Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.
Veel voorkomende problemen bij de verwerking van biologische monsters voor observaties met de scanning elektronenmicroscoop (SEM) waartoe cel instorten van de monsters uit natte micro-omgevingen en celvernietiging. Met behulp van jonge bloemen weefsels, oömyceet cysten, en schimmels sporen (Agaricales) als voorbeeld, specifieke protocollen om delicate monsters worden hier beschreven dat een aantal van de belangrijkste uitdagingen in de steekproef behandeling voor het vastleggen van beelden onder de SEM overwinnen verwerken.
Bloemen meristemen met FAA vaste (formaline Acetic-Alcohol) en verwerkt met het kritische punt Droger (CPD) niet weer te geven ingestort celwanden of vervormd organen. Deze resultaten zijn van cruciaal belang voor de wederopbouw van bloemen ontwikkeling. Een soortgelijke CPD gebaseerde behandeling van monsters van natte micro-omgevingen, zoals glutaaraldehyde gefixeerd oomycete cysten, optimaal van de differentiële groei van diagnostische kenmerken (bijvoorbeeld de cyste stekels) op verschillende soorten su testenbstrates. Vernietiging van de verpleegkundige cellen bevestigd aan schimmelsporen werd vermeden na rehydratatie, uitdroging, en de CPD behandeling, een belangrijke stap voor de verdere functionele studies van deze cellen.
De protocollen hier beschreven vertegenwoordigen goedkope en snelle alternatieven voor het verwerven van goede kwaliteit afbeeldingen om groeiprocessen te reconstrueren en diagnostische kenmerken te bestuderen.
In de biologie is het gebruik van scanning elektronenmicroscopie (SEM) uitgebreid studies van structurele ontwikkeling, vergelijkende morfologie orgaanontwikkeling en karakterisatie van populaties of soorten 1. Met zijn twee-dimensionale weergave van microscopische structuren, gebieden zoals micromorfologie en systematiek profiteerde van SEM techniek vooruitgang sinds de tweede helft van de 20e eeuw. Bijvoorbeeld, de introductie van de sputter coating methode in 1970 mogelijk gemaakt opmerkingen van delicate stoffen zoals uiteinden van scheuten en bloemen verbeteren van de beeldvorming van de niet-geleidende weefsel 2, 3. SEM gebruikt elektronen van het oppervlak van het monster uitgeworpen de topografie reproduceren in een hoog vacuüm omgeving 4.
Studies waarbij SEM zijn gericht op zowel de gevolgtrekking van de structurele personages en de reconstructie van growth processen. Nieuwe structurele personages om de taxonomie relevante en systematiek van een breed scala van organismen zijn ontdekt van SEM waarnemingen. Bijvoorbeeld, planteigenschappen gebruikt voor soorten diagnose of supraspecific classificaties, zoals de bekledend kuilen van hout 5, stigma diversiteit 6, nectarklier en florale morfologie 7, 8, trichoom gegevens 9 en stuifmeelkorrels 10, 11, niet goed kan worden zonder zichtbaar SEM. Succesvolle waarnemingen met conventionele SEM werden ook bereikt voor de lange tijd in formaline gefixeerde organismen 12 en planten herbariumspecimens 13.
Aan de andere kant, studies van de wederopbouw van groeiprocessen met behulp van SEM omvatten een breed scala aan onderwerpen, zoals orgel ontwikkeling 14, InfeCTIES veroorzaakt door bacteriën 15, plantenwortel fysiologie 16, parasiet-gastheer hechtmechanieken 17, 18, effecten van geneesmiddelen op parasieten 19, mycoparasitisme en antibiotische 20, 21, de groei misvorming 22, vergelijkende ontwikkeling van de wilde en mutante individuen 23, en de gehele levenscyclus 24. Hoewel milieu-scanning elektronenmicroscopen (ESEM) 25 belangrijke voordelen kan hebben voor de observatie van natte biologische monsters in groeiprocessen, kan delicate materiaal nog steeds in gevaar worden gebracht, zelfs in de lage vacuüm toestand van de ESEM), en moeten adequaat worden verwerkt om verlies te voorkomen waardevolle morfologische observatie.
In dit artikel een overzicht van specifieke protocollen voor SEM waarneming van drie diffErent soorten monsters wordt gepresenteerd: bloemen meristemen, oömyceten (Saprolegnia), en schimmels materiaal. Deze protocollen samen te stellen van de ervaring van onze vorige SEM-gebaseerde studies 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, waar de specifieke problemen en alternatieve oplossingen zijn gevonden. Bij installaties vergelijkende ontwikkelings- en structurele studies, het gebruik van SEM begon in 1970 34, 35, en sindsdien onderzoekers ontdekt dat bepaalde bloem karakteristieken labieler dan gedacht 36. Reconstructie van bloemen ontwikkeling betreft het vangen van alle stadia tussen jong bloemen meristemen en de bloei. Om dit doel te bereiken, is het essential dat het monster topografie en de celwand integriteit niet in het gedrang na de vastlegging en de daaropvolgende uitdroging. Jonge bloemen meristemen zijn bijzonder kwetsbaar voor celwand instorten (figuren 1a, 1b). Ook delicate structuren zoals nectariën, bloemblaadjes, stigma en sporangia vereisen effectieve en undamaging protocollen. Deze beoordeling geeft een overzicht van een optimale protocol voor jonge en delicate weefsel intact SEM beeldvorming te houden.
Bij de Oomyceten (Stramenopiles) -on van de meest diverse en wijdverspreide groepen parasieten, met systemen die variëren van microben en planten invertebraten en vertebraten 37 – er sporen die groeien en ontwikkelen in een vochtige omgeving. Deze voorwaarde vormt een uitdaging voor SEM observatie, omdat de sporen een adequate ondergrond niet geschikt voor standaard SEM protocollen nodig. Onder de Oomyceten, soorten Saprolegnia van bijzonder belang omdat ze can ernstige vermindering van aquaculturen, visserij en amfibieën bevolkingsgroepen 38. Micromorfologische kenmerken, zoals de haakvormige stekels van cysten, zijn gevonden nuttig soorten Saprolegnia, dat fundamenteel is voor infectie controles en mogelijke behandelingen 39 vast te identificeren. Hier is er een experimentele protocol om de patronen van de wervelkolom groei cysten op verschillende substraten te vergelijken en om het monster voor kritische punt droger (CPD) bereiding en daaropvolgende SEM waarneming manipuleren.
In een derde geval zijn er interessante bevindingen dat na een inspectie van de sporen van de schimmels Phellorinia herculanea f kwam. stellata f. nova (Agaricales) 31. Samen met de sporen, een groep onverwachte kwekerij cellen werd geïdentificeerd onder SEM. Met eerdere traditionele protocollen en onbehandeld materiaal, kwam de verpleegkundige cellen out stortte in (figuur 1c). Verdere conclusies over bepaalde weefsels geassocieerd met de sporen kan worden gemaakt met eenvoudige maar essentiële aanpassingen aan de standaardbenaderingen beschreven (figuur 1d).
In deze beoordeling zijn er gedetailleerde SEM protocollen die kunnen worden gebruikt om te gaan met verschillende problemen met SEM waarneming in angiospermen, Oomycetes en Agaricales, zoals mobiele collaps en meristeemweefsel krimpen, niet-optimale groei cyste stekels en vernietiging van efemere weefsels, respectievelijk.
Figuur 1: Vergelijking van monsters behandeld zonder (a, c) en (b, d) protocol FAA-ethanol-CPD. (A – b) Floral knoppen van Anacyclus clavatus, mid-ontwikkeling. Knop behandeld met osmiumtetroxide 46 </ sup> (a) en Bud behandeld met de FAA-CPD-protocol (b). (C – d) Verpleegkundige cellen met sporen van Phellorinia herculanea f. stellata. Gedroogde monsters zonder enige behandeling (c) en het protocol beschreven voor Agaricales (d). Sporen in oranje. Schalen: (ab) 100 micrometer, (cd) 50 micrometer. Foto's werden genomen door Y. Ruiz-León. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Met betrekking tot de standaard SEM protocollen, de hier gepresenteerde procedures omvatten relatief snel, gemakkelijk te volgen, en low-cost methodieken. Afhankelijk van de mate van gebruik en het gemak van de verwerking, het duurt 4-5 dagen beelden van goede kwaliteit te verkrijgen. Met inbegrip van adequate veiligheidsmaatregelen voor de CPD en SEM operatie, de procedures zijn gemakkelijk te hanteren. Bijzondere voorzichtigheid moet worden genomen met formaline en de glutaaraldehyde (zie stappen 1.1.1 tot 1.1.3 en 2….
The authors have nothing to disclose.
Dit project heeft financiering ontvangen van het Horizon 2020-programma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie in het kader subsidieovereenkomst No. 634429. Deze publicatie geeft de mening van de auteur, en de Europese Commissie kan niet verantwoordelijk voor het gebruik dat kan worden gemaakt van de informatie worden gesteld daarin opgenomen. We erkennen ook de financiële bijdrage van de Real Jardín Botánico, CSIC. SR is dankbaar voor de Europese Unie [ITN-SAPRO-238550] ter ondersteuning van haar onderzoek in Saprolegnia. We willen ook Francisco Calonge bedanken voor zo vriendelijk de Phellorinia herculanea beelden en B. Pueyo voor het verwerken van monsters (Figuur 5). Alle foto's werden genomen door de SEM service aan de Real Jardín Botánico-CSIC in Madrid.
Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
D (+) Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
Double sided sellotape | No specific supplier | ||
Ethanol absolute | No specific supplier. | Flammable | |
European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
Filter paper | No specific supplier | ||
Forceps | No specific supplier | ||
Formalin 4% | No specific supplier. | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
Glass cover slips | No specific supplier | ||
Glass hermetic container | No specific supplier | ||
Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
needles | No specific supplier | ||
Petri dishes | No specific supplier | ||
Plastic containers | No specific supplier | ||
Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
scalpels | No specific supplier | ||
Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
Software for SEM | |||
Solution A: NaH2PO4 | |||
Solution B: Na2HPO4 | |||
Specimen holders | No specific supplier | ||
Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
Stereomicroscope | No specific supplier | ||
Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
Tweezers | No specific supplier |