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Xenopus oocytes: microinjection के लिए अनुकूलित तरीके, कूपिक सेल परतों को हटाने, और electrophysiological प्रयोगों में तेजी से समाधान परिवर्तन

Published: December 31, 2016 doi: 10.3791/55034
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Biochemistry and Molecular Medicine, University of Bern
* These authors contributed equally

Abstract

प्रोटीन के लिए एक heterologous अभिव्यक्ति प्रणाली के रूप में Xenopus oocyte, पहले Gurdon एट अल द्वारा वर्णित किया गया था। 1 और व्यापक रूप से अपनी खोज के बाद से इस्तेमाल किया गया है (संदर्भ 2 - 3, और संदर्भ उसमें)। एक विशेषता है कि oocyte विदेशी चैनल अभिव्यक्ति के लिए आकर्षक बना देता है अंतर्जात आयन चैनल 4 के गरीब बहुतायत है। यह अभिव्यक्ति प्रणाली कई प्रोटीन, उन्हें ligand-गेटेड आयन चैनल के बीच के लक्षण वर्णन के लिए उपयोगी साबित हो गया।

Xenopus oocytes में गाबा एक रिसेप्टर्स और उनके कार्यात्मक लक्षण वर्णन की अभिव्यक्ति यहाँ वर्णित है, oocytes, Crna, कूपिक सेल परतों को हटाने, और electrophysiological प्रयोगों में तेजी से समाधान परिवर्तन के साथ microinjections के अलगाव भी शामिल है। प्रक्रियाओं इस प्रयोगशाला 5,6 में अनुकूलित और लोगों को नियमित रूप से 7-9 से विचलित इस्तेमाल किया गया था। परंपरागत रूप से, denuded oocytes तैयार कर रहे हैंआरटी पर अंडाशय पालियों की एक लम्बी कोलैजिनेज़ उपचार, और इन denuded oocytes साथ mRNA के साथ microinjected हैं। अनुकूलित विधियों का प्रयोग, विविध झिल्ली प्रोटीन व्यक्त की और इस तरह के पुनः संयोजक गाबा एक रिसेप्टर्स 10-12, मानव पुनः संयोजक क्लोराइड चैनलों 13, trypanosome पोटेशियम चैनलों 14, और एक म्यो -inositol ट्रांसपोर्टर 15, 16 के रूप में इस प्रणाली के साथ अध्ययन किया गया है।

यहाँ विस्तृत तरीकों Xenopus oocytes में पसंद के किसी भी प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए लागू किया जा सकता है, और तेजी से समाधान परिवर्तन अन्य ligand-गेटेड आयन चैनल का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

Xenopus oocytes व्यापक रूप से (- 3, और संदर्भ उसमें संदर्भ 2) एक अभिव्यक्ति प्रणाली के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। वे ठीक से इकट्ठा और उनके प्लाज्मा झिल्ली में कार्यात्मक सक्रिय multisubunit प्रोटीन को शामिल करने में सक्षम हैं। इस प्रणाली का उपयोग करना, यह संभव है कार्यात्मक अकेले या अन्य प्रोटीन के साथ संयोजन में झिल्ली प्रोटीन की जांच, उत्परिवर्तित, chimeric, या concatenated प्रोटीन के गुणों का अध्ययन करने के क्रम में, और संभावित दवाओं स्क्रीन करने के लिए।

अन्य heterologous अभिव्यक्ति सिस्टम पर oocytes के प्रयोग के लाभ विशाल कोशिकाओं के सरल हैंडलिंग, विदेशी आनुवंशिक जानकारी, स्नान छिड़काव के माध्यम से oocyte के वातावरण की सरल नियंत्रण व्यक्त कोशिकाओं की उच्च अनुपात, और झिल्ली क्षमता के नियंत्रण में शामिल ।

इस अभिव्यक्ति प्रणाली का दोष यह मौसमी बदलाव के कई प्रयोगशालाओं 17-20 में मनाया जाता है। इस बदलाव के लिए कारणस्पष्ट से दूर है। इसके अतिरिक्त, oocytes की गुणवत्ता अक्सर दृढ़ता से भिन्न करने के लिए मनाया जाता है। पारंपरिक तरीकों 7-9 अंडाशय पालियों के अलगाव, कुछ घंटे के लिए collagenase के लिए अंडाशय पालियों के जोखिम, denuded oocytes का चयन, और oocyte microinjection को शामिल किया है। इधर, विकल्प, तेजी प्रक्रियाओं के एक नंबर सूचित कर रहे हैं कि हमें कोई मौसमी बदलाव और oocyte गुणवत्ता में थोड़ा बदलाव के साथ 30 से अधिक वर्षों के लिए इस अभिव्यक्ति प्रणाली के साथ काम करने के लिए अनुमति दी है।

यहाँ oocytes के अलगाव, Crna साथ microinjection, और कूपिक सेल परतों को हटाने के लिए वर्णित संशोधित और बेहतर तरीकों Xenopus oocyte में पसंद के किसी भी प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। oocyte आसपास माध्यम के तेजी से समाधान परिवर्तन के लिए बहुत ही सरल विधि किसी भी ligand-गेटेड आयन चैनल की और वाहक के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है।

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Protocol

पशु प्रयोगों गुआंगज़ौ बर्न Kantonstierarzt की स्थानीय समिति, Kantonaler Veterinärdienst बर्न (BE85 / 15) द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. Xenopus oocytes की तैयारी

  1. एक 12 एच / 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे पानी में चक्र है कि कड़ाई से 20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है पर मेंढकों (Xenopus laevis) बनाए रखें।
  2. महिला मेंढ़क 9 से अंडाशय के पालियों निकालें।
    नोट: पालियों को हटाने के उत्थान के लिए एक प्रेरणा है, और अक्सर oocytes की गुणवत्ता सर्जरी के साथ बेहतर बनाता है। Oocyte एक पीतक परत, कूप कोशिकाओं की एक परत, और संयोजी ऊतक रक्त वाहिकाओं 21 युक्त द्वारा कवर किया जाता है। पूरे ढांचे को "कूप।" करार दिया है
  3. अंडाशय कि घनी बाँझ बार्थ खारा 7 (एमबीएस) में oocytes युक्त के रोम पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन (88 मिमी NaCl, 1 मिमी KCl, 2.4 मिमी के साथ पूरक के साथ पैक किया जाता है की पालियों की जगह3 NaHCO, 0.82 मिमी MgSO 4, 0.41 मिमी 2 CaCl, 0.33 मिमी सीए (सं 3) 2, 10 मिमी 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड; HEPES (7.5 पीएच, NaOH), 100 माइक्रोग्राम / एमएल पेनिसिलिन, और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन)।
  4. एकल-चरण बाहर वी छठी से 21 के रोम। संदंश के साथ अंडाशय पालि पकड़ो। प्लैटिनम पाश (चित्रा 1) के रोम पर कम और धीरे अंडाशय के ऊतकों से कूप युक्त संयोजी ऊतक को बाधित करने के पाश वापस ले लें।
    नोट: स्टेज वी छठी से 21 के रोम उनके आकार की विशेषता है (1.0 - व्यास में 1.2 मिमी) और अंधेरे pigmented पशु गोलार्द्ध और पीले रंग के वनस्पति गोलार्द्ध के बीच अच्छा इसके विपरीत।
  5. एक प्लास्टिक पाश्चर विंदुक (1.5 मिमी व्यास उद्घाटन करने के लिए वापस कटौती) के माध्यम से एक 35 मिमी व्यास पेट्री डिश के लिए केवल स्वस्थ दिखने के रोम (यानी पूरी तरह से गोलाकार और बरकरार रंजकता के साथ) स्थानांतरण।

नोट: microinjection यहाँ वर्णित प्रणाली Kressmann और Birnstiel 22 से खबर दी है कि से ली गई है।

  1. इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा एक रिसेप्टर, जेल वैद्युतकणसंचलन 23 से एक पाली (ए +) पूंछ, और आरएनए मात्रा का ठहराव के अलावा α 4 β 2 δ गाबा के सब यूनिटों के लिए कोडिंग संबंधित cDNAs से CRNAs तैयार करें।
  2. borosilicate ग्लास केशिकाओं (1.0 मिमी बाहरी व्यास (ओवर ड्राफ्ट), 0.58 मिमी भीतरी व्यास (आईडी), 100 मिमी लंबाई) एक micropipette खींचने का उपयोग करने से microinjection pipettes तैयार करें। एक beveled टिप के साथ 15 माइक्रोन - एक माइक्रोस्कोप एक micromanipulator और microfilament का उपयोग कर 12 के एक टिप व्यास बनाने के तहत कांच केशिकाओं के सुझावों बंद तोड़।
  3. पैराफिन तेल एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग के साथ microinjection pipettes backfill, और फिर एक homebuilt माइकर पर microinjection पिपेट माउंटoinjection तंत्र (चित्रा 2)।
    ध्यान दें: homebuilt तेल हाइड्रोलिक इंजेक्शन तंत्र एक ग्रिल मोटर एक पैर पेडल स्विच द्वारा नियंत्रित होते हैं। एक अतिरिक्त स्विच मोटर के मोड़ मोड बदल जाता है। इस मोटर एक माइक्रोमीटर पेंच (0.5 मिमी / बारी) कि अग्रिम या एक 10 μL कांच सिरिंज के सवार पलटा ड्राइव। इंजेक्शन के बारे में 3 आरपीएम की गति है और एक 0.5 बारी एक कूप में एक 50 नाथन इंजेक्शन से मेल खाती है। सिरिंज की नोक मोटी दीवारों polytetrafluoroethylene ट्यूबिंग है कि खुद Tygon ट्यूबिंग का एक बहुत छोटा टुकड़ा द्वारा इंजेक्शन की सुई से जुड़ा है से जुड़ा है। इंजेक्शन केशिका एक ड्रिल चक कि एक micromanipulator द्वारा नियंत्रित किया जाता है द्वारा आयोजित किया जाता है। पूरे सिस्टम आयल के तेल से भरा है। किसी भी हवाई बुलबुले से बचा जाना चाहिए क्योंकि वे इंजेक्शन प्रणाली ख़राब होगा। सेटअप एक ठंड प्रकाश स्रोत के साथ जलाया जाता है। एक stereomicroscope ऑप्टिकल नियंत्रण के लिए आवश्यक है। रोम एक stereomicr के साथ ठंड प्रकाश के तहत कल्पना कर रहे हैंoscope (40x बढ़ाई)। इंजेक्शन की स्थापना के प्रदर्शन Xenopus oocytes में रेडियोधर्मी अनुरेखक के इंजेक्शन से परीक्षण किया है। 45 की एक मात्रा - 55 नाथन प्रति इंजेक्शन दिया जाना चाहिए।
  4. एक बाँझ प्लास्टिक टिप के साथ एक विंदुक का प्रयोग, एक नमी प्रतिरोधी थर्माप्लास्टिक (2 एक्स 2 सेमी) की साफ अंदर पर बाँझ पानी की एक छोटी बूंद रखकर सेटअप का परीक्षण करें। इस छोटी बूंद में इंजेक्शन पिपेट की नोक विसर्जित कर दिया, और फिर मोटर सवार (इंजेक्शन पिपेट अंदर नकारात्मक दबाव) वापस लेना करने के लिए बारी।
    नोट: जल पिपेट में प्रवेश करना चाहिए और तेल के साथ एक दृश्य अंतरफलक के रूप में।
  5. छोटी बूंद से पिपेट की नोक वापस लेना और इंजेक्शन पिपेट के अंदर करने के लिए सकारात्मक दबाव लागू होते हैं। एक छोटी बूंद पानी इंजेक्शन पिपेट की नोक पर फार्म चाहिए।
  6. एक पीई के नीचे से चिपके: वनस्पति डंडे एक नायलॉन जाल के interstices (0.8 मिमी जी) में ऊपर की तरफ इशारा करते हुए के साथ उन्हें अस्तर द्वारा रोम के इंजेक्शन के लिए तैयारत्रिकोणीय पकवान (60 मिमी) एमबीएस के साथ कवर किया।
  7. एक थर्माप्लास्टिक की साफ अंदर पर एक बाँझ प्लास्टिक टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग mRNA की 2 μL बांटना। mRNA इंजेक्शन पिपेट में ऊपर इंजेक्शन पिपेट के अंदर करने के लिए नकारात्मक दबाव को लागू करने से ले लो।
  8. एक व्यक्ति micromanipulator का उपयोग कूप के ऊपर इंजेक्शन पिपेट स्थिति।
  9. वनस्पति ध्रुव के केंद्र में इंजेक्शन सुई डालें और पिपेट के अंदर करने के लिए सकारात्मक दबाव लगाने से 0.6 μL / मिनट की एक प्रवाह दर पर mRNA की 50 नाथन इंजेक्षन। कूप से इंजेक्शन विंदुक टिप को हटाने mRNA भागने से बचने के लिए पहले 10 एस - 5 रुको।
    नोट: mRNA वनस्पति (पीले) पोल में इंजेक्ट किया जाना चाहिए नाभिक है, जो पशु गोलार्द्ध में स्थित है में इंजेक्शन से बचने के लिए।
  10. एक नया पेट्री डिश (35 मिमी) एमबीएस के 2 एमएल के साथ भरा करने के लिए इंजेक्शन के रोम स्थानांतरण। पकवान एक शराब कूलर 18 डिग्री सेल्सियस पर सेट में रखें। 1 के लिए इंजेक्शन के रोम सेते हैं -रिकॉर्डिंग से पहले 7 डी, नव व्यक्त प्रोटीन की पहचान पर निर्भर करता है।

3. रोम के स्ट्रिपिंग (चित्रा 3)

नोट: जैसा कि ऊपर उल्लेख oocyte एक पीतक परत, कूप कोशिकाओं, और संयोजी ऊतक, जो रक्त वाहिकाओं 24 शामिल द्वारा कवर किया, एक के रूप में जाना जाता है "कूप।" पीतक परत है, जो कोशिका की सतह के समाधान के लिए पहुँच को रोकने के बिना यांत्रिक स्थिरता प्रदान करता है के लिए छोड़कर सभी परतों, electrophysiological प्रयोगों से पहले हटा दिया जाना चाहिए। आसपास के सेल परतों के बिना कूप पहले एक "denuded" oocyte 25 में कहा गया है। यह कदम आम तौर पर electrophysiological प्रयोगों के रूप में एक ही दिन में किया जाता है।

  1. स्थानांतरण दस एमबीएस के 0.5 एमएल, 1 मिलीग्राम / एमएल कोलेजिनेस, और 0.1 मिलीग्राम / एमएल trypsin अवरोध युक्त एक borosilicate ग्लास ट्यूब के लिए इंजेक्शन के रोम। 36 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा एक पानी के स्नान में ट्यूब विसर्जित कर दिया। सेते20 मिनट के लिए रोम और कभी कभी नलियों हिला।
  2. उन्हें आरटी पर एमबीएस के 1 एमएल युक्त एक दूसरे ट्यूब को स्थानांतरित करने से रोम को कुल्ला। के बारे में 10 एस के लिए ट्यूब में उन्हें छोड़ दें।
  3. 4 मिमी एथिलीन ग्लाइकोल बीआईएस (2-aminoethylether) युक्त दोगुना केंद्रित एमबीएस के 0.5 एमएल युक्त एक तिहाई ट्यूब करने के रोम स्थानांतरण - एन, एन, एन ', N'- tetraacetic एसिड (EGTA), और उन पर 4 मिनट के लिए सेते आर टी। कभी कभी ट्यूब हिला।
    नोट: अतितनावी समाधान (दोगुना केंद्रित एमबीएस) कूप सेल परतों के भीतर oocytes, जिससे oocyte से कूपिक सेल परतों detaching की सिकुड़न प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है; EGTA collagenase गतिविधि को बाधित करने के लिए जोड़ा गया है।
  4. उन्हें आरटी पर एमबीएस के 1 एमएल युक्त एक दूसरे ट्यूब को स्थानांतरित करने से रोम को कुल्ला। के बारे में 10 एस के लिए ट्यूब में उन्हें छोड़ दें।
  5. एक पेट्री डिश (35 मिमी व्यास) एमबीएस के 2 एमएल युक्त करने के लिए oocytes स्थानांतरण। एक stereomicroscope के तहत, रोम से बाहर लिफाफे को अलग सेबस नग्न oocyte दूर धकेलने प्लैटिनम पाश का उपयोग कर।
    नोट: oocytes के बाहरी लिफाफे संस्कृति डिश के लिए मजबूती से चिपके रहते हैं और आसानी से oocytes से अलग किया जा सकता है। कुछ oocytes अनायास उनके बाहरी लिफाफे खो देंगे और denuded oocytes के रूप में वसूल किया जाएगा। यह प्रक्रिया एक अपेक्षाकृत स्थिर तैयारी है कि oocytes की गोलाकार उपस्थिति रहती में यह परिणाम है।

Oocyte आसपास 4. तेजी से समाधान बदलें

  1. एक वोल्टेज दबाना प्रयोग, के रूप में 9,26 वर्णित प्रदर्शन करना।
  2. के रूप में प्रयोग के द्वारा जरूरी छिड़काव स्विच मोड़ से गुरुत्वाकर्षण खिलाया छिड़काव प्रणाली के समाधान बदलें।
    1. 1.35 मिमी, मुंह जिनमें से oocyte की सतह से 0.4 मिमी के बारे में रख दिया गया है की एक आंतरिक व्यास के साथ एक गिलास केशिका के माध्यम से 6 एमएल / मिनट पर छिड़काव समाधान लागू करें, oocyte आसपास एगोनिस्ट एकाग्रता में तेजी से परिवर्तन की अनुमति है।
      नोट: परिवर्तन की दर पहले से अनुमान किया गया हैकम से कम 0.5 एस 27 में 70% के रूप में डी।

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Representative Results

Xenopus oocytes यंत्रवत् एक प्लैटिनम पाश (चित्रा 1) का उपयोग कर बाहर अकेले थे। 0.5: oocytes mRNA गाबा एक रिसेप्टर सब यूनिटों अल्फा 4 के लिए कोडिंग, बीटा 2, δ, 0.5 के साथ microinjected थे 2.5 fmol / oocyte (चित्रा 2)। बाद 4 डी, कूपिक सेल परतों (चित्रा 3) हटा दिया गया। Oocytes वोल्टेज -80 एम वी पर clamped और 1 माइक्रोन 3α, 21-dihydroxy-5α-pregnan-20-एक (THDOC), का एक शक्तिशाली सकारात्मक allosteric न्यूनाधिक की उपस्थिति में γ aminobutyric एसिड (GABA) की सांद्रता में वृद्धि से अवगत कराया गया गाबा एक रिसेप्टर। चित्रा -4 ए में इस तरह के एक प्रयोग में दर्ज की मूल वर्तमान निशान से पता चलता है। चित्रा 4 बी हासिल वर्तमान गाबा सांद्रता पर निर्भर करता है आयाम से पता चलता है। इस गाबा की ओर इस सबयूनिट संयोजन की संवेदनशीलता के निर्धारण की अनुमति देता है। अलग-अलग घटता थेफिट और मैं अधिकतम करने के लिए मानकीकृत और बाद में औसत। इस्तेमाल किया समीकरण था मैं (ग) = मैं अधिकतम / (1 + (ईसी 50 / सी) एन), जहां सी गाबा, चुनाव आयोग 50 गाबा की एकाग्रता (1 माइक्रोन THDOC की उपस्थिति में) की एकाग्रता एक आधा eliciting है -maximal वर्तमान आयाम, मैं अधिकतम, अधिक से अधिक वर्तमान आयाम है मैं वर्तमान आयाम है, और एन हिल गुणांक है। Α 4 β 2 δ गाबा के चुनाव आयोग 50 एक रिसेप्टर 0.41 ± 0.12 सुक्ष्ममापी की राशि, और एन 0.76 ± 0.04 था।

आकृति 1
चित्रा 1: प्लेटिनम लूप। प्लैटिनम तार पाश प्रोटोकॉल 1.4 चरण में उल्लेख किया है। प्लेटिनम एक धातु है कि किरचें उत्पादन के बिना तुला किया जा सकता है, और यह छड़ी नहीं हैजैविक सामग्री के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: Homebuilt microinjection तंत्र। तंत्र प्रोटोकॉल चरण 2. एक, ग्रिल मोटर में वर्णन किया गया है; बी, माइक्रोमीटर पेंच; सी, सिरिंज और सवार के बीच वसंत; डी, 10 μL कांच सिरिंज; ई, मोटी दीवारों polytetrafluoroethylene ट्यूबिंग; एफ, हाथ ड्रिल चक; जी, इंजेक्शन पिपेट; ज, stereomicroscope; और मैं, मोटर नियंत्रण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 3. योजना एक oocyte की Defolliculation दिखा रहा है। Oocytes पहले 20 मिनट के लिए 36 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में एक collagenase समाधान में incubated हैं। Oocytes तो एक संशोधित बार्थ माध्यम में धो रहे हैं। अंतिम ऊष्मायन कदम 4 मिनट के लिए आरटी पर एक अतितनावी EGTA समाधान में है। नतीजतन, संयोजी ऊतक और कूप कोशिकाओं denuded oocyte के लिए रास्ता देने के लिए निकाल रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. एक दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप प्रयोग से वर्तमान निशान। ए, दबाव में एक गाबा एकाग्रता प्रतिक्रिया वक्र से वर्तमान निशान1 माइक्रोन एक Xenopus oocyte α 4 β 2 δ गाबा व्यक्त एक रिसेप्टर से प्राप्त THDOC के खिलाडि़यों। सलाखों के गाबा / 1 माइक्रोन THDOC छिड़काव की समय अवधि का संकेत मिलता है। गाबा की सांद्रता में वृद्धि oocytes के लिए लागू किया गया है, और इसी वर्तमान आयाम निर्धारित किया गया है। गाबा सांद्रता सलाखों के ऊपर संकेत कर रहे हैं। बी, Α 4 β 2 δ गाबा एक रिसेप्टर की औसतन एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता। व्यक्तिगत घटता फिट अधिक से अधिक वर्तमान आयाम करने के लिए पहली सामान्यीकृत थे और बाद में औसतन थे। डेटा, के रूप में मतलब ± एसडी दिखाए गए हैं n = 3. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

तरीकों इस आलेख में वर्णित पारंपरिक रूप से 7-9 इस्तेमाल उन लोगों से विचलित। यह एक 1 से 2 घंटे के कोलैजिनेज़ उपचार से 8 अंडाशय की पालियों को बेनकाब करने के लिए मानक है; undamaged, denuded oocytes को अलग; और उन्हें mRNA वाणिज्यिक इंजेक्शन उपकरणों का उपयोग कर के साथ इंजेक्षन। 1) Oocytes collagenase के उच्च सांद्रता के लिए लंबे समय जोखिम से क्षतिग्रस्त होने की संभावना है: यह शास्त्रीय प्रक्रिया के बाद कमियां है। 2) अस्थिर denuded oocytes प्रयोग जब तक संग्रहित किया जाना चाहिए। 3) denuded oocytes अधिक के रोम से microinjection के दौरान पीड़ित होने की संभावना है। वाणिज्यिक इंजेक्शन उपकरणों बड़े व्यास (लगभग 20 माइक्रोन) इंजेक्शन सुई, नुकसान का एक अपेक्षाकृत उच्च दर में परिणाम की संभावना का उपयोग करें। (- 15 माइक्रोन के बारे में 12) microinjecti के लिए इस्तेमाल किया कोलैजिनेज़ के लिए जोखिम 20 मिनट तक सीमित है, denuded oocytes जमा होने की जरूरत नहीं है, और pipettes की छोटी सी टिप व्यास: बेहतर प्रक्रिया यहाँ वर्णित का लाभ इस प्रकार हैंपर पूर्व mRNA इंजेक्शन के लिए रोम के "defolliculation" की आवश्यकता नहीं है। एकल महत्वपूर्ण कदम है कि collagenase समाधान में कूप ऊष्मायन तापमान सावधानी से 36 डिग्री सेल्सियस के लिए समायोजित किया जाना चाहिए और यह अधिक नहीं होनी चाहिए।

electrophysiological प्रयोगों में समाधान परिवर्तन के लिए, बहुत बार माप चैम्बर में समाधान बदल गया है, जो समय की एक पर्याप्त राशि लेता है, और चैम्बर के आकार छिड़काव दर पर निर्भर करता है। छिड़काव केशिका इस टाला का उपयोग करना।

Xenopus oocytes में आयन चैनल की अभिव्यक्ति की बड़ी खामी अपने विशाल आकार है। वोल्टेज नियंत्रण की तुलना में तेजी के बारे में 2 एमएस मुश्किल है, और बहुत तेज है (<0.5) समाधान परिवर्तन विस्तृत प्रक्रियाओं की आवश्यकता है। इसके अलावा, दृढ़ता से हाइड्रोफोबिक पदार्थों लगभग अचल oocyte के अंडे की जर्दी लिए बाध्य किया जा सकता है।

यहाँ उल्लिखित तरीकों की जांच करने के लिए हमें की अनुमति दी हैएक समय की बचत ढंग से पुनः संयोजक गाबा एक रिसेप्टर्स, सिंथेटिक यौगिकों और संयंत्र पदार्थों, उनके सबयूनिट व्यवस्था करके उनके मॉडुलन, और विभिन्न सबयूनिट रचना की रिसेप्टर्स में दवा बाध्यकारी साइटों के स्थान के कार्यात्मक गुण। यहाँ वर्णित विधि Xenopus oocyte में पसंद के किसी भी प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए अनुकूल हैं। oocyte आसपास माध्यम के तेजी से समाधान परिवर्तन के लिए बहुत ही सरल विधि किसी भी ligand-गेटेड आयन चैनल या वाहक के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma 71380
KCl Sigma P-9541
NaHCO3 Sigma S6014
MgSO4  Sigma M-1880
CaCl2  Sigma 223560
Ca(NO3)2  Sigma C1396
HEPES Sigma H3375
Penicilin/streptomycin Gibco 15140-148 100 μg penicillin/mL and 100 μg streptomycin/mL
Platinum wire loop home-made
Micropipette puller Zeitz-Instruments GmBH DMZ
Hamilton syringe  Hamilton 80300 10 μL, Type 701N
Thick walled polytetrafluoroethylene tubing Labmarket GmBH 1.0 mm OD 
Paraffin oil Sigma 18512
Nylon net, G: 0.8 mm  ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG
Borosilicate glass tube  Corning 99445-12 PYREX
Collagenase NB Standard Grade SERVA 17454
Trypsin inhibitor type I-S Sigma T-9003
EGTA Sigma E3389
Glass capillary Jencons (Scientific ) LTD. H15/10 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited
Borosilicate glass capillary Harvard Apparatus Limited 30-0019 1.0 OD x  0.58 ID x 100 Length mm (for microinjection) 
Borosilicate glass capillary  Harvard Apparatus Limited 30-0044 1.2 OD x 0.69 ID x 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp)
γ-Aminobutyric acid (GABA) Sigma A2129
3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) Sigma P2016
grill motor Faulhaber  DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2
micrometer screw Kiener-Wittlin 10400 TESA, AR 02.11201
Sterile plastic transfer pipettes Saint-Amand  Mfg. 222-20S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 118, microinjection defolliculation तेजी से समाधान परिवर्तन इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी आयन चैनल
<em>Xenopus</em> oocytes: microinjection के लिए अनुकूलित तरीके, कूपिक सेल परतों को हटाने, और electrophysiological प्रयोगों में तेजी से समाधान परिवर्तन
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Maldifassi, M. C., Wongsamitkul, N., … More

Maldifassi, M. C., Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments. J. Vis. Exp. (118), e55034, doi:10.3791/55034 (2016).

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