Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.
주사 전자 현미경 (SEM)으로 관찰 용 생물학적 시료를 처리 일반적인 문제는 세포 붕괴 습식 미세 환경과 세포 파괴로부터의 샘플의 처리를 포함한다. 주사 전자 현미경에서 이미지 캡처를위한 샘플 처리의 주요 과제 중 일부를 극복 여기에 설명되어 섬세한 샘플을 처리하기 위해 특정 프로토콜을 젊은 꽃 조직, 난균 강 낭종 및 예제 등의 곰팡이 포자 (주름 버섯 목) 사용.
FAA 고정 꽃 분열 조직은 (포르말린 – 기타 – 아세트산)과 중요 포인트 건조기 (CPD)으로 처리가 세포 벽이나 왜곡 기관을 축소 표시되지 않았습니다. 이러한 결과는 꽃 개발의 재건을 위해 중요하다. 예를 들면 글루 타르 알데하이드로 고정 난균 강 낭종 등의 습식 미세 환경에서 샘플 유사한 CPD 기반 치료, 스와의 다른 유형에 대한 진단 특성의 차이 성장 (예를 들어, 낭종 쪽)을 테스트하는 최적bstrates. 곰팡이 포자 부착 간호사 세포의 파괴는 재수, 탈수 및 CPD 처리, 이러한 세포의 추가 기능 연구를위한 중요한 단계 후 피해야한다.
여기에 설명 된 프로토콜은 저비용과 성장 과정을 재구성 및 진단 특성을 연구하기 위해 좋은 품질의 이미지의 취득을위한 급속 대안을 나타낸다.
생물학에서, 주사 전자 현미경을 사용 (SEM)의 구조의 진화, 비교 형태, 장기 개발, 집단 또는 종 (1)의 특성에 관한 연구로 확장되었다. 미세 구조의 두 개의 차원보기와 같은 micromorphology 및 계통 등의 분야는 20 세기 후반 이후 SEM 기술의 발전에서 이익을. 예를 들어, 1970 년대에 스퍼터 코팅 방법의 도입 비 – 전도성 조직 (2) (3)의 영상을 향상 같은 촬영 정점 꽃과 같은 민감한 물질 가능 관찰했다. SEM은 고진공 환경 4 지형 재현 시험편의 표면으로부터 방출 된 전자를 사용한다.
SEM과 관련된 연구는 구조적인 문자의 추론과 growt의 재건에 모두 초점을 맞추고있다시간 처리합니다. 새로운 구조적 분류에 관련된 문자 나 유기체의 광범위한 계통은 SEM 관찰 결과로부터 발견되었다. 예를 들어, 식물의 특성은 10, 11, 제대로없이 시각화 할 수없는 나무 5, 오명 다양성 (6), 꿀샘과 꽃 형태 7, 8, trichome 정보 9, 꽃가루 입자의 옷을 입은 피트로, 종의 진단 또는 supraspecific 분류에 사용 SEM. 기존의 SEM 성공적인 관측도 오랜 포르말린 고정 생물 (12)에 대해 달성 된 식물 식물 표본 13 표본.
한편, SEM을 사용하여 성장 과정 재구성 연구는 장기 개발 14 infe 같은 주제의 다양한 참여박테리아 (15), 식물 뿌리의 생리 (16), 기생충 – 호스트 연결 메커니즘 (17), (18), 기생충 (19), mycoparasitism 및 항균 20, 21, 성장 기형 (22), 야생 및 돌연변이 개인 (23)의 비교 개발 및 전체 수명주기에 약물 효과에 의해 유도 ctions 24. 환경 주사 전자 현미경 (ESEM) (25)의 성장 공정에서 습식 생물학적 시료의 관찰 중요한 장점을 가질 수 있지만 섬세한 재료는 아직까지도 ESEM)의 저 진공 상태에서 손상 및 손실을 방지하기 위해 적절하게 처리 할 수있다 의 가치 형태 학적 관찰.
본 논문에서는 세 DIFF의 SEM 관찰을위한 특정 프로토콜의 리뷰샘플 erent 유형이 표시됩니다 : 꽃 분열 조직, oomycetes (Saprolegnia가 번식), 및 곰팡이 소재. 이러한 프로토콜은 특정한 어려움을 대체 해법이 발견 된 이전 SEM 기반 연구 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 경험을 컴파일한다. 비교 식물 발달 및 구조 연구의 경우, SEM의 사용은 1970 (34), (35)에 시작하고, 이후, 연구자들은 특정 꽃의 기능은 이전에 36 생각보다 불안정한 것을 발견했다. 꽃 개발의 재건 젊은 꽃 분열 조직과 개화 사이의 모든 단계의 캡처를 포함한다. 이 목적을 달성하기 위해, ESSE 인샘플 지형 세포벽 무결성 정착 이후의 탈수 후 손상되지 않도록 ntial. 젊은 꽃 분열 조직 세포 벽 붕괴에 특히 취약하다 (도 1A, 1B). 마찬가지로, nectaries에, 꽃잎, 암술과 sporangia와 같은 섬세한 구조는 효과적이고 undamaging 프로토콜을 필요로한다. 이 평가는 SEM 이미징 그대로 젊고 섬세한 조직을 유지하는 최적의 프로토콜을 요약 한 것입니다.
미생물과 식물에서 무척추 동물과 척추 동물 (37)에 이르기까지 호스트와 oomycetes (Stramenopiles) 기생충의 가장 다양하고 광범위한 그룹의 온의 경우, – 성장하고 젖은 환경에서 개발 포자가있다. 포자 표준 SEM 프로토콜에 적합하지 않은 적절한 기판을 필요로하기 때문에이 조건은 SEM 관찰에 대한 도전을 나타냅니다. oomycetes 중 Saprolegnia가 번식 종은 특히 관심있는 그들은 캘리포니아 때문에N aquacultures, 어업 및 수륙 양용 인구 38 심각한 감소를 야기한다. 예컨대 낭종 후크 등뼈 같은 Micromorphological 특성, 감염 제어 및 잠재적 치료 39 설정할 근본적인 Saprolegnia가 번식의 종류를 식별하는 것이 유용한 것으로 밝혀졌다. 여기서, 다른 기판에 낭종 척추 성장의 패턴과 비교하고 임계점 건조기 (CPD) 제조 이후의 SEM 관찰 용 시료를 조작하는 실험 프로토콜이있다.
세 번째 경우에, 버섯 Phellorinia의 herculanea (F)의 포자의 검사 후에 와서 흥미로운 연구 결과가있다. stellata 바. 노바 (주름 버섯 목) 31. 함께 포자로, 예상치 못한 보육 셀 그룹은 SEM에서 확인되었다. 이전의 전통적인 프로토콜 및 치료 재료, 간호사 세포 ou는왔다t 완전히 (그림 1C)을 축소. 포자에 관련된 특정 조직에 대한 자세한 추론은 여기서 설명 (그림 1D) 표준 방식으로 간단하지만 중요한 수정을 할 수있다.
이 리뷰에서의 SEM 관찰과 관련된 다양한 문제를 해결하는 데 사용할 수있는 상세한 SEM 프로토콜이있다 피자 식물, 휴대 붕괴와 분열 조직 축소, 낭종 쪽의 비 최적의 성장, 그리고 파괴 등 oomycetes 및 주름 버섯 목, 각각 임시 조직.
그림 1 : (A, C)과과 (B, D) 프로토콜 FAA-에탄올 CPD없이 처리 된 샘플의 비교. (A – B) Anacyclus의 clavatus, 중앙 개발의 꽃 봉오리. 버드 사 산화 오스뮴 46 <처리/ SUP> (a) 및 FAA-CPD 프로토콜 (b)로 처리 새싹. (C – D) Phellorinia의 herculanea (F)의 포자와 간호사 세포. stellata. 임의의 처리 (c)없이 여기 주름 버섯 목 (d)에 기술 된 프로토콜로 샘플을 건조. 오렌지 포자. 저울 : (AB) 100 μm의 (CD) 50 μm의. 사진은 Y. 루이즈 – 레온에 의해 촬영되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표준 SEM 프로토콜에 대해, 여기에 제시된 절차는 비교적 빠른 따라하기 쉽고, 저렴한 방법 등이 있습니다. 샘플의 양 및 처리의 용이성에 따라, 양호한 품질의 이미지를 획득 4-5 일 걸린다. CPD 및 SEM 작업에 대한 적절한 안전주의 사항을 포함하는 절차는 취급이 용이하다. 특히주의 (1.1.3 및 프로토콜의 2.1.5에 단계 1.1.1 참조) 포르말린과 글루 타르 알데히드에주의해야한다. 샘플 손상 또는 이전 단?…
The authors have nothing to disclose.
이 프로젝트는 보조금 협정 제이 책은 저자의 의견을 반영 634429.에서 유럽 연합 (EU)의 호라이즌 (2020)의 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 받았고, 유럽위원회 (European Commission)가 정보로 만들어 질 수있는 사용에 대한 책임을지지 않습니다 거기에 포함. 우리는 또한 리얼 자르 딘 보타니 코, CSIC에 의한 재정 기여를 인정합니다. SR은 Saprolegnia가 번식 그녀의 연구 지원을위한 유럽 연합 (EU) [ITN-SAPRO-238550]에 감사합니다. 우리는 또한 친절에 대한 시스코 칼론 감사 샘플을 (그림 5)을 처리하기위한 Phellorinia의 herculanea 이미지와 B의 Pueyo을 제공하고자합니다. 모든 이미지는 마드리드에서 리얼 자르 딘 보타니-CSIC의 SEM 서비스에 의해 촬영되었다.
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