Abstract
Häufige Probleme bei der Verarbeitung von biologischen Proben für Beobachtungen mit dem Rasterelektronenmikroskop (SEM) umfassen Zellkollaps, Behandlung von Proben aus nassen Mikroumgebungen und Zellzerstörung. Mit jungen Blütengewebe, oomycete Zysten und Pilzsporen (Agaricales) als Beispiele spezielle Protokolle empfindliche Proben zu verarbeiten hier beschrieben werden, die einige der wichtigsten Herausforderungen in der Probenbehandlung für die Bilderfassung unter dem SEM überwinden.
Floral meristems mit FAA fixiert (Formalin-Acetic-Alkohol) und mit dem kritischen Punkt Dryer (CPD) verarbeitet nicht Zellwände oder verzerrt Organe kollabiert Display. Diese Ergebnisse sind von entscheidender Bedeutung für die Rekonstruktion der Blütenentwicklung. Eine ähnliche CPD-basierte Behandlung von Proben aus nassen Mikroumgebungen, wie beispielsweise die mit Glutaraldehyd fixierten Oomyceten Zysten ist optimal die differentielle Wachstum von diagnostischen Eigenschaften zu testen (beispielsweise die Zyste Stacheln) auf verschiedenen Arten von substrates. Die Zerstörung der Nährzellen an Pilzsporen wurde nach Rehydrierung vermieden, Dehydrierung und der CPD-Behandlung, ein wichtiger Schritt für die weitere funktionelle Studien dieser Zellen.
Die Protokolle detailliert hier repräsentieren preiswerte und schnelle Alternativen für den Erwerb von qualitativ gute Bilder Wachstumsprozesse zu rekonstruieren und diagnostischen Eigenschaften zu studieren.
Introduction
In der Biologie ist die Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Untersuchungen von Strukturentwicklung erweitert, vergleichende Morphologie, Organentwicklung und Charakterisierung von Populationen oder 1 - Arten. Mit seiner zweidimensionalen Ansicht von mikroskopischen Strukturen, Bereiche wie Mikromorphologie und Systematik profitierte von SEM - Technik Fortschritte seit der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts. Beispielsweise hat die Einführung der Sputter - Beschichtungsmethode in den 1970er Jahren möglich , Beobachtungen von empfindlichen Materialien wie Spross Scheiteln und Blüten der Abbildungs aus nichtleitendem Geweben verbessern 2, 3. SEM verwendet von der Oberfläche der Probe emittierten Elektronen , die Topographie in einer Hochvakuumumgebung 4 zu reproduzieren.
Studien SEM werden, die sowohl in der Ableitung von Struktur Zeichen konzentriert und den Wiederaufbau von growth Prozesse. Neue strukturelle Zeichen relevant für die Taxonomie und Systematik von einem breiten Spektrum von Organismen wurden aus SEM Beobachtungen entdeckt. Zum Beispiel Pflanzeneigenschaften für Arten , Diagnose oder supraspecific Klassifikationen, wie die Verzierte Tüpfel aus Holz 5, Stigma Vielfalt 6, nectary und floralen Morphologie 7, 8, trichome Details 9 und Pollenkörner 10 werden richtig sichtbar, 11, kann nicht verwendet werden , ohne SEM. Erfolgreiche Beobachtungen mit konventionellen SEM wurden für Langzeit Formalin fixierten Organismen 12 und Anlage Herbarbelege 13 auch erreicht.
Auf der anderen Seite, Studium der Rekonstruktion von Wachstumsprozessen REM umfassen ein breites Spektrum von Themen wie Organentwicklung 14, infections induziert durch Bakterien 15, Pflanzenwurzel Physiologie 16, Parasit-Wirt - Befestigungsmechanismen 17, 18, Arzneimittelwirkungen auf Parasiten 19, Mycoparasitismus und antibiotische 20, 21, Wachstum Malformation 22, vergleichende Entwicklung von wild und mutierten Individuen 23 und gesamten Lebenszyklus 24. Obwohl Umwelt Rasterelektronenmikroskope (ESEM) 25 wichtige Vorteile für die Beobachtung von nassen biologischen Proben in Wachstumsprozesse haben können, können empfindliche Material noch einmal in dem Niedervakuumzustand des ESEM) beeinträchtigt werden, und muss ausreichend Verlust zu vermeiden verarbeitet werden von wertvollen morphologischen Beobachtung.
In diesem Papier, eine Überprüfung der spezifischen Protokolle für die SEM-Beobachtung von drei diffErent Probentypen vorgestellt: Blumen Meristeme, Oomyceten (Saprolegnia) und Pilzmaterial. Diese Protokolle kompilieren die Erfahrung unserer bisherigen SEM-basierten Studien 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, in denen besondere Schwierigkeiten und alternative Lösungen gefunden. Im Falle von Pflanzenvergleichs Entwicklungs- und Strukturstudien begann die Verwendung von SEM in den 1970er Jahren 34, 35, und seitdem entdeckten Forscher , dass bestimmte Blumen Merkmale labiler sind als bisher 36 gedacht. Die Rekonstruktion der Blütenentwicklung beinhaltet die Erfassung aller Stufen zwischen jungen Blumen Meristeme und anthesis. Um dieses Ziel zu erreichen, ist es Essential dass die Probentopographie und der Zellwandintegrität werden nach der Fixierung und nachfolgende Dehydratisierung nicht beeinträchtigt wird. Junge Blumen Meristeme sind besonders anfällig für Zellwand Zusammenbruch (1a, 1b). In ähnlicher Weise empfindliche Strukturen wie Nektarien, Blütenblätter, Stigmata und Sporangien erfordern effektive und undamaging Protokolle. Diese Übersicht fasst ein optimales Protokoll junge und empfindliche Gewebe intakt für SEM-Bildgebung zu halten.
Im Falle der Oomyceten (Stramenopiles) -on der vielfältigsten und weit verbreiteten Gruppen von Parasiten, die mit den Hosts von Mikroben und Pflanzen zu wirbellosen Tieren und Wirbeltieren im Bereich 37 - gibt es Sporen, die in einer feuchten Umgebung wachsen und sich entwickeln. Diese Bedingung stellt eine Herausforderung für SEM-Beobachtung, da die Sporen ein ausreichendes Substrat nicht geeignet für Standard-SEM-Protokolle benötigen. Unter den Oomyceten - Arten Saprolegnia sind von besonderem Interesse , weil sie caverursachen n erheblichen Kürzung der Aquakultur, Fischerei und Amphibienpopulationen 38. Mikromorphologische Eigenschaften, wie die Hakenstacheln von Zysten, haben sich als nützlich erwiesen Arten von Saprolegnia zu identifizieren, die von grundlegender Bedeutung ist , um Infektionskontrollen und mögliche Behandlungen 39 herzustellen. Hier gibt es ein Versuchsprotokoll, um die Muster der Wirbelsäule Wachstum von Zysten auf verschiedenen Substraten zu vergleichen und die Probe für die kritischen Punkt Trockner (CPD) Herstellung und anschließende SEM Beobachtung zu manipulieren.
In einem dritten Fall gibt es interessante Erkenntnisse , die nach einer Inspektion der Sporen der Pilze Phellorinia herculanea f kam. stellata f. nova (Agaricales) 31. Zusammen mit den Sporen, wurde eine Gruppe von unerwarteten nursery Zellen unter dem SEM identifiziert. Bei früheren traditionellen Protokollen und unbehandeltem Material, kamen die Nährzellen out vollständig zusammengebrochen (Abbildung 1c). Weitere Rückschlüsse insbesondere auf die Sporen dazugehörigen Gewebe kann mit den einfachen , aber entscheidenden Änderungen an den Standardansätze hier (Abbildung 1d) beschrieben , hergestellt werden.
In dieser Bewertung gibt es detaillierte SEM-Protokolle, die mit unterschiedlichen Problemen verwendet werden können, mit SEM-Betrachtung bei Angiospermen, Oomyceten und Agaricales, wie Zellkollaps und Meristemgewebe Schrumpfung, nicht das optimale Wachstum von Zysten Stacheln und Zerstörung fertig zu werden ephemeren Gewebe, respectively.
Abbildung 1: Vergleich von Proben behandelt , ohne (a, c) und mit (b, d) das Protokoll FAA-Ethanol-CPD. (A - b) Blumenknospen von Keulen-Bertram, Mid-Entwicklung. Bud mit Osmiumtetroxid behandelt 46 </ sup> (a) und Knospe mit der FAA-CPD - Protokoll (b) behandelt. (C - d) Krankenschwester Zellen mit Sporen von Phellorinia herculanea f. stellata. Getrocknete Proben ohne Behandlung (c) und mit dem Protokoll hier für Agaricales beschrieben (d). Spores in Orange. Waage: (ab) 100 & mgr; m (cd) 50 & mgr; m. Fotos wurden von Y. Ruiz-León genommen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HINWEIS: Dieses Protokoll enthält sechs Hauptbereiche, drei gewidmet bestimmte Organismen (Abschnitte 1-3), und drei der Beschreibung der Verfahren, die für alle (4-6). Sternchen (*) zeigen Schritte, die von den Experimentatoren modifiziert.
1. Studium der Entwicklung und Voll baulichen Anlagen Formed
- Sammlung und Fixierung
- Wenn das Pflanzenmaterial in einem Ort ohne Zugang zu einem Abzug gesammelt wird, einführen und das Material in 70% Ethanol in Zentrifugenröhrchen eintauchen. Idealerweise tauchen Sie das Material nach 48 h in FAA (Schritte 1.1.1-1.1.3) übermäßige Dehydratisierung in Ethanol zu vermeiden. Wenn ein Abzug auf das Pflanzenmaterial zugänglich ist, ignorieren Sie diesen Schritt und fahren Sie mit 1.1.1.
- Bereiten Sie die Formalin-Essigsäure-Alkohol (FAA) Fixiermittel in einem Abzug mit einem Aldehyd-Filter ausgestattet. Mit 85 Teilen 70% denaturiertem Ethanol, 10 Teile 60% ige Formaldehydlösung und 5 Teilen Eisessig. Bereiten Sie die FAAkurz bevor das Material, die als langfristige Lagerung Befestigung ist nicht mehr als 40 empfohlen.
- Unter dem Abzug, gießen Sie den Bestand der FAA in einzelne Breit Mund und auslaufsicher Kunststoff-Flaschen. Verwenden Sie so viele Flaschen wie es Proben zur Verfügung, und erstellen Sie Etiketten für die Probenidentifikation.
- Wählen Sie die Blumen- oder vegetative meristems zu beheben, um sicherzustellen, dass sie nicht von Insekten beschädigt sind, Pilze oder extreme Wetterbedingungen. Schneiden Sie die Zweige, das Entfernen von unerwünschtem Material, und legen Sie die Probe sofort in der FAA Lösung.
- Nach 72-96 h, gießen Sie die FAA in einen Plastikbehälter für die chemische Verfügung. Sofort, waschen Sie die Proben dreimal mit frischem 70% Ethanol restliche FAA zu entfernen. Festmaterial kann auf unbestimmte Zeit in 70% Ethanol aufbewahrt werden.
- Dissection und Dehydration
- Präparieren Sie die feste Material in 70% Ethanol unter dem Stereomikroskop ultrafeinen Pinzette, neEdles, Pinzetten, Pinsel und Mikro-Skalpelle (die maximale Größe des Gewebes sollte etwa 1 cm 3 oder 2 cm für Flachmaterial sein). Präparieren der Proben in eine Petrischale mit Ethanol bedeckt das Gewebe vor dem Austrocknen zu verhindern. Verwenden Sie eine Petrischale mit der Basis mit trockenem schwarzem Silikon bedeckt, um besser die kontrastierenden weißen Gewebe zu sehen.
- Setzen Sie den sezierten Material in die Probenbehälter für den kritischen Punkt Trockner (CPD, Abbildung 2a). An dieser Stelle tauchen die Behälter in die Petrischale mit 70% Ethanol, und umfassen die Probenidentifikationsetiketten (hergestellt mit Papier und Bleistift). Für eine effektivere Trocknung zur weiteren Manipulation, vermeiden Sie die junge und reife Proben in demselben Behälter mischen. *
- Setzen Sie den Deckel auf den Behältern und deponieren sie in Plastikzentrifugenröhrchen mit reichlich 70% Ethanol. Lagern Sie die Röhrchen über Nacht, wenn das Material nicht sofort verarbeitet wird.
- Übertragen Sie das sezierte Material durch die folgende Ethanol series in hermetischen Gläsern oder Zentrifugenröhrchen: 70%, 90%, 100% und 100%. Lassen Sie die Proben in jeder Lösung für 1 h mindestens. Halten Sie die Proben über Nacht in einer 100% igen Ethanollösung.
- Übertragen Sie die Behälter mit dem Material der BPR (Abschnitt 4).
- Montage und Herstellung von Pflanzengeweben für SEM - Beobachtung
- Schreiben Sie die Probenidentifikationsnummer unter den SEM - Probenhalter (dh Aluminium - Stubs). Decken Sie die Oberseite der Stümpfe mit einem doppelseitigen Klebeband. Platzieren Sie den Stummel in einen Probenhalter (Abbildung 2b).
- Unter einem Stereomikroskop, öffnen Sie sorgfältig die Behälter, die jungen und empfindlichen Proben tragen bereits in der CPD getrocknet. Beachten Sie, dass nach der CPD-Behandlung, die Proben werden leichter und empfindlich gegenüber Elektrostatik. Schließen der Behälter, nachdem die Proben wurden Staub oder Verunreinigungen zu vermeiden entnommen.
- Legen Sie die Proben auf der klebrigen Oberfläche der Stubs, vorausschauende Planung der gewünschtePosition (sobald die Proben, die die Oberfläche berühren, ist es sehr schwierig ist, sie zu entfernen). Versuchen Sie nicht, eine große Dissektion an dieser Stelle zu tragen; nur unerwünschtes Gewebe zu entfernen, die zu holen ist einfach. Für palynologische Studien, sezieren die Antheren und öffnen sie den Pollen auf die Stümpfe zu belichten.
- Stellen lange Proben (beispielsweise 2 cm lang) wie inflorescences in der horizontalen Position. Wenn möglich, orient Proben der gleichen Struktur für polare, Seiten- und Unteransichten. Lassen Sie genügend Platz zwischen den Proben auf dem Stummel.
- Wenn die Proben nicht sofort verarbeitet werden können, halten sie über Nacht in einem hermetischen Behälter mit Kieselgel geschützt Rehydrierung (Abbildung 2c) * zu vermeiden. Bestreichen Sie die Proben unter Verwendung des Sputter-Coater und dessen Übertragung an den SEM (Abschnitte 5 und 6).
Abbildung 2: Werkzeug für die Probe manipulatiauf und Verarbeitung vor dem SEM-Beobachtung. (A) aus Stahl Probenbehälter mit Löchern versehenen Wände für die Ethanol / CO 2 Austausch in der CPD Kammer. (B) Stahlstummel in einem Kunststoffprobenhalter. (C) Glasbehälter verwendet , um die Proben vor Feuchtigkeit und Staub geschützt zu halten. An der Basis ist ein Fach für Silicagel. (D) Kritischer Punkt Trockner. In der Front befinden sich (von links nach rechts) das Manometer, den Netzschalter, der Temperaturregelung und der Temperaturanzeige. Übliche Arbeitsdruck für CO 2 ethanol Austausch ist 60 bar (800 psi). In der Spitze gibt es vier Ventile (Einlass, abtropfen lassen, Lüftungs- und Abgaskontrollen) die zentrale Probenkammer flankieren. Fotos wurden von Y. Ruiz-León und MA Bello genommen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Wachsende und Fixieren der Zysten
- Bereiten Sie Pepton und Glucose (PG-l) Medien 41 unter Verwendung von D - (+) - Glucose (6 g) und mykologische Pepton (3 g) *. Fügen Sie bis zu 900 ml Leitungswasser und im Autoklaven 40 min bei 121 ° C. Pour 50 ml der zuvor autoklavierten Lösung A (NaH 2 PO 4, 0,13 M) und 50 ml Lösung B (Na 2 HPO 4, 0,13 M).
- Aus Stammkulturen von Stämmen von Saprolegnia parasitica auf Pepton gehalten, Glucose, Agar - Medien (PGA, die als PG-l hergestellt wird , jedoch unter Zugabe von 10 g der europäischen bakteriologischer Agar auf die Glucose und Pepton vor Autoklav), Myzelien Kolonien in 0,5 ml wachsen von PG-l-Tröpfchen für 24-48 h bei 20 ° C in Petrischalen. Sporulation induziert, indem die Myzelien mit autoklaviertem Leitungswasser dreimal Waschen und Inkubieren sie für 15 h bei 20 ° C= "Xref"> 42, 43.
- Sammeln Sie die freigesetzten sekundären Zoosporen durch sanft den oberen Teil der Suspension pipettiert und bündeln sie in 1-ml-Portionen. Rühre kräftig die Zoosporen für 30 s durch Verwirbelung 44 sekundäre Zysten zu erzeugen.
- Um das Differential Wachstum der Stacheln der Zysten zu testen, auf separaten Petrischalen (p60), legte 0,5 ml der sekundären Zyste Suspension auf verschiedenen Oberflächen (dh Kohlenstoff, Gold und Kupfer TEM Grids, Lachs und Seehecht Fischschuppen (früher gebleicht) und Glasplättchen) *. Inkubieren der Zysten bei 20 ° C für 70 min, das die Befestigung der Zysten an der Oberfläche begünstigt.
- Entfernen Sie die Flüssigkeit und mit 0,5 ml 2% igem Glutaraldehyd zu jeder Oberfläche für die Fixierung der Zysten. Halten Sie die Proben bei Raumtemperatur unter einem Abzug für 1 h.
- Entfernen Sie die Glutaraldehyd und Dehydratisieren der Probe durch eine Ethanolreihe (30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%90%, 100% und 100%), Zugabe von 5 ml jeder Ethanollösung für 15 min. Nachdem in den letzten 100% igen Ethanollösung kann die Probe bis zu einem Monat in einer Schale versiegelt Petri gespeichert. In diesem Stadium sind die Proben bereit, in der CPD getrocknet werden.
- übertragen Sie sorgfältig die Gitter und die Waage aus der Petrischale mit einem Halter geeignet für die CPD (Abschnitt 4). Für diesen Schritt verwenden, um ein CPD Gitterhalter oder eine Stapelprobenhalter, die voneinander getrennten Proben halten. Nehmen Sie die Gitter und Waagen mit einer Pinzette, wenn man bedenkt, dass die Zysten an den Gittern ganze Zeit nach oben zeigen sollte. *
- Montage und Vorbereitung Zyste Proben für die SEM - Beobachtung
- Montieren Sie die Gitter und die Waage auf den Aluminium Stubs, die zuvor mit einem doppelseitigen Klebeband Kohlenstoff bedeckt waren und unter der Bezeichnung.
- Übertragen Sie die Proben mit dem Sputter-Coater (Abschnitt 5).
- Beachten Sie die Proben unter dem SEM (Abschnitt 6).
Phellorinia herculanea unter SEM
- Rehydrierung und Dehydratisierung von Sporen
- Wickeln Sie jede Probe vorsichtig mit Filterpapier, Bildung Bleistift-markierten Umschläge ~ 0,5-1 cm 2, kümmert sich nicht um sie zu vernichten. Dichten Sie das Filterpapier mit Büroklammern. Übertragen Sie die verpackten Proben in eine Petrischale und tauchen sie in 10 ml Wasser Gewebe um die Sporen zu rehydrieren.
- Unmittelbar stecken, die Proben in einer Mikrowelle (600 W für etwa 20 s). Entfernen Sie das Material, sobald das Wasser zu verdampfen beginnt, und lassen Sie es bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
- Führen Sie die Proben durch die folgenden Ethanolreihe: 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% und 100%. Je nach der Menge der Proben, einem Becher oder Zentrifugenröhrchen für diesen Schritt verwenden. Lassen Sie die Proben für 15 Minuten in jeder Lösung.
- Legen Sie die Proben auf die CPD (Abschnitt 4).
- Montage und pSporen für SEM-Beobachtung reparing
- Öffnen Sie die Umschläge. Gießen die Sporen auf einer zuvor vorbereiteten stub mit doppelseitigem Klebeband. Alternativ sammeln die Sporen mit der klebrigen Oberfläche der Stubs, wobei darauf geachtet, sie nicht * zu vernichten.
- Wenn die Proben wenige Sporen enthalten, zusätzlich zu dem vorherigen Schritt, schneiden Sie ein kleines Stück des Umschlags (~ 1 mm 2) und legen Sie es auf eine neue Stub *.
- Legen Sie das Gewebe in die Sputter-Coater (Abschnitt 5).
- Beachten Sie unter dem SEM (Abschnitt 6).
4. Trocknen des Materials Mit einem kritischen Punkt Trockner (CPD, 2d)
- Verwenden Sie die CPD in einem gut belüfteten Ort und stellen Sie sicher, dass alle Ventile der Maschine geschlossen sind. Überprüfen Sie, ob die Probenkammer leer und sauber ist.
- Maschine einschalten und prüfen, ob die Temperaturregelung Systemtest erfolgt automatisch. Wenn die CPD ein externes Kältebad System hat, überprüfen Sie die Wasserstände, bevor ich Schaltt auf.
- Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers der spezifischen CPD für die Verwendung von Ethanol und CO 2 Austausch. Zur Sicherheit tragen zu diesem Schritt unter der Aufsicht von jemandem für den Gebrauch der Maschine geschult. Denken Sie daran, dass es zu einem schnellen Druckänderungen ausgesetzt ist, es heftig blasen konnte.
- Nehmen Sie die Proben aus und fahren Sie mit dem Schritt 1.3, wenn mit Pflanzengewebe arbeitet, 2.2 Schritt, wenn mit Oomyceten Zysten zu arbeiten, und die Schritte 3.2, wenn mit Pilzsporen zu arbeiten.
5. Die Beschichtung der Proben mit Gold Mit dem Sputter Coater (Abbildung 3a)
- Überprüfen Sie die Sputter-Beschichtungsvorrichtung. Stellen Sie sicher, dass die Gold-Kathode Ziel in einem guten Zustand ist. Verwenden Sie ein fusselfreies Tuch mit 90% Ethanol getränkt, die Wände der Vakuumkammer zu reinigen und die Kammerdeckel, falls erforderlich.
- Markieren Sie die Sputter-Halter mit Nummern neben jeder Stichloch zur weiteren Identifizierung der Proben unter dem Mikroskop. Vorsichtig setzen die Stubs mit dem sampl geladenes und sichern. Verwenden Sie einen Drehplanetenprobentisch eine gleichmäßige Beschichtung an Proben mit unregelmäßigen Oberflächen zu gewährleisten.
- Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers , um Einstellungen wie der Arbeitsabstand, den Betrieb Gasdruck (zB 5 x 10 -1 - 7 x 10 -1 mbar) (zB 30 mm.), Die Sputter - Zeit (zB 50 s), Dicke der Goldschicht (zB 12 nm) der Strom (beispielsweise 15 mA) und der Spannungsversorgung (beispielsweise 600 V) 45.
- Entfernen Sie die Stubs und nehmen sie in den SEM (Abschnitt 6). Sie können auch den Stummel in einem verschlossenen Behälter mit Kieselgel (Abbildung 2c).
Abbildung 3: Sputter - Beschichtungsvorrichtung (a) und Rasterelektronenmikroskop (b). (A) Vorderansicht der Vakuumkammer (links), Gas valve, Timer, Vakuum und aktuelle Kontrollen. (B) Seitenansicht der Hauptkomponenten SEM (von links nach rechts): die Vakuumkolonne mit der Probenkammer, dem Computerbildschirm mit den Kontrollen, und die Monitorkammer. Fotos wurden von Y. Ruiz-León genommen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
6. Die Beobachtung unter dem Rasterelektronenmikroskop (REM, 3b)
- SEM starten
- Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers zu starten und die SEM einstellen, werden die Probenhöhe die Objektivöffnung Durchmesser Einstellung (zB für Pflanzen 2 & mgr; m und für Pilze und Oomyceten 4 um), die Betriebsspannung (zB 15 kV).
- Überprüfen Sie die korrekte Ausrichtung des Elektronenstrahlsystems und stellen die axiale Ausrichtung und die Stigmatoren gemäß den Herstellerangaben. Passen ter Arbeitsabstand, um eine ausreichende Tiefenschärfe zu erhalten.
- Bilderfassung
- Holen Sie sich ein scharfes Bild der Probe und verwenden Sie es als Ausgangspunkt. Erhöhen Sie die Vergrößerung der Nähe der Maximalpegel und konzentrieren sich wieder auf das Bild. Wählen Flächen mit Oberflächenunregelmßigkeiten wie Löcher. Richtig Astigmatismus und stellen Sie den optimalen Kontrast und Helligkeit.
- Nehmen Sie das SEM-Bild mit dem hochauflösenden. Verwenden Sie den BSE-Detektor, wenn das Bild zeigt, dass die Proben geladen sind. Andernfalls stellen Sie den SE-Detektor. Ändern Sie die Detektoren den Anweisungen des Herstellers folgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Floral Entwicklung und Fixierung der Entwicklung und Voll baulichen Anlagen Formed
Mit dem FAA-CPD-Protokoll hier beschrieben, junge und reife Pflanzengewebe optimal fixiert und dehydriert für SEM-Bildgebung. Prozesse wie Blütenentwicklung kann rekonstruiert werden , weil die Topographie und die Form der Knospen nicht durch Zellschrumpfungs (Figuren 1b, 1d, 4a-f) verzerrt. Strukturen mit komplizierten Formen können erfolgreich mit einer gleichförmigen Schicht aus leitendem Material (das Metall aus der Sputter - Coater) abgedeckt werden, so dass die Rückgewinnung von sonst unerreichbaren Details (Figuren 4g-I, 5e). Gute Qualität Bilder von Proben aus nassen Mikroumgebungen kommen, die verwendet werden , mit dem Elektronenstrom zu viel berechnet , wenn schlecht entwässert und beschichtet, erreicht werden kann (Figuren 4f, 5a, 5b). Wichtige Details wie die Pollenwandfläche (Figur 5b, 5c) und verschiedene Arten von indumenta (Figuren 5d-g) kann ohne künstliche oder unerwünschte Teilchen oder verzerrte Formen eingehend untersucht werden.
Abbildung 4: Früh (a, b), Mitte (c- e) und späten (fi) Blütenentwicklung unter dem SEM erfasst. (A) Raceme von Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze mit mehreren Blumen meristems. (B) Draufsicht eines jungen raceme Polygala violacea Aubl. (C) Blumenknospe von Krameria ixine Loefl. während gynoecium Differenzierung. (D - e) Knospen von Erythrina sp. (F) Seitenansicht einer Blume Krameria ixine. Die Antheren und Stil herausragen. (G - i) Hoya carnosa (L.) R. Brown. (
Abbildung 5: REM - Aufnahmen von Sporangien und Pollen (a, b), detaillierte Oberflächen (c- e) und indumenta (f - g). (A) Sporangien von Dryopteris sp. (B) Pollen von Prunus dulcis DA - Webb Landung auf Stigma. (C) Pollen von Nepenthes alata Blanco. (D) Seitenansicht eines Blütenstand von Erigeron karvinskianus DC. Bild mit BSE-Detektor Option genommen. (E) Seitenansicht des bryophyte Peristoma sp. (F) Drüsen- und nicht-glandulären Trichomen auf der abaxial Oberfläche eines Blattes von Rosmarinus officinalis L. (G) Draufsicht der Blattflachwaage von Olea europaea L. Scales: (a) 400 & mgr; m, (b) 60 & mgr; m, (c) 5 & mgr; m, (d) 4 mm, (e) 600 & mgr; m, (f) 200 & mgr; m (g) 600 & mgr; m. Fotos wurden von Y. Ruiz-León genommen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Wirkung verschiedener Substrate auf der Spine Wachstum von Sekundär Zysten Saprolegnia parasitica
(Tabelle 1, Abbildung 6a). Auf dem Kohlenstoff und Goldgitter die Stacheln sind kürzer, gekräuselt und zu wachsen mehr reichlich um die Zysten ohne Schleifen (6b, 6d) bilden. Obwohl auf Kupfergitter, neigten die Stacheln ohne Looping zu kräuseln, einige von ihnen längliche (Abbildung 6c). Auf Fischschuppen, waren die Stacheln gelockt, um die Oberfläche reichlich vorhanden und manchmal geschleift Enden gebildet (Abbildung 6e-f).
Abbildung 6: Differenzwachstumsmuster der Stacheln von Saprolegnia parasitica in in flüssigen Medien getaucht Zysten. (A) Glass. (B) Kohlenstoff. (C) Kupfer. (D) Gold. (E) Hake Skala. (F) Salmon Skala. Gerade Stacheln wurden auf Glas und Kupfer entwickelt, während gekräuselten Stacheln auf Kohlenstoff gebildet wurden, Gold und Fischschuppen. Die Hakenspitzen (weiße Pfeile) der Stacheln beobachtbar sind in allen Stacheln auf Glas und in wenigen Stacheln auf Fischschuppen wachsen. Die Zyste Wände sind gelb. Maßstab: 20 & mgr; m. Fotos wurden von Y. Ruiz-León und S. Rezinciuc genommen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Oberfläche | Spine Morphologie | |
| Verlängerung | Schleife an der Spitze | |
| Glasabdeckung | Gute Dehnung, Stacheln leicht zu zählen Geschenk | |
| Fischschuppen | Spines mit geschweiften Form nicht leicht zu zählen | Geschenk |
| TEM-Gitter | Kurz und geschweiften Stacheln nicht leicht zu zählen | Abwesend |
Tabelle 1: Spine Morphologie mit verschiedenen Arten von Substrat.
Unerwartete Beobachtungen in Phellorinia herculanea f. stellata
Neben der unerwarteten Erkenntnis von laticiferous Hyphen auf dem exoperidium von P. herculanea, Calonge et al. 31 gefunden kugelig und glatte Nährzellen (8-13 & mgr; m) mit Sporen in dem Material gemischt dehydriert mit CPD dank der Rehydrierung Schritt in der Mikrowelle durchgeführt. (Abbildung 1d). Die Struktur und die Details der Wände von ter Nährzellen und die Sporen sind gut trotz ihrer unterschiedlichen Zusammensetzung (1c-d) erhalten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In Bezug auf die Standard-SEM-Protokolle, präsentiert die Verfahren hier sind relativ schnell, einfach zu folgen, und Low-Cost-Methoden. Je nach der Menge der Proben und auf die Leichtigkeit der Verarbeitung, dauert es vier bis fünf Tage, um Bilder von guter Qualität erhalten. Einschließlich einer angemessenen Sicherheitsvorkehrungen für die CPD und SEM-Betrieb sind die Verfahren einfach zu handhaben. Besondere Vorsicht ist mit Formalin und Glutaraldehyd (siehe Schritte 1.1.1 bis 1.1.3 und 2.1.5 des Protokolls) entnommen werden. Es gibt bestimmte Schritte , in denen, falls erforderlich, kann der Vorgang für eine lange Zeit angehalten werden , ohne die Proben zu beschädigen oder vorherigen Schritten ruinieren (zB Schritte 1.1.5, 1.2.3 und 1.3.5). In Bezug auf die Kosten, kann ein großer Teil der Ausrüstung für mehrere Präparate wieder verwendet werden (zB CPD Aluminiumbehälter und Stub - Inhaber), und die Reagenzien sind nicht teure Chemikalien aus allen kommerziellen Anbietern erhältlich.
Nachteile dieser Verfahren sinddie Notwendigkeit einer angemessenen chemischen Entsorgung für die Aldehyde und das Ethanol und das Fehlen von Schlüsselmaterial und die Beschränkungen der Technik. Materialien wie die Goldplatte für die Sputter - Beschichtungsvorrichtung und der CO 2 -Flasche zur CPD sollte im Voraus überprüft werden. Wenn sie in dauerndem Gebrauch sind, wird das Labor mehrere Bestände von ihnen erfordern, die schließlich die Kosten erhöht. Da einzelne Forscher oft nicht die Kosten von der Erhaltung dieser Arten von Lieferungen abgeleitet rechtfertigen, oder sie einfach nicht brauchen, kontinuierlich die SEM zu verwenden, neigen diese Verfahren heute in Laboratorien mit externen Elektronenmikroskopie Dienste durchgeführt werden.
Die Beobachtungstechnik des SEM ist auf eine hohe Vergrößerung Untersuchung von Oberflächen. Wenn innere Gewebe zu beachten müssen, sollten die Proben in der richtigen Art und Weise geschnitten werden, um das äußere Erscheinungsbild der inneren Gewebe zu erkunden. Um zu untersuchen, interne Aspekte der Zellen bei hohen magnification, einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) erforderlich. Kritische Schritte innerhalb des Protokolls sind die richtige Fixierung und Dehydratisierung der Proben vor der CPD-Behandlung, wo es ist entscheidend, um die Gewebe sicher vor schockierende Veränderungen und den direkten Kontakt mit der Luft zu halten. Auch eine sorgfältige Verwaltung der Druckänderung in der CPD Probenkammer und die Menge der Beschichtung auf verschiedenen Arten von Proben abgeschieden ist wichtig.
Trotz dieser Einschränkungen und spezielle Manipulationen, die Untersuchung biologischer Proben mit SEM im Anschluss an die hier beschriebenen Protokolle ermöglicht die Auflösung einiger allgemeiner Probleme, wie die Zellwand und Orgel Verzerrung (1, 4, 5), die Beschränkungen für die Beobachtung und das Wachstum von Strukturen kommen aus nassen und flüssigen Umgebungen (5, 6), und die Zerstörung der empfindlichen Zellen (Figuren 1c, 1d).
Die Protokolle hier vorgestellten allowed die Umdeutung und die Befragung von traditionellen taxonomischen Eigenschaften, wie die Wirbelsäule Struktur in Zysten von Saprolegnia 47. Das Differentialwachstumsmuster der Saprolegnia Stacheln auf verschiedenen Oberflächen zeigt die Labilität dieser Funktion und seine Grenzen für Arten Diagnose. Neben der Erfassung der relevanten Merkmale für taxonomische Studien Phasen der Organentwicklung und Infektionskrankheiten, die Funktionen von Geweben beobachtet nie zuvor dank dieser Techniken erforscht. Jetzt kann dieses Protokoll erweitert werden , um Tausende von Fallstudien Warte 33 untersucht werden. Nach dem Peer-Review-Literatur-Datenbank Scopus, in der letzten in den letzten fünf Jahren hat es zu tun 7.425 Publikationen von Papieren wurden mit REM-Aufnahmen von Pflanzen (4914), Oomyceten (21) und Pilze (2490). Diese Tatsache legt nahe, dass die Forschung in Oomyceten die SEM-Bildgebung im Vergleich immer noch sehr knapp mitPflanzen und Pilzen. Mit ESEM, die Zahlen sind sogar noch niedriger. Es gibt 588 Handschriften in der gleichen Zeitspanne: 337 in Pflanzen, 1 in Oomyceten und 250 in Pilzen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dieses Projekt hat die Finanzierung von der Europäischen Union Horizont 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm unter Finanzhilfevereinbarung Nr erhielt 634429. Diese Publikation des Autors, die Ansichten reflektiert, und die Europäische Kommission kann nicht für die weitere Verwendung gehalten werden, die von den Informationen gemacht werden können, darin enthalten sind. Wir erkennen auch die finanzielle von Real Jardín Botánico, CSIC Beitrags. SR dankt der Europäischen Union [ITN-SAPRO-238550] für die Unterstützung ihrer Forschung in Saprolegnia. Wir wollen auch für bieten Francisco Calonge danken Sie bitte die Phellorinia herculanea Bilder und B. Pueyo für die Verarbeitung von Proben (Abbildung 5). Alle Bilder wurden von dem SEM-Service im Real Jardín Botánico-CSIC in Madrid genommen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
| aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
| Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D-(+)-Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| Double sided sellotape | No specific supplier | ||
| Ethanol absolute | No specific supplier | Flammable | |
| European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| Filter paper | No specific supplier | ||
| Forceps | No specific supplier | ||
| Formalin 4% | No specific supplier | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
| Glass cover slips | No specific supplier | ||
| Glass hermetic container | No specific supplier | ||
| Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| needles | No specific supplier | ||
| Petri dishes | No specific supplier | ||
| Plastic containers | No specific supplier | ||
| Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| scalpels | No specific supplier | ||
| Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
| Software for SEM | |||
| Solution A: NaH2PO4 | |||
| Solution B: Na2HPO4 | |||
| Specimen holders | No specific supplier | ||
| Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
| Stereomicroscope | No specific supplier | ||
| Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
| Tweezers | No specific supplier |
References
- Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
- Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
- Damblon, F. Sputtering, a new method of coating pollen grains in scanning electron microscopy. Grana. 15 (3), 137-144 (1975).
- Everhart, T. E., Thornley, R. F. M. Wide-band detector for micro-microampere low-energy electron currents. J. Sci. Instrum. 37 (7), 37246-37248 (1960).
- Collins, S. P., et al. Advantages of environmental scanning electron microscopy in studies of microorganisms. Microsc. Res. Techniq. 25 (5-6), 398-405 (1993).
- Fannes, W., Vanhove, M. P. M., Huyse, T., Paladini, G. A scanning electron microscope technique for studying the sclerites of Cichlidogyrus. Parasitol. Res. 114 (5), 2031-2034 (2015).
- Erbar, C., Leins, P. Portioned pollen release and the syndromes of secondary pollen presentation in the Campanulales-Asterales complex. Flora. 190 (4), 323-338 (1995).
- Jansen, S., Smets, E., Baas, P. Vestures in woody plants: a review. IAWA Journal. 19 (4), 347-382 (1998).
- Bortolin Costa, M. F., et al. Stigma diversity in tropical legumes with considerations on stigma classification. Bot. Rev. 80 (1), 1-29 (2014).
- Almeida, O. J. G., Cota-Sánchez, J. H., Paoli, A. A. S. The systematic significance of floral morphology, nectaries, and nectar concentration in epiphytic cacti of tribes Hylocereeae and Rhipsalideae (Cactaceae). Perspect. Plant Ecol. 15 (5), 255-268 (2013).
- Konarska, A. Comparison of the structure of floral nectaries in two Euonymus L. species (Celastraceae). Protoplasma. 252 (3), 901-910 (2015).
- Giuliani, C., Maleci Bini, L. Insight into the structure and chemistry of glandular trichomes of Labiatae, with emphasis on subfamily Lamioideae. Plant Syst. Evol. 276 (3-4), 199-208 (2008).
- Li, K., Zheng, B., Wang, Y., Zhou, L. L.Breeding system and pollination biology of Paeonia delavayi (Paeoniaceae), an endangered plant in the Southwest of China. Pak. J. Bot. 46 (5), 1631-1642 (2014).
- García, L., Rivero, M., Droppelmann, F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque. 36 (3), 487-496 (2015).
- Prenner, G., Klitgaard, B. B. Towards unlocking the deep nodes of Leguminosae: floral development and morphology of the enigmatic Duparquetia orchidacea (Leguminosae, Caesalpinioideae). Am. J. Bot. 95 (11), 1349-1365 (2008).
- Ratnayake, K., Joyce, D. C., Webb, R. I. A convenient sample preparation protocol for scanning electron microscope examination of xylem-occluding bacterial biofilm on cut flowers and foliage. Sci. Hortic-Amsterdam. 140 (1), 12-18 (2012).
- Çolak, G., Celalettin Baykul, M., Gürler, R., Çatak, E., Caner, N. Investigation of the effects of aluminium stress on some macro and micro-nutrient contents of the seedlings of Lycopersicon esculentum Mill. by using scanning electron microscope. Pak. J. Bot. 46 (1), 147-160 (2014).
- Arafa, S. Z. Scanning electron microscope observations on the monogenean parasite Paraquadriacanthus nasalis from the nasal cavities of the freshwater fish Clarias gariepinus in Egypt with a note on some surface features of its microhabitat. Parasitol. Res. 110 (5), 1687-1693 (2012).
- Uppalapatia, S. R., Kerwinb, J. L., Fujitac, Y. Epifluorescence and scanning electron microscopy of host-pathogen interactions between Pythium porphyrae (Peronosporales, Oomycota)and Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta). Bot. Mar. 44 (2), 139-145 (2001).
- Meaney, M., Haughey, S., Brennan, G. P., Fairweather, I. A scanning electron microscope study on the route of entry of clorsulon into the liver fluke, Fasciola hepatica. Parasitol. Res. 95 (2), 117-128 (2005).
- Sundarasekar, J., Sahgal, G., Subramaniam, S. Anti-candida activity by Hymenocallis littoralis extracts for opportunistic oral and genital infection Candida albicans. Bangladesh J. Pharmacol. 7 (3), 211-216 (2012).
- Benhamou, N., Rey, P., Picard, K., Tirilly, Y. Ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction between the mycoparasite Pythium oligandrum and soilborne plant pathogens. Phytopathology. 89 (6), 506-517 (1999).
- Singh, A., et al. First evidence of putrescine involvement in mitigating the floral malformation in mangoes: A scanning electron microscope study. Protoplasma. 251 (5), 1255-1261 (2014).
- Xiang, C., et al. Fine mapping of a palea defective 1 (pd1), a locus associated with palea and stamen development in rice. Plant Cell Rep. 34 (12), 2151-2159 (2015).
- Mendoza, L., Hernandez, F., Ajello, L. Life cycle of the human and animal oomycete pathogen Pythium insidiosum. J. Clin. Microbiol. 31 (11), 2967-2973 (1993).
- Bello, M. A., Rudall, P. J., González, F., Fernández, J. L. Floral morphology and development in Aragoa (Plantaginaceae) andrelated members of the order Lamiales. Int. J. Plant Sci. 165 (5), 723-738 (2004).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral morphology and development in Quillajaceae and Surianaceae (Fabales), the species-poor relatives of Leguminosae and Polygalaceae. Ann. Bot. 100 (4), 1491-1505 (2007).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral ontogeny in Polygalaceae and its bearing on the homologies of keeled flowers in Fabales. Int. J. Plant Sci. 171 (5), 482-498 (2010).
- Bello, M. A., Alvarez, I., Torices, R., Fuertes-Aguilar, J. Floral development and evolution of capitulum structure in Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae). Ann. Bot. 112 (8), 1597-1612 (2013).
- Bello, M. A., Martínez-Asperilla, A., Fuertes-Aguilar, J. Floral development of Lavatera trimestris and Malva hispanica reveals the nature of the epicalyx in the Malva generic alliance. Bot. J. Linn. Soc. 181 (1), 84-98 (2016).
- Calonge, F. D., Martínez, A. J., Falcó, I., Samper, L. E. Phellorinia herculanea f. stellata f. nova encontrada en España. Bol. Soc. Micol.Madrid. 35 (1), 65-70 (2011).
- Liu, Y., et al. Deciphering microbial landscapes of fish eggs to mitigate emerging diseases. ISME J. 8 (10), 2002-2014 (2014).
- Sandoval-Sierra, J. V., Diéguez-Uribeondo, J. A comprehensive protocol for improving the description of Saprolegniales (Oomycota): two practical examples (Saprolegnia aenigmatica sp. nov. and Saprolegnia racemosa sp. nov.). PLOS one. , (2015).
- Endress, P. K. Zur vergleichenden Entwicklungsmorphologie, Embryologie und Systematik bei Laurales. Bot. Jahrb. Syst. 92 (2), 331-428 (1972).
- Tucker, S. Floral development in Saururus cernuus (Saururaceae):1. Floral initiation and stamen development. Am. J. Bot. 62 (3), 993-1005 (1975).
- Endress, P. K., Matthews, M. L. Progress and problems in the assessment of flower morphology in higher-level systematics. Plant Syst. Evol. 298 (2), 257-276 (2012).
- Beakes, G. W., Glockling, S. L., Sekimoto, S. The evolutionary phylogeny of the oomycete "fungi". Protoplasma. 249 (1), 3-19 (2012).
- Romansic, J. M., et al. Effects of the pathogenic water mold Saprolegnia ferax on survival of amphibian larvae. Dis. Aquat. Organ. 83 (3), 187-193 (2009).
- van West, P. Saprolegnia parasitica, an oomycete pathogen with a fishy appetite: new challengues for an old problem. Mycologist. 20 (3), 99-104 (2006).
- Johansen, D. A. Plant microtechnique. , McGrow-Hill. New York. (1940).
- Unestam, T. Studies on the crayfish plague fungus Aphanomyces astaci. Some factors affecting growth in vitro. Physiol. Plantarum. 18 (2), 483-505 (1965).
- Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence from isolated spore cysts of Aphanomyces astaci. Exp. Mycol. 8 (4), 370-377 (1984).
- Diéguez-Uribeondo, J., Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence in Saprolegnia parasitica. Mycol. Res. 98 (7), 810-815 (1994).
- Söderhäll, K., Svensson, E., Unestam, T. Chitinase and protease activities in germinating zoospore cysts of a parasitic fungus, Aphanomyces astaci, Oomycetes. Mycopathologia. 64 (1), 9-11 (1978).
- Echlin, P. Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-Ray Microanalysis. , Springer Science + Business Media, LLC. NY. (2009).
- Osumi, M., et al. Preparation for observation of fine structure of biological specimens by high-resolution SEM. Microscopy. 32 (4), 321-330 (1983).
- Rezinciuc, S. The Saprolegniales morpho-molecular puzzle: an insight into markers identifying specific and subspecific levels in main parasites. , Universidad Internacional Menéndez Pelayo. Doctoral Thesis (2013).
