Abstract
Xenopus-oocyt som en heterolog expressionssystem för proteiner, beskrevs först av Gurdon et al. 1 och har i stor utsträckning använts sedan dess upptäckt (Referenser 2 - 3, och referenser däri). En egenskap som gör ägget attraktivt för utländska kanal uttryck är dålig överflöd av endogena jonkanaler 4. Detta expressionssystem har visat sig vara användbara för karakterisering av många proteiner, bland dem ligandreglerade jonkanaler.
Uttrycket av GABA A-receptorer i Xenopus oocyter och deras funktionell karakterisering beskrivs här, inklusive isolering av oocyter, microinjections med cRNA, avlägsnande av follikulära cellskikt, och snabba förändringar lösning i elektrofysiologiska experiment. Procedurerna optimerades i detta laboratorium 5,6 och avviker från de rutinmässigt används 7-9. Traditionellt är blottlagda oocyter framställesmed en långvarig kollagenas behandling av äggstocks lober vid RT, och dessa avklädda oocyter injiceras med mRNA. Med hjälp av optimerade metoder har olika membranproteiner uttryckts och studerade med detta system, såsom rekombinanta GABA A-receptorer 10-12, humana rekombinanta kloridkanaler 13, trypanosominfektion kaliumkanaler 14 och en myo-inositol transportör 15, 16.
De metoder som beskrivs här kan tillämpas på uttrycket av vilket protein som helst av val i Xenopus-oocyter, och snabb förändring av lösningen kan användas för att studera andra ligandreglerade jonkanaler.
Introduction
Xenopus-oocyter används allmänt som ett expressionssystem (Referenser 2 - 3, och referenser däri). De är kapabla att korrekt montera och införliva funktionellt aktiva multisubunit proteiner i deras plasmamembran. Med användning av detta system är det möjligt att funktionellt undersöka membranproteiner enbart eller i kombination med andra proteiner, för att studera egenskaperna hos muterade, chimära eller sammanlänkas proteiner, och för att screena potentiella läkemedel.
Fördelarna med att använda oocyter framför andra heterologa expressionssystem innefattar den enkla hanteringen av jätteceller, den höga andelen av celler som uttrycker främmande genetisk information, den enkla kontrollen av miljön av oocyten med hjälp av bad perfusion, och kontrollen av membranpotentialen .
Nackdelen med detta uttryckssystem är den säsongsvariation som observerats i många laboratorier 17-20. Anledningen till denna variationär långt ifrån klart. Dessutom är kvaliteten på ägg ofta observerats variera kraftigt. Traditionella metoder 7-9 har inkluderat isolering av äggstocks lober, exponeringen av äggstocks lober till kollagenas för några timmar, valet av blottlagda oocyter, och äggcellen mikroinjektion. Här finns ett antal alternativ, snabba förfaranden rapporterade att ha tillåtit oss att arbeta med detta uttryckssystem för mer än 30 år utan säsongsvariation och lite variation i äggcellen kvalitet.
De modifierade och förbättrade metoder som beskrivs här för isolering av oocyter, mikroinjektion med cRNA, och avlägsnande av follikulära cellskikt kan användas för att uttrycka något protein val i Xenopus äggcellen. Den mycket enkel metod för snabba förändringar av mediet runt oocyten lösning kan appliceras på studien av något ligandstyrda jonkanaler och transportörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsök har godkänts av den lokala kommittén i kantonen Bern Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Bern (BE85 / 15).
1. Framställning av Xenopus-oocyter
- Behåll grodor (Xenopus laevis) på en 12 h 12 h ljus / mörker-cykel i vatten som strikt hållas vid 20 ° C /.
- Ta bort lober äggstockarna från hongrodor 9.
OBS: Avlägsnandet av loberna är en stimulans för regenerering, och ofta kvaliteten av oocyter förbättras med kirurgi. Oocyten är täckt av ett vitelline skikt, ett skikt av follikelceller, och bindväv som innehåller blodkärlen 21. Hela strukturen benämns "follikeln." - Placera lober äggstockarna som är tätt packade med hårsäckarna som innehåller ägg i sterila Barth Saline 7 (MBS) kompletterat med penicillin och streptomycin (88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mMNaHCO 3, 0,82 mM MgSO 4, 0,41 mM CaCl2, 0,33 mM Ca (NO3) 2, 10 mM 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra; HEPES (pH 7,5, NaOH), 100 | ig / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin).
- Single-out skede V-VI 21 folliklar. Håll äggstocken lob med pincett. Sänk platinaögla (figur 1) över hårsäckarna och försiktigt dra öglan att störa bindväv som innehåller follikelstimulerande från äggstocken vävnad.
OBS: Steg V-VI 21 folliklar kännetecknas av sin storlek (1,0-1,2 mm i diameter) och med god kontrast mellan den mörka pigmenterade djuret halvklotet och den gulaktiga vegetativa hemisfären. - Ta bara fräschare folliklar (dvs. perfekt sfäriska och med intakt pigmente) till en 35 mm diameter petriskål med hjälp av en plast pasteurpipett (klippa tillbaka till en öppningsdiameter på 1,5 mm).
Obs! Mikroinjektion system som beskrivs här kommer från den som rapporterats av Kressmann och Birnstiel 22.
- Förbereda CRNAs från respektive cDNA som kodar för de subenheter av α 4 β 2 δ GABA A-receptorn genom in vitro-transkription, tillägg av en poly (A +) -svans, och RNA kvantifiering genom gelelektrofores 23.
- Förbereda mikroinjektion pipetter av borsilikatglas kapillärer (1,0 mm ytterdiameter (OD), 0,58 mm innerdiameter (ID), 100 mm längd) med användning av en mikropipett avdragare. Bryt av spetsarna på glaskapillärer under ett mikroskop med användning av en mikromanipulator och mikrofila för att skapa en spetsdiameter av från 12 till 15 ^ m med en avfasad spets.
- Återfyllning mikroinjektion pipetter med paraffinolja med en 10 ml spruta, och sedan montera mikroinjektion pipetten på en hembyggd microinjection apparat (Figur 2).
OBS! Hembyggda hydraulisk injektionsapparat består av en grill motor som styrs av en fotpedal switch. En ytterligare omkopplare ändrar vändläge hos motorn. Denna motor driver en mikrometerskruv (0,5 mm / varv) som flyttar eller dras kolven i en glasspruta 10 mikroliter. Injektionen är vid en hastighet av ca 3 varv per minut och en 0,5 varv motsvarar en 50 nL injektion i en follikel. Spetsen på sprutan är ansluten till tjockväggiga polytetrafluoreten slang som är i sig ansluten till injektionsnålen genom en mycket kort stycke av Tygon-slangen. Injektions kapillär hålls av en borrchuck som styrs av en mikromanipulator. Hela systemet är fyllt med paraffinolja. Eventuella luftbubblor bör undvikas, eftersom de kommer att försämra insprutningssystemet. Installationen lyser med en kall ljuskälla. Ett stereomikroskop krävs för optisk kontroll. Folliklar visualiseras i kallt ljus med en stereomicroscope (40X förstoring). Prestanda hos injektions installationen testas genom injektion av radioaktivt spårämne i Xenopus oocyter. En volym av 45 - 55 nL ska levereras per injektion. - Med användning av en pipett med en steril plastspets, testa installationen genom att placera en liten droppe av sterilt vatten på den rena insidan av ett fuktbeständigt termoplast (2 x 2 cm). Sänk spetsen på insprutnings pipetten i denna droppe, och sedan vrida motorn att dra tillbaka kolven (undertryck inuti injektions pipett).
NOTERA: Vatten bör komma in i pipetten och bildar en synlig gränssnitt med oljan. - Dra in pipettspetsen från droppen och applicera positivt tryck på insidan av injektionspipetten. En vattendroppe bör bildas vid spetsen av injektionspipetten.
- Förbered för injektion av folliklar genom att rada upp dem med de vegetabiliska polerna pekar uppåt i mellanrummen i en nylonnät (G: 0,8 mm) limmade till botten av en Petri maträtt (60 mm) täckt med MBS.
- Fördela 2 mikroliter av mRNA med hjälp av en pipett med en steril plastspets på den rena insidan av en termoplast. Ta mRNA upp i injektionspipetten genom att applicera negativt tryck på insidan av injektionspipetten.
- Positionera injektionspipetten över en individuell follikel med användning mikromanipulator.
- För in injektionsnålen i centrum av den vegetativa polen och injicera 50 nL av mRNA vid en flödeshastighet av 0,6 mikroliter / min genom att applicera positivt tryck till insidan av pipetten. Vänta 5 - 10 s innan du tar bort injektions pipettspetsen från follikeln att undvika mRNA fly.
OBS! MRNA ska injiceras in i växt (gulaktig) pol för att undvika injektion i kärnan, som ligger i djuret halvklotet. - Överföra de injicerade folliklar att en ny petriskål (35 mm) fylld med 2 ml av MBS. Placera skålen i en vinkyl inställd på 18 ° C. Inkubera injicerade folliklar för en -7 d före inspelning, beroende på identiteten hos den nyligen uttryckta proteinet.
3. Stripp av hårsäckarna (Figur 3)
OBS: Som nämnts ovan, oocyten täckt av ett vitelline skikt, follikelceller, och bindväv, vilken innehåller blodkärlen 24, är känd som en "follikel." Alla skikt utom vitelline skikt, som tillhandahåller mekanisk stabilitet utan att förhindra tillträde av lösningar till cellytan, måste avlägsnas innan elektrofysiologiska experiment. Follikeln utan de omgivande cellskikten har tidigare kallats en "blottad" äggcellen 25. Detta steg utförs vanligtvis på samma dag som de elektrofysiologiska experimenten.
- Överföring tio injicerade folliklar att ett borsilikat glasrör innehållande 0,5 ml MBS, 1 mg / ml kollagenas, och 0,1 mg / ml trypsininhibitor. Sänk ned röret i ett vattenbad som hölls vid 36 ° C. inkuberafolliklar i 20 minuter och skaka rören ibland.
- Skölj folliklar genom att överföra dem till ett andra rör innehållande 1 ml MBS vid RT. Låt dem i röret under cirka 10 sekunder.
- Överföra folliklar till ett tredje rör innehållande 0,5 ml dubbel koncentrerade MBS innehållande 4 mM etylenglykol-bis (2-aminoetyleter) - N, N, N ', N'-tetraättiksyra (EGTA), och inkubera dem under 4 min vid RT. Skaka röret då och då.
OBS: hyperton lösning (dubbelt koncentrerade MBS) används för att inducera krympning av oocyter inom follikelstimulerande cellager, därigenom lossnar follikulära cellskikt från oocyten; EGTA tillsätts för att hämma kollagenas-aktivitet. - Skölj folliklar genom att överföra dem till ett andra rör innehållande 1 ml MBS vid RT. Låt dem i röret under cirka 10 sekunder.
- Överföra oocyterna till en petriskål (35 mm i diameter) innehållande 2 ml av MBS. Under en stereomikroskop, separera ytterkuvert från folliklar genomhelt enkelt trycka på nakna äggcellen bort med hjälp av platinaögla.
OBS: De yttre höljen oocyterna hålla fast vid odlingsskålen och kan lätt separeras från oocyterna. Vissa ägg kommer spontant förlora sina ytterkuvert och kommer att återvinnas som blottlagda oocyter. Detta förfarande resulterar i en relativt stabil beredning som håller sfäriskt utseende av oocyter.
4. Snabb lösning Ändra runt äggcellen
- Utför en spänning klämma experiment som beskrivs 9,26.
- Ändra lösning av allvar matade perfusion systemet genom att vrida perfusion växlar i enlighet med försöket.
- Applicera perfusionslösningen vid 6 ml / min genom en glaskapillär med en innerdiameter av 1,35 mm, vars mynning är placerad ca 0,4 mm från ytan av oocyten, för att medge snabba förändringar i agonistkoncentrationen runt oocyten.
OBS: Förändringstakten har varit tidigare uppskattningd som 70% på mindre än 0,5 s 27.
- Applicera perfusionslösningen vid 6 ml / min genom en glaskapillär med en innerdiameter av 1,35 mm, vars mynning är placerad ca 0,4 mm från ytan av oocyten, för att medge snabba förändringar i agonistkoncentrationen runt oocyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Xenopus-oocyter mekaniskt utpekad med användning av en platinaögla (Figur 1). De oocyter mikroinjicerades med mRNA som kodar för GABAA-receptorunderenheterna a 4, P 2, δ, 0,5: 0,5: 2,5 fmol / oocyt (figur 2). Efter 4 d, var follikulära cellager bort (Figur 3). Oocyter spänning fastklämd vid -80 mV och exponerades för ökande koncentrationer av γ-aminosmörsyra (GABA) i närvaro av 1 | iM 3α, 21-dihydroxi-5α-pregnan-20-on (THDOC), en potent positiv allosterisk modulator av GABA A-receptorn. Figur 4A visar ursprungliga nuvarande spår inspelade i ett sådant experiment. Figur 4B visar framkallade strömamplituden beroende på GABA-koncentrationer. Detta möjliggör bestämning av känsligheten för denna subenhet kombination mot GABA. De individuella kurvorna varmonterade och standardiseras till I max och därefter medelvärde. Ekvationen som användes var I (c) = I max / (1+ (EC 50 / c) n), där c är koncentrationen av GABA, EC 50 koncentrationen av GABA (i närvaro av 1 | iM THDOC) framkalla ett halv -maximal strömamplituden, är i max den maximala strömamplituden, i är strömmen amplitud, och n är Hill-koefficient. EC50 av α fyra β 2 δ GABA A-receptorn uppgick till 0,41 ± 0,12 ^ M, och n var 0,76 ± 0,04.
Figur 1: Platinum Loop. Platinatrådslinga som nämns i protokoll steg 1,4. Platina är en metall som kan böjas utan att producera flisor, och det inte fastnartill biologiskt material. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Homebuilt mikroinjektion Apparatus. Anordningen beskrivs i protokoll steg 2. a, grill motor; b, mikrometerskruv; c, fjäder mellan sprutan och kolven; d, spruta 10 mikroliter glas; e, tjocka väggar polytetrafluoretylen slang; f, handborr chuck; g, injektion pipett; h, stereomikroskop; och jag, motorstyrning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Schema Visar den Defolliculation av en oocyt. Oocyter inkuberas först i en kollagenaslösning i ett vattenbad vid 36 ° C under 20 min. Oocyter tvättas sedan i en modifierad Barth-medium. Den slutliga inkubationen steg är i en hypertonisk EGTA lösning vid RT under 4 min. Som ett resultat, är bindväv och follikeln celler avlägsnas för att ge vika för blottlagda äggcellen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Nuvarande Spår från en två-elektrodspänningen Clamp experiment. EN, Strömspår från en GABA-koncentration-responskurva i preshet av en iM THDOC erhållits från en Xenopus äggcell som uttrycker α fyra β 2 δ GABA A-receptorn. Staplarna anger tidsperioden för GABA / 1 iM THDOC perfusion. Ökande koncentrationer av GABA applicerades på oocyter, och de motsvarande nuvarande amplituder bestämdes. GABA koncentrationer anges ovan staplarna. B, Medelvärdes koncentrations-responskurvor för α 4 β 2 δ GABA A-receptom. Individuella kurvorna var först normaliserades till den monterade maximal strömamplitud och därefter medelvärde. Data visas som medelvärde ± SD, n = 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder som beskrivs i denna artikel avvika från de som används traditionellt 09/07. Det är standard att exponera lober äggstockarna till en 1-2 h kollagenas behandling 8; isolera oskadade, avklädda oocyter; och injicera dem med mRNA med hjälp av injektions kommersiella enheter. Denna klassiska förfarande har följande nackdelar: 1) Oocyter kan komma att skadas av lång exponering för höga koncentrationer av kollagenas. 2) De instabila avklädda oocyter måste lagras tills experimentet. 3) avklädda oocyter är mer benägna att lida under mikroinjektion än folliklar. Kommersiella injektionsanordningar använda med stor diameter (ca 20 | j, m) injektionsnålar, sannolikt att resultera i en relativt hög hastighet av skador. Fördelarna med det förbättrade förfarandet som beskrivs här är följande: exponering för kollagenas är begränsad till 20 min, blottlagda oocyter inte behöver lagras, och den lilla spetsdiameter av pipetterna (ca 12-15 pm) användes för microinjectipå inte kräver tidigare "defolliculation" av hårsäckarna för mRNA injektion. Den enda kritiska steget är att follikeln inkubationstemperaturen i kollagenaslösning bör noggrant justeras till 36 ° C och bör inte överstiga den.
För lösning förändringar i elektrofysiologiska experiment, mycket ofta lösningen i mätkammaren ändras, vilket tar en betydande mängd tid, beroende på storleken av kammaren och perfusionshastighet. Använda perfusion kapillär undvikit detta.
Den stora nackdelen av uttrycket av jonkanaler i Xenopus oocyter är deras jätte storlek. Spänningsreglering snabbare än ca 2 ms är svårt, och mycket snabbt (<0,5 s) förändringar lösning kräver komplicerade förfaranden. Vidare starkt kan hydrofoba substanser nästan vara irreversibelt bunden till äggulan av äggcellen.
De metoder som beskrivs här har gett oss möjlighet att undersökai ett tidsbesparande sätt de funktionella egenskaperna hos rekombinant GABA A-receptorer, deras modulering genom syntetiska föreningar och växtsubstanser, deras subenhet arrangemang, och platsen för drogbindningsställen i receptorer av olika subenhet sammansättning. De metoder som beskrivs här lämpar sig för uttryck av något protein val i Xenopus äggcellen. Den mycket enkel metod för snabba förändringar av mediet runt oocyten lösning kan appliceras på studien av något ligandstyrda jonkanaler eller bärare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | 71380 | |
| KCl | Sigma | P-9541 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
| CaCl2 | Sigma | 223560 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/mL and 100 μg streptomycin/mL |
| Platinum wire loop | home-made | ||
| Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μL, Type 701N |
| Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
| Nylon net, G: 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
| Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
| Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
| EGTA | Sigma | E3389 | |
| Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 Length mm (for microinjection) |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD x 0.69 ID x 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
| γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
| 3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
| grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
| micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
| Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |
References
- Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells. Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).
- Soreq, H. The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes. CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).
- Sigel, E. Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins. J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).
- Dascal, N. The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels. CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).
- Sigel, E. Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid. J Physiol. 386, 73-90 (1987).
- Sigel, E., Minier, F. The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins. Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).
- Colman, A. Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes. Transcription and Translation'A Practical Approach. Hames, B. D., Higgins, S. J. , IRL Press. Oxford. 49-69 (1984).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M.
- Smart, T. G., Krishek, B. J. Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression. Patch-Clamp Applications and Protocols. Boulton, A. A., Baker,, Wolfgang, W. alz , Humana Press. New Jersey. 259-305 (1995).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital. Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity. Sci Rep. 6, 25943 (2016).
- Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Towards understanding functional properties and subunit arrangement of α4β2δ GABAA receptors. J Biol Chem. 291 (35), 18474-18483 (2016).
- Burgunder, J. M., et al. Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese. Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).
- Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes. FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei. J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth. Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).
- Wu, M., Gerhart, J.
- Gurdon, J. B. American clawed frogs. Methods in developmental biology. Wilt, F. H., Wessels, N. K. , Thomas Y. Crowell Co. New York. 75-84 (1967).
- Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation. Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).
- Green, S. L. Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis). Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).
- Kressmann, A. Birnstiel M.L. Surrogate genetics. Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells. Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. , Plenum Press. 388-407 (1980).
- Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site. Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).
- Dumont, J. N., Brummett, A. R. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues. J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).
- Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3',5'-cyclic monophosphate. J Physiol. 352, 551-574 (1984).
- Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides. Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).
- Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Möhler, H., Malherbe, P. The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function. Neuron. 5, 703-711 (1990).
