt met het kritische punt Droger (CPD) niet weer te geven ingestort celwanden of vervormd organen. Deze resultaten zijn van cruciaal belang voor de wederopbouw van bloemen ontwikkeling. Een soortgelijke CPD gebaseerde behandeling van monsters van natte micro-omgevingen, zoals glutaaraldehyde gefixeerd oomycete cysten, optimaal van de differentiële groei van diagnostische kenmerken (bijvoorbeeld de cyste stekels) op verschillende soorten su testenbstrates. Vernietiging van de verpleegkundige cellen bevestigd aan schimmelsporen werd vermeden na rehydratatie, uitdroging, en de CPD behandeling, een belangrijke stap voor de verdere functionele studies van deze cellen.
De protocollen hier beschreven vertegenwoordigen goedkope en snelle alternatieven voor het verwerven van goede kwaliteit afbeeldingen om groeiprocessen te reconstrueren en diagnostische kenmerken te bestuderen.
Introduction
In de biologie is het gebruik van scanning elektronenmicroscopie (SEM) uitgebreid studies van structurele ontwikkeling, vergelijkende morfologie orgaanontwikkeling en karakterisatie van populaties of soorten 1. Met zijn twee-dimensionale weergave van microscopische structuren, gebieden zoals micromorfologie en systematiek profiteerde van SEM techniek vooruitgang sinds de tweede helft van de 20e eeuw. Bijvoorbeeld, de introductie van de sputter coating methode in 1970 mogelijk gemaakt opmerkingen van delicate stoffen zoals uiteinden van scheuten en bloemen verbeteren van de beeldvorming van de niet-geleidende weefsel 2, 3. SEM gebruikt elektronen van het oppervlak van het monster uitgeworpen de topografie reproduceren in een hoog vacuüm omgeving 4.
Studies waarbij SEM zijn gericht op zowel de gevolgtrekking van de structurele personages en de reconstructie van growth processen. Nieuwe structurele personages om de taxonomie relevante en systematiek van een breed scala van organismen zijn ontdekt van SEM waarnemingen. Bijvoorbeeld, planteigenschappen gebruikt voor soorten diagnose of supraspecific classificaties, zoals de bekledend kuilen van hout 5, stigma diversiteit 6, nectarklier en florale morfologie 7, 8, trichoom gegevens 9 en stuifmeelkorrels 10, 11, niet goed kan worden zonder zichtbaar SEM. Succesvolle waarnemingen met conventionele SEM werden ook bereikt voor de lange tijd in formaline gefixeerde organismen 12 en planten herbariumspecimens 13.
Aan de andere kant, studies van de wederopbouw van groeiprocessen met behulp van SEM omvatten een breed scala aan onderwerpen, zoals orgel ontwikkeling 14, InfeCTIES veroorzaakt door bacteriën 15, plantenwortel fysiologie 16, parasiet-gastheer hechtmechanieken 17, 18, effecten van geneesmiddelen op parasieten 19, mycoparasitisme en antibiotische 20, 21, de groei misvorming 22, vergelijkende ontwikkeling van de wilde en mutante individuen 23, en de gehele levenscyclus 24. Hoewel milieu-scanning elektronenmicroscopen (ESEM) 25 belangrijke voordelen kan hebben voor de observatie van natte biologische monsters in groeiprocessen, kan delicate materiaal nog steeds in gevaar worden gebracht, zelfs in de lage vacuüm toestand van de ESEM), en moeten adequaat worden verwerkt om verlies te voorkomen waardevolle morfologische observatie.
In dit artikel een overzicht van specifieke protocollen voor SEM waarneming van drie diffErent soorten monsters wordt gepresenteerd: bloemen meristemen, oömyceten (Saprolegnia), en schimmels materiaal. Deze protocollen samen te stellen van de ervaring van onze vorige SEM-gebaseerde studies 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, waar de specifieke problemen en alternatieve oplossingen zijn gevonden. Bij installaties vergelijkende ontwikkelings- en structurele studies, het gebruik van SEM begon in 1970 34, 35, en sindsdien onderzoekers ontdekt dat bepaalde bloem karakteristieken labieler dan gedacht 36. Reconstructie van bloemen ontwikkeling betreft het vangen van alle stadia tussen jong bloemen meristemen en de bloei. Om dit doel te bereiken, is het essential dat het monster topografie en de celwand integriteit niet in het gedrang na de vastlegging en de daaropvolgende uitdroging. Jonge bloemen meristemen zijn bijzonder kwetsbaar voor celwand instorten (figuren 1a, 1b). Ook delicate structuren zoals nectariën, bloemblaadjes, stigma en sporangia vereisen effectieve en undamaging protocollen. Deze beoordeling geeft een overzicht van een optimale protocol voor jonge en delicate weefsel intact SEM beeldvorming te houden.
Bij de Oomyceten (Stramenopiles) -on van de meest diverse en wijdverspreide groepen parasieten, met systemen die variëren van microben en planten invertebraten en vertebraten 37 - er sporen die groeien en ontwikkelen in een vochtige omgeving. Deze voorwaarde vormt een uitdaging voor SEM observatie, omdat de sporen een adequate ondergrond niet geschikt voor standaard SEM protocollen nodig. Onder de Oomyceten, soorten Saprolegnia van bijzonder belang omdat ze can ernstige vermindering van aquaculturen, visserij en amfibieën bevolkingsgroepen 38. Micromorfologische kenmerken, zoals de haakvormige stekels van cysten, zijn gevonden nuttig soorten Saprolegnia, dat fundamenteel is voor infectie controles en mogelijke behandelingen 39 vast te identificeren. Hier is er een experimentele protocol om de patronen van de wervelkolom groei cysten op verschillende substraten te vergelijken en om het monster voor kritische punt droger (CPD) bereiding en daaropvolgende SEM waarneming manipuleren.
In een derde geval zijn er interessante bevindingen dat na een inspectie van de sporen van de schimmels Phellorinia herculanea f kwam. stellata f. nova (Agaricales) 31. Samen met de sporen, een groep onverwachte kwekerij cellen werd geïdentificeerd onder SEM. Met eerdere traditionele protocollen en onbehandeld materiaal, kwam de verpleegkundige cellen out stortte in (figuur 1c). Verdere conclusies over bepaalde weefsels geassocieerd met de sporen kan worden gemaakt met eenvoudige maar essentiële aanpassingen aan de standaardbenaderingen beschreven (figuur 1d).
In deze beoordeling zijn er gedetailleerde SEM protocollen die kunnen worden gebruikt om te gaan met verschillende problemen met SEM waarneming in angiospermen, Oomycetes en Agaricales, zoals mobiele collaps en meristeemweefsel krimpen, niet-optimale groei cyste stekels en vernietiging van efemere weefsels, respectievelijk.
Figuur 1: Vergelijking van monsters behandeld zonder (a, c) en (b, d) protocol FAA-ethanol-CPD. (A - b) Floral knoppen van Anacyclus clavatus, mid-ontwikkeling. Knop behandeld met osmiumtetroxide 46 </ sup> (a) en Bud behandeld met de FAA-CPD-protocol (b). (C - d) Verpleegkundige cellen met sporen van Phellorinia herculanea f. stellata. Gedroogde monsters zonder enige behandeling (c) en het protocol beschreven voor Agaricales (d). Sporen in oranje. Schalen: (ab) 100 micrometer, (cd) 50 micrometer. Foto's werden genomen door Y. Ruiz-León. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NB: Dit protocol omvat zes hoofdrubrieken, drie gewijd aan specifieke organismen (secties 1-3), en drie beschrijven van de procedures voor alle (4-6). Sterretjes (*) geven stappen gewijzigd door de onderzoekers.
1. Onderzoek van de ontwikkelingslanden en volledig gevormd Plant Structures
- Inzameling en fixatie
- Als de plant materiaal wordt verzameld in een plaats met geen toegang tot een zuurkast, te introduceren en dompel het materiaal in 70% ethanol in centrifugebuizen. Idealiter, dompel het materiaal na 48 uur in de FAA (stappen 1.1.1-1.1.3) om overmatige uitdroging in de ethanol te vermijden. Als een zuurkast is toegankelijk voor het plantmateriaal, negeer deze stap en ga verder met 1.1.1.
- Bereid de formaline-azijnzuur-alcohol (FAA) fixatief in een zuurkast voorzien van een aldehyde filter. Voeg 85 delen 70% gedenatureerde ethanol, 10 delen 60% formaldehyde-oplossing en 5 delen ijsazijn. Bereid de FAAnet voor de vaststelling van het materiaal, zoals de opslag op lange termijn wordt afgeraden 40.
- Onder de zuurkast, giet de bouillon van de FAA in afzonderlijke brede mond en lekvrije plastic flessen. Gebruik zoveel flessen als er monsters beschikbaar en labels maken voor monster identificatie.
- Selecteer de bloemen of vegetatieve meristemen op te lossen, zodat ze niet beschadigd door insecten, schimmels of extreme weersomstandigheden. Snijd de takken, het verwijderen van ongewenste materialen, en het monster onmiddellijk in de FAA oplossing deponeren.
- Na 72-96 uur, giet de FAA in een plastic container voor chemische toiletten. Onmiddellijk driemaal wassen monsters met verse 70% ethanol om resten FAA verwijderen. Vast materiaal kan onbeperkt worden opgeslagen in 70% ethanol.
- Dissection en uitdroging
- Ontleden het vaste materiaal in 70% ethanol onder de stereomicroscoop met behulp van ultra fijne pincet, needles, tangen, borstels en micro-scalpels (de maximale grootte van het weefsel moet ongeveer 1 cm 3 of 2 cm voor vlak materiaal). Ontleden de monsters in een petrischaal bedekt met ethanol om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt. Gebruik een petrischaal met de basis bedekt met droge zwarte silicium om beter te zien de contrasterende witte weefsels.
- Zet de ontleed materiaal in specimen containers voor het kritieke punt droger (CPD, Figuur 2a). Op dit punt, dompel de containers in de petrischaal met 70% ethanol, en omvatten het monster identificatielabels (gemaakt met papier en potlood). Voor meer effectieve drogen voor verdere manipulatie, vermijd het mengen van de jonge en volwassen monsters in dezelfde container. *
- Plaats de deksels op de houders en neer te leggen in plastic centrifugebuizen met veel 70% ethanol. Bewaar de buizen overnacht als het materiaal niet onmiddellijk wordt verwerkt.
- Breng de ontleed materiaal door de volgende ethanol series in hermetische potjes of centrifugebuizen: 70%, 90%, 100% en 100%. Laat de monsters in elke oplossing gedurende 1 uur tenminste. Houd de monsters gedurende de nacht in een 100% ethanol-oplossing.
- Breng de containers met het materiaal aan de CPD (deel 4).
- Montage en het voorbereiden van plantenweefsels voor SEM observatie
- Schrijf het monster identificatienummer onder de SEM monster houders (dat wil zeggen, aluminium stubs). Bedek de bovenkant van de stompjes met dubbelzijdig plakband. Plaats de stubs in een monsterhouder (Figuur 2b).
- Onder een stereomicroscoop, zorgvuldig opent u de containers met de jonge en delicate monsters al in de CPD gedroogd. Houd in gedachten dat na de behandeling CPD, de monsters lichter en gevoelig voor elektrostatica. Sluit de containers nadat de monsters zijn genomen om stof of onzuiverheden te vermijden.
- Plaats de monsters op de kleverige oppervlak van de stompen, vooruit te plannen van de gewenstepositie (als de monsters het oppervlak raakt, is het zeer moeilijk te verwijderen). Probeer niet om een grote dissectie op dit punt te voeren; gewoon verwijderen van ongewenste weefsel dat is makkelijk op te pikken. Voor palynologische studies, ontleden de helmknoppen en deze toegankelijk voor het stuifmeel op de stompjes bloot te leggen.
- Zet lange monsters (bijvoorbeeld 2 cm lang) zoals bloeiwijzen in horizontale positie. Indien mogelijk, oriënteer monsters van dezelfde structuur voor polaire, zij- en onderkant uitzicht. Laat voldoende ruimte tussen de monsters op de stomp.
- Indien de monsters niet onmiddellijk kan worden verwerkt, bewaar ze overnacht beschermd in een luchtdichte container met silicagel rehydratie (figuur 2c) voorkomen *. Smeer de monsters met behulp van het sputter coater en overbrengen naar de SEM (hoofdstukken 5 en 6).
Figuur 2: Tools for sample manipulatiop en verwerking vóór SEM observatie. (A)-staal gemaakt specimen container met gaten muren voor de ethanol / CO 2 interchange in de CPD kamer. (B) Steel stubs binnen een plastic exemplaar houder. Houder (c) glas gebruikt voor het beschermen tegen vocht en stofmonsters houden. Aan de basis, is er een compartiment voor silicagel. (D) Critical Point Dryer. Aan de voorkant zijn er (van links naar rechts) de manometer, de schakelaar, het systeem van de temperatuurcontrole en de temperatuur display. Gebruikelijke werkdruk voor CO 2 ethanol interchange is 60 bar (800 psi). In de top, zijn er vier kleppen (inlaat, afvoer, ventilatie en afzuiging controles) aan weerszijden van de centrale monsterkamer. Foto's werden genomen door Y. Ruiz-León en MA Bello. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Groeien en vaststelling van de cysten
- Bereid pepton en glucose (PG-l) media 41 via D - (+) - glucose (6 g) en mycologische pepton (3 g) *. Voeg tot 900 ml leidingwater en autoclaaf 40 min bij 121 ° C. Giet 50 ml van de hiervoor geautoclaveerde oplossing A (NaH 2PO 4, 0,13 M) en 50 ml oplossing B (Na 2 HPO 4, 0,13 M).
- Uit voorraad kweken van stammen van Saprolegnia parasitica gehandhaafd op pepton, glucose, agarmedium (PGA, die wordt bereid zoals PG-l maar het toevoegen van 10 g Europese bacteriologische agar glucose en pepton voor autoclaaf), groei mycelia kolonies in 0,5 mL PG-l druppeltjes gedurende 24-48 uur bij 20 ° C in Petri schalen. Induceren sporulatie door het wassen van de mycelia met geautoclaveerd kraanwater drie keer en incubatie ze gedurende 15 uur bij 20 ° C= "xref"> 42, 43.
- Verzamel de vrijgemaakte secundaire zoosporen door voorzichtig pipetteren het bovenste deel van de suspensie en bundelen ze in 1 ml porties. Schud krachtig de zoosporen 30 s door vortexen secundaire cysten 44 te produceren.
- Om het differentieel groei van de stekels van de cysten, op afzonderlijke petrischaaltjes (p60) te testen, zet 0,5 ml van de secundaire cyste schorsing op verschillende oppervlakken (dat wil zeggen, koolstof, goud en koper TEM roosters, zalm en heek vissen schalen (voorheen gebleekt) en glazen afdekplaat slips) *. Incubeer de cysten bij 20 ° C gedurende 70 min, waarbij de bevestiging van de cysten op het oppervlak bevordert.
- Verwijder de vloeistof en voeg 0,5 ml van 2% glutaaraldehyde elk oppervlak voor de fixatie van de cysten. Houd de monsters bij kamertemperatuur onder een zuurkast gedurende 1 uur.
- Verwijder de glutaaraldehyde en dehydrateren het monster door een ethanolreeks (30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% en 100%), het toevoegen van 5 ml van elke oplossing ethanol gedurende 15 minuten. Eenmaal in de laatste 100% ethanoloplossing, kan het monster worden bewaard tot een maand in een afgesloten petrischaal. In dit stadium de monsters binnen de CPD te drogen.
- Breng voorzichtig de roosters en de schalen van de petrischaal aan een houder die geschikt zijn voor de CPD (hoofdstuk 4). Voor deze stap gebruikt een CPD raster houder of een stapeling monsterhouder, welke monsters van elkaar gescheiden te houden. Neem de roosters en de schalen met een pincet, in gedachten houden dat de cysten moeten worden naar boven op de roosters de hele tijd. *
- Montage en het voorbereiden van cyste monsters voor SEM observatie
- Monteer de roosters en de schalen op de aluminium stubs die eerder waren bedekt met dubbelzijdige tape en carbon onder het label.
- Breng de monsters naar de sputter coater (hoofdstuk 5).
- Let op de monsters onder de SEM (hoofdstuk 6).
Phellorinia herculanea onder SEM
- Rehydratie en uitdroging van sporen
- Wikkel elk monster voorzichtig met filter papier, vormen-potlood gelabelde enveloppen ~ 0,5-1 cm 2, zorg ervoor dat u hen te verpletteren. Sluit de filter papier met paperclips. Breng de verpakte monsters naar een petrischaal en dompel ze in 10 ml water aan weefsels rond de sporen hydrateren.
- Onmiddellijk de monsters in een magnetron (600 W voor ongeveer 20 s). Verwijder het materiaal wanneer het water begint te verdampen, en laat het afkoelen op kamertemperatuur.
- Leid de monsters door de volgende reeks ethanol: 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% en 100%. Afhankelijk van de mate van gebruik, gebruiken een beker of centrifugebuizen voor deze stap. Laat de monsters 15 minuten in elke oplossing.
- Plaats de monsters naar de CPD (deel 4).
- Montage en prepareren sporen voor SEM observatie
- Open de enveloppen. Giet de sporen op een eerder bereide stomp met dubbelzijdig tape. U kunt ook het verzamelen van de sporen met de kleverige oppervlak van de stompen, de zorg om hen niet te verpletteren *.
- Indien de monsters paar sporen, naast de vorige stap, snijd een klein stukje van de omhulling (~ 1 mm 2) en plaats het op een nieuwe stub *.
- Plaats de weefsels in de sputter bekleder (hoofdstuk 5).
- Let op onder de SEM (hoofdstuk 6).
4. Het drogen van materiaal met behulp van een kritisch punt droger (CPD, figuur 2d)
- Gebruik de CPD in een goed geventileerde ruimte en controleer of alle kleppen van de machine zijn gesloten. Controleer of het monster kamer leeg en schoon.
- Schakel de machine en controleer of de temperatuurregeling systeem te testen gebeurt automatisch. Als de CPD een externe koeling bad systeem, controleer de waterstanden voordat u it op.
- Volg de instructies van de specifieke CPD gebruikt voor ethanol en CO 2 uitwisseling van de fabrikant. Om veiligheidsredenen, draag deze stap onder toezicht van iemand getraind voor het gebruik van de machine. Vergeet niet dat het wordt blootgesteld aan snelle veranderingen onder druk, kan het geweld blazen.
- Neem de monsters en ga verder met de stap 1.3 als het werken met plantaardige weefsels, stap 2.2 als het werken met Oömyceten cysten, en de stappen 3.2 als het werken met schimmelsporen.
5. Coating de Monsters met Gold Met behulp van de sputteren Coater (figuur 3a)
- Controleer de sputter coater. Controleer of de gouden kathode doel is in goede staat. Gebruik een niet-pluizende doek doordrenkt met 90% ethanol aan de wanden van de vacuümkamer en de kamer deksel schoon te maken als dat nodig is.
- Markeer de sputter houder nummers naast elke stomp gat voor verdere identificatie van de monsters onder de microscoop. Voorzichtig, plaats de stompjes geladen met de samples en zet ze vast. Gebruik een roterende planetaire specimen podium om een gelijkmatige coating op monsters met een onregelmatig oppervlak te garanderen.
- De instructies van de fabrikant om instellingen zoals de werkafstand, bediening gasdruk (bijvoorbeeld 5 x 10 -1 - 7 x 10 -1 mbar) (bijvoorbeeld 30 mm.), Het sputteren tijd (bijvoorbeeld 50 s), dikte van de goudlaag (bijvoorbeeld, 12 nm) de stroom (bijvoorbeeld 15 mA) en de voeding (bijvoorbeeld 600 V) 45.
- Verwijder de stubs en breng ze naar de SEM (hoofdstuk 6). Als alternatief, plaats de stubs in een afgesloten container met silicagel (figuur 2c).
Figuur 3: sputter coater (a) en scanning elektronenmicroscoop (b). (A) vooraanzicht van de vacuümkamer (links), gas valve, timer, vacuüm, en de huidige controles. (B) Zijaanzicht van de SEM hoofdcomponenten (van links naar rechts): de vacuümkolom de monsterkamer, het computerscherm met de controles en de monitor van de kamer. Foto's werden genomen door Y. Ruiz-León. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Observatie onder de Scanning Electron Microscope (SEM, figuur 3b)
- SEM opstarten
- De instructies van de fabrikant te starten en de SEM, aanpassing van de monsterhoogte doel openingsdiameter (bijvoorbeeld voor planten 2 urn en voor schimmels en oomycetes 4 pm), de voedingsspanning (bijvoorbeeld 15 kV).
- De correcte uitlijning van de elektronenbundel systeem en stel de axiale uitlijning en stigmatoren volgens de fabrikant indicaties. Pas tHij werkafstand om voldoende scherptediepte te verkrijgen.
- afbeelding vastleggen
- Hier krijg je een gerichte beeld van het monster en gebruik het als uitgangspunt. Verhoog de vergroting in de buurt van het maximale niveau en de focus van de afbeelding weer. Kies gebieden met een oppervlakte onregelmatigheden zoals gaten. Correct astigmatisme en pas de optimale contrast en de helderheid.
- Leg de SEM Afbeelding met een hoge resolutie. Gebruik de BSE detector als de afbeelding toont dat de monsters worden geladen. Zo niet, stel de SE detector. Verander de detectoren volgens de instructies van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bloemen Ontwikkeling en Bevestiging van de ontwikkelingslanden en volledig gevormd Plant Structures
Met behulp van de FAA-CPD-protocol hier beschreven, zijn jong en volwassen plant weefsels optimaal vast en uitgedroogd voor SEM beeldvorming. Processen zoals bloemontwikkeling kan worden gereconstrueerd doordat de topografie en vorm van de knoppen niet wordt verstoord door cellen krimpen (figuur 1b, 1d, 4a-f). Structuren met complexe vormen met succes kan worden bedekt met een uniforme laag van geleidend materiaal (het metaal uit de sputter coater), waardoor de terugwinning van onbereikbare gegevens (Figuren 4g-I, 5e). Goede kwaliteit beelden van de monsters afkomstig van natte micro-omgevingen, die vroeger worden overladen met de elektronenstroom als ernstig uitgedroogd en gecoat, kan worden bereikt (figuren 4f, 5a, 5b). Belangrijke details zoals de pollen wandoppervlak (Figuur 5b, 5c) en verschillende soorten indumenta (figuren 5d-g) kan worden bestudeerd in de diepte zonder kunstmatige of ongewenste deeltjes of vervormde vormen.
Figuur 4: Vroege (a, b), medio (c- e), en laat (fi) bloemen ontwikkeling in het kader van de SEM vastgelegd. (A) Tros van Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze met diverse bloemen meristemen. (B) Bovenaanzicht van een jonge tros Polygala violacea Aubl. (C) Bloemen kiem van Krameria ixine Loefl. gynoecium tijdens differentiatie. (D - e) Buds van Erythrina sp. (F) Zijaanzicht van een bloem van Krameria ixine. De helmknoppen en de stijl uitsteken. (G - i) grote wasbloem (L.) R. Brown. (
Figuur 5: SEM microfoto van sporangia en pollen (a, b), de oppervlakken (c- e) en indumenta (f - g). (A) Sporangia van Dryopteris sp. (B) Pollen van Prunus dulcis DA Webb landing op stigma. (C) Pollen van Nepenthes alata Blanco. (D) Zijaanzicht van een bloeiwijze van muurfijnstraal DC. Beeld gemaakt met een BSE-detector optie. (E) Zijaanzicht van de bryophyte Peristoma sp. (F) klieren en no-klieren trichomen op de abaxiale oppervlak van een blad van Rosmarinus officinalis L. (G) Bovenaanzicht van het blad platte schalen van Olea europaea L. Schalen: (a) 400 urn, (b) 60 urn, (c) 5 urn, (d) 4 mm, (e) 600 urn, (f) 200 urn, (g) 600 urn. Foto's werden genomen door Y. Ruiz-León. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Effect van verschillende substraten op de rug groei van secundaire cysten Saprolegnia parasitica
(tabel 1, figuur 6a). Op de koolstof en gouden roosters de stekels korter, gekruld en overvloediger groeien rond de cysten zonder vormende lussen (figuren 6b, 6d). Hoewel op koper roosters, de stekels neiging te krullen zonder looping, sommigen van hen langwerpige (figuur 6c). Op schubben, de stekels waren krullend, overvloedig rond de oppervlakte en soms gevormde lus uiteinden (figuur 6e-f).
Figuur 6: Differential groeipatronen van de stekels van Saprolegnia parasitica in cysten ondergedompeld in vloeibare media. (A) Glass. (B) Carbon. (C) koper. (D) Gold. (E) Hake schaal. (F) Salmon schaal. Straight stekels werden ontwikkeld op glas en koper, terwijl gekrulde stekels werden gevormd op koolstof, goud, en schubben. De verslaafd tips (witte pijlen) van de stekels zijn waarneembaar in alle stekels groeien op glas en in een paar stekels op schubben. De cyste muren zijn in het geel. Scale: 20 urn. Foto's werden genomen door Y. Ruiz-León en S. Rezinciuc. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Oppervlak | Spine morfologie | |
| verlenging | Loop op het puntje | |
| glazen afdekplaat | Goede rek, stekels gemakkelijk te tellen aanwezig | |
| Vissenschubben | Stekels met krullend vorm niet gemakkelijk te tellen | aanwezig |
| TEM roosters | Kort en krullend stekels niet gemakkelijk te tellen | Afwezig |
Tabel 1: Spine morfologie met verschillende soorten substraat.
Onverwachte Waarnemingen in Phellorinia herculanea f. stellata
Afgezien van de onverwachte bevinding van laticiferous schimmeldraden op de exoperidium van P. herculanea, Calonge et al. 31 gevonden bolvormig en glad verpleegkundige cellen (8-13 pm) gemengd met sporen in het materiaal gedehydrateerd met CPD dankzij de rehydratatietrap uitgevoerd in de magnetron. (Figuur 1d). De structuur en de details van de wanden van dHij verpleegkundige cellen en de sporen zijn goed bewaard gebleven, ondanks hun verschil samenstelling (figuren 1c-d).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met betrekking tot de standaard SEM protocollen, de hier gepresenteerde procedures omvatten relatief snel, gemakkelijk te volgen, en low-cost methodieken. Afhankelijk van de mate van gebruik en het gemak van de verwerking, het duurt 4-5 dagen beelden van goede kwaliteit te verkrijgen. Met inbegrip van adequate veiligheidsmaatregelen voor de CPD en SEM operatie, de procedures zijn gemakkelijk te hanteren. Bijzondere voorzichtigheid moet worden genomen met formaline en de glutaaraldehyde (zie stappen 1.1.1 tot 1.1.3 en 2.1.5 van het protocol). Er zijn bepaalde stappen, waarbij zo nodig, kan het proces worden gestopt voor een lange tijd zonder beschadiging van de monsters of ruïneren voorgaande stappen (bijvoorbeeld stap 1.1.5, 1.2.3 en 1.3.5). In termen van kosten, kan veel van de apparatuur worden gebruikt voor verscheidene preparaten (bijvoorbeeld, CPD aluminium containers en stub houders) en de reagentia niet dure chemicaliën verkrijgbaar van alle commerciële leveranciers.
Nadelen van deze proceduresde noodzaak van een goede verwijdering chemisch afval voor aldehyden en ethanol en het ontbreken van essentiële voorraden en de beperkingen van de techniek. Materialen zoals de gouden schijf voor de sputter coater en de CO 2 cilinder voor de BPR moet goed worden gecontroleerd op voorhand. Als ze in continu gebruik, zal het laboratorium meerdere bestanden daarvan, die uiteindelijk verhoogt de kosten vereist. Omdat individuele onderzoekers vaak niet de kosten afgeleid van het onderhoud van deze soort voldoende reden of ze gewoon niet nodig om de SEM continu te gebruiken, deze procedures tegenwoordig meestal worden uitgevoerd in laboratoria met externe diensten elektronenmicroscopie.
De waarneming van de SEM techniek is beperkt tot een hoge vergroting studie van oppervlakken. Als interne weefsels dienen te worden nageleefd, moeten de monsters in de juiste manier om het uiterlijk van de interne weefsels te verkennen worden gesneden. De interne aspecten van de cellen bij hoge ma verkennengnification een transmissie- elektronenmicroscoop (TEM) vereist. Kritische stappen in het protocol zijn de juiste fixatie en uitdroging van de monsters voor de CPD behandeling, waar het is van cruciaal belang om de weefsels te beschermen tegen schokkende veranderingen en direct contact met de lucht. Ook zorgvuldig beheer van de drukverandering in de CPD monsterkamer en de hoeveelheid bekleding aangebracht op verschillende soorten monsters belangrijk.
Ondanks deze beperkingen en speciale manipulaties, de studie van biologische monsters met SEM volgens de hier beschreven protocollen maakt de oplossing van enkele bekende problemen, zoals de celwand en orgel vervorming (figuren 1, 4, 5), de beperkingen op de waarneming en groei van structuren uit vochtige en vloeibare omgevingen (figuren 5, 6), en de vernietiging van gevoelige cellen (figuren 1c, 1d).
De protocollen die hier hebben allowed de herinterpretatie en ondervraging van traditionele taxonomische kenmerken, zoals de ruggengraat structuur in cysten van Saprolegnia 47. De differentiële groeipatroon van de Saprolegnia stekels op verschillende oppervlakken toont de labiliteit van deze functie en de beperkingen voor het soort diagnose. Naast het vastleggen van relevante kenmerken taxonomische studies, stadia van orgaanontwikkeling en infectieziekten, functies van weefsels nooit eerder waargenomen werden onderzocht door deze technieken. Nu kan dit protocol worden uitgebreid tot duizenden van case studies te wachten om te worden onderzocht 33. Volgens de peer-reviewed literatuur Scopus, in de laatste de afgelopen vijf jaar zijn er 7425 publicaties van papers het omgaan met SEM beeldvorming van planten (4914), Oomycetes (21) en schimmels (2490) geweest. Dit wijst erop dat het onderzoek in oomyceten met de SEM beelden is nog steeds nauwelijks ten opzichte vanplanten en schimmels. Met ESEM, de nummers zijn zelfs nog lager. Er zijn 588 handschriften in dezelfde periode: 337 in planten, in oomyceten 1 en 250 bij schimmels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit project heeft financiering ontvangen van het Horizon 2020-programma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie in het kader subsidieovereenkomst No. 634429. Deze publicatie geeft de mening van de auteur, en de Europese Commissie kan niet verantwoordelijk voor het gebruik dat kan worden gemaakt van de informatie worden gesteld daarin opgenomen. We erkennen ook de financiële bijdrage van de Real Jardín Botánico, CSIC. SR is dankbaar voor de Europese Unie [ITN-SAPRO-238550] ter ondersteuning van haar onderzoek in Saprolegnia. We willen ook Francisco Calonge bedanken voor zo vriendelijk de Phellorinia herculanea beelden en B. Pueyo voor het verwerken van monsters (Figuur 5). Alle foto's werden genomen door de SEM service aan de Real Jardín Botánico-CSIC in Madrid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
| aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
| Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D-(+)-Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| Double sided sellotape | No specific supplier | ||
| Ethanol absolute | No specific supplier | Flammable | |
| European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| Filter paper | No specific supplier | ||
| Forceps | No specific supplier | ||
| Formalin 4% | No specific supplier | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
| Glass cover slips | No specific supplier | ||
| Glass hermetic container | No specific supplier | ||
| Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| needles | No specific supplier | ||
| Petri dishes | No specific supplier | ||
| Plastic containers | No specific supplier | ||
| Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| scalpels | No specific supplier | ||
| Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
| Software for SEM | |||
| Solution A: NaH2PO4 | |||
| Solution B: Na2HPO4 | |||
| Specimen holders | No specific supplier | ||
| Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
| Stereomicroscope | No specific supplier | ||
| Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
| Tweezers | No specific supplier |
References
- Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
- Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
- Damblon, F. Sputtering, a new method of coating pollen grains in scanning electron microscopy. Grana. 15 (3), 137-144 (1975).
- Everhart, T. E., Thornley, R. F. M. Wide-band detector for micro-microampere low-energy electron currents. J. Sci. Instrum. 37 (7), 37246-37248 (1960).
- Collins, S. P., et al. Advantages of environmental scanning electron microscopy in studies of microorganisms. Microsc. Res. Techniq. 25 (5-6), 398-405 (1993).
- Fannes, W., Vanhove, M. P. M., Huyse, T., Paladini, G. A scanning electron microscope technique for studying the sclerites of Cichlidogyrus. Parasitol. Res. 114 (5), 2031-2034 (2015).
- Erbar, C., Leins, P. Portioned pollen release and the syndromes of secondary pollen presentation in the Campanulales-Asterales complex. Flora. 190 (4), 323-338 (1995).
- Jansen, S., Smets, E., Baas, P. Vestures in woody plants: a review. IAWA Journal. 19 (4), 347-382 (1998).
- Bortolin Costa, M. F., et al. Stigma diversity in tropical legumes with considerations on stigma classification. Bot. Rev. 80 (1), 1-29 (2014).
- Almeida, O. J. G., Cota-Sánchez, J. H., Paoli, A. A. S. The systematic significance of floral morphology, nectaries, and nectar concentration in epiphytic cacti of tribes Hylocereeae and Rhipsalideae (Cactaceae). Perspect. Plant Ecol. 15 (5), 255-268 (2013).
- Konarska, A. Comparison of the structure of floral nectaries in two Euonymus L. species (Celastraceae). Protoplasma. 252 (3), 901-910 (2015).
- Giuliani, C., Maleci Bini, L. Insight into the structure and chemistry of glandular trichomes of Labiatae, with emphasis on subfamily Lamioideae. Plant Syst. Evol. 276 (3-4), 199-208 (2008).
- Li, K., Zheng, B., Wang, Y., Zhou, L. L.Breeding system and pollination biology of Paeonia delavayi (Paeoniaceae), an endangered plant in the Southwest of China. Pak. J. Bot. 46 (5), 1631-1642 (2014).
- García, L., Rivero, M., Droppelmann, F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque. 36 (3), 487-496 (2015).
- Prenner, G., Klitgaard, B. B. Towards unlocking the deep nodes of Leguminosae: floral development and morphology of the enigmatic Duparquetia orchidacea (Leguminosae, Caesalpinioideae). Am. J. Bot. 95 (11), 1349-1365 (2008).
- Ratnayake, K., Joyce, D. C., Webb, R. I. A convenient sample preparation protocol for scanning electron microscope examination of xylem-occluding bacterial biofilm on cut flowers and foliage. Sci. Hortic-Amsterdam. 140 (1), 12-18 (2012).
- Çolak, G., Celalettin Baykul, M., Gürler, R., Çatak, E., Caner, N. Investigation of the effects of aluminium stress on some macro and micro-nutrient contents of the seedlings of Lycopersicon esculentum Mill. by using scanning electron microscope. Pak. J. Bot. 46 (1), 147-160 (2014).
- Arafa, S. Z. Scanning electron microscope observations on the monogenean parasite Paraquadriacanthus nasalis from the nasal cavities of the freshwater fish Clarias gariepinus in Egypt with a note on some surface features of its microhabitat. Parasitol. Res. 110 (5), 1687-1693 (2012).
- Uppalapatia, S. R., Kerwinb, J. L., Fujitac, Y. Epifluorescence and scanning electron microscopy of host-pathogen interactions between Pythium porphyrae (Peronosporales, Oomycota)and Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta). Bot. Mar. 44 (2), 139-145 (2001).
- Meaney, M., Haughey, S., Brennan, G. P., Fairweather, I. A scanning electron microscope study on the route of entry of clorsulon into the liver fluke, Fasciola hepatica. Parasitol. Res. 95 (2), 117-128 (2005).
- Sundarasekar, J., Sahgal, G., Subramaniam, S. Anti-candida activity by Hymenocallis littoralis extracts for opportunistic oral and genital infection Candida albicans. Bangladesh J. Pharmacol. 7 (3), 211-216 (2012).
- Benhamou, N., Rey, P., Picard, K., Tirilly, Y. Ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction between the mycoparasite Pythium oligandrum and soilborne plant pathogens. Phytopathology. 89 (6), 506-517 (1999).
- Singh, A., et al. First evidence of putrescine involvement in mitigating the floral malformation in mangoes: A scanning electron microscope study. Protoplasma. 251 (5), 1255-1261 (2014).
- Xiang, C., et al. Fine mapping of a palea defective 1 (pd1), a locus associated with palea and stamen development in rice. Plant Cell Rep. 34 (12), 2151-2159 (2015).
- Mendoza, L., Hernandez, F., Ajello, L. Life cycle of the human and animal oomycete pathogen Pythium insidiosum. J. Clin. Microbiol. 31 (11), 2967-2973 (1993).
- Bello, M. A., Rudall, P. J., González, F., Fernández, J. L. Floral morphology and development in Aragoa (Plantaginaceae) andrelated members of the order Lamiales. Int. J. Plant Sci. 165 (5), 723-738 (2004).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral morphology and development in Quillajaceae and Surianaceae (Fabales), the species-poor relatives of Leguminosae and Polygalaceae. Ann. Bot. 100 (4), 1491-1505 (2007).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral ontogeny in Polygalaceae and its bearing on the homologies of keeled flowers in Fabales. Int. J. Plant Sci. 171 (5), 482-498 (2010).
- Bello, M. A., Alvarez, I., Torices, R., Fuertes-Aguilar, J. Floral development and evolution of capitulum structure in Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae). Ann. Bot. 112 (8), 1597-1612 (2013).
- Bello, M. A., Martínez-Asperilla, A., Fuertes-Aguilar, J. Floral development of Lavatera trimestris and Malva hispanica reveals the nature of the epicalyx in the Malva generic alliance. Bot. J. Linn. Soc. 181 (1), 84-98 (2016).
- Calonge, F. D., Martínez, A. J., Falcó, I., Samper, L. E. Phellorinia herculanea f. stellata f. nova encontrada en España. Bol. Soc. Micol.Madrid. 35 (1), 65-70 (2011).
- Liu, Y., et al. Deciphering microbial landscapes of fish eggs to mitigate emerging diseases. ISME J. 8 (10), 2002-2014 (2014).
- Sandoval-Sierra, J. V., Diéguez-Uribeondo, J. A comprehensive protocol for improving the description of Saprolegniales (Oomycota): two practical examples (Saprolegnia aenigmatica sp. nov. and Saprolegnia racemosa sp. nov.). PLOS one. , (2015).
- Endress, P. K. Zur vergleichenden Entwicklungsmorphologie, Embryologie und Systematik bei Laurales. Bot. Jahrb. Syst. 92 (2), 331-428 (1972).
- Tucker, S. Floral development in Saururus cernuus (Saururaceae):1. Floral initiation and stamen development. Am. J. Bot. 62 (3), 993-1005 (1975).
- Endress, P. K., Matthews, M. L. Progress and problems in the assessment of flower morphology in higher-level systematics. Plant Syst. Evol. 298 (2), 257-276 (2012).
- Beakes, G. W., Glockling, S. L., Sekimoto, S. The evolutionary phylogeny of the oomycete "fungi". Protoplasma. 249 (1), 3-19 (2012).
- Romansic, J. M., et al. Effects of the pathogenic water mold Saprolegnia ferax on survival of amphibian larvae. Dis. Aquat. Organ. 83 (3), 187-193 (2009).
- van West, P. Saprolegnia parasitica, an oomycete pathogen with a fishy appetite: new challengues for an old problem. Mycologist. 20 (3), 99-104 (2006).
- Johansen, D. A. Plant microtechnique. , McGrow-Hill. New York. (1940).
- Unestam, T. Studies on the crayfish plague fungus Aphanomyces astaci. Some factors affecting growth in vitro. Physiol. Plantarum. 18 (2), 483-505 (1965).
- Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence from isolated spore cysts of Aphanomyces astaci. Exp. Mycol. 8 (4), 370-377 (1984).
- Diéguez-Uribeondo, J., Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence in Saprolegnia parasitica. Mycol. Res. 98 (7), 810-815 (1994).
- Söderhäll, K., Svensson, E., Unestam, T. Chitinase and protease activities in germinating zoospore cysts of a parasitic fungus, Aphanomyces astaci, Oomycetes. Mycopathologia. 64 (1), 9-11 (1978).
- Echlin, P. Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-Ray Microanalysis. , Springer Science + Business Media, LLC. NY. (2009).
- Osumi, M., et al. Preparation for observation of fine structure of biological specimens by high-resolution SEM. Microscopy. 32 (4), 321-330 (1983).
- Rezinciuc, S. The Saprolegniales morpho-molecular puzzle: an insight into markers identifying specific and subspecific levels in main parasites. , Universidad Internacional Menéndez Pelayo. Doctoral Thesis (2013).
