Abstract
Die Xenopus Oozyten als heterologe Expressionssystem für Proteine, wurde zuerst von Gurdon et al. 1 und wurde seit seiner Entdeckung weit verbreitet (Referenzen 2 - 3 und Referenzen darin). Ein Merkmal, das die Eizelle attraktiv für ausländische -Kanalexpression macht , ist die schlechte Fülle von endogenen Ionenkanäle 4. Dieses Expressionssystem hat sich als nützlich für die Charakterisierung vieler Proteine erwiesen, darunter Liganden-gesteuerte Ionenkanäle.
Die Expression von GABA - A - Rezeptoren in Xenopus - Oozyten und ihre funktionelle Charakterisierung wird hier beschrieben, einschließlich der Isolierung von Oozyten, Mikroinjektionen mit cRNA, die Entfernung von follikulären Zellschichten und eine schnelle Lösung Veränderungen in elektrophysiologischen Experimenten. Die Verfahren wurden in diesem Labor 5,6 optimiert und weichen von den routinemäßig verwendeten 7-9 diejenigen. Traditionell werden entblößte Eizellen vorbereitetmit einer verlängerten Kollagenase Behandlung von Ovar Keulen bei RT und diese entblößte Oozyten werden mit mRNA mikroinjiziert. Verwendung der optimierten Methoden, diverse Membranproteine wurden mit diesem System exprimiert und untersucht, wie rekombinante GABA A -Rezeptoren 10-12, humanem rekombinantem Chloridkanäle 13, Trypanosom Kaliumkanäle 14 und eine myo - Inositol - Transporter 15, 16.
Die Methoden , die hier beschrieben werden , können zur Expression jedes Proteins der Wahl in Xenopus Oozyten angewendet werden, und die schnelle Lösung Änderung verwendet werden kann andere Liganden-gesteuerte Ionenkanäle zu untersuchen.
Introduction
Xenopus Oozyten werden als Expressionssystem (- 3 und den darin References 2) weit verbreitet. Sie sind in der Lage, richtig montieren und funktionell aktiven Multiunter Proteine in ihre Plasmamembranen integrieren. Mit diesem System ist es möglich, Membranproteine allein oder in Kombination mit anderen Proteinen funktionell zu untersuchen, um die Eigenschaften von mutierten, chimäre oder verketteten Proteine zu studieren, und potentielle Arzneimittel zu screenen.
Vorteile von Oozyten über andere heterologe Expressionssysteme umfassen die einfache Handhabung der Riesenzellen, die hohen Anteil an Zellen, die fremde genetische Information, die einfache Steuerung der Umgebung der Oocyte durch Bad-Perfusion, und die Kontrolle des Membranpotentials mit Hilfe .
Der Nachteil dieses Expressionssystem ist die saisonalen Schwankungen in vielen Laboratorien , 17-20. Der Grund für diese Variationbei weitem nicht klar ist. Zusätzlich wird die Qualität der Oozyten oft stark zu variieren beobachtet. Traditionelle Methoden 7-9 haben die Isolierung von Ovar Keulen, die Exposition von Ovar Keulen zu Kollagenase für einige Stunden, um die Auswahl von entblößte Eizellen und die Eizelle Mikroinjektions enthalten. Hier wird eine Reihe von alternativen, schnellen Verfahren berichtet, dass erlaubt haben, uns mit diesem Expressionssystem arbeiten, um für mehr als 30 Jahren ohne saisonale Schwankungen und eine geringe Variation in Oozytenqualität.
Die modifizierten und verbesserten Methoden , die hier für die Isolierung von Oozyten beschrieben, die Mikroinjektion mit cRNA und Entfernung von follikulären Zellschichten können für die Expression von jedem Protein der Wahl in der Xenopus Oozyten verwendet werden. Die sehr einfache Methode für die schnelle Lösung Änderungen des Mediums, um die Eizelle kann auf die Untersuchung von jeder ligandengesteuerten Ionenkanal und von Trägern aufgetragen werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tierversuche wurden vom lokalen Komitee des Kantons Bern Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Bern (BE85 / 15) zugelassen.
1. Herstellung von Xenopus - Oozyten
- Pflegen Frösche (Xenopus laevis) auf einem 12 h / 12 h Hell / Dunkel - Zyklus in Wasser , das streng bei 20 ° C gehalten wird.
- Entfernen Sie die Lappen der Ovarien von weiblichen Frösche 9.
HINWEIS: Die Entfernung der Lappen ist ein Anreiz für die Regeneration und häufig die Qualität der Oozyten verbessert sich mit der Operation. Die Eizelle wird durch eine Dotterschicht, eine Schicht von Follikelzellen und Bindegewebe enthalten , die Blutgefäße 21 abgedeckt. Die gesamte Struktur ist die "Follikel" bezeichnet. - Legen Sie die Lappen der Ovarien , die dicht gepackt sind mit den Follikeln die Eizellen in sterilen Barth Saline 7 (MBS) , ergänzt mit Penicillin und Streptomycin (88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mMNaHCO 3, 0,82 mM MgSO 4, 0,41 mM CaCl 2, 0,33 mM Ca (NO 3) 2, 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure; HEPES (pH 7,5, NaOH), 100 ug / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin).
- Einzel-out Stufe V-VI 21 Follikel. Halten Sie die Ovar Lappen mit einer Pinzette. Senken Sie die Platin - Schleife (Abbildung 1) über die Follikel und sanft die Schleife zurückziehen das Bindegewebe mit dem Follikel aus dem Eierstockgewebe zu zerstören.
HINWEIS: Stufe V-VI 21 Follikel durch ihre Größe gekennzeichnet sind (1,0 bis 1,2 mm Durchmesser) und durch den guten Kontrast zwischen dem dunklen pigmentierten Tier Hemisphäre und der gelblichen pflanzlichen Hemisphäre. - Übertragen Sie nur gesund aussehende Follikel (dh perfekt sphärisch und mit intakten Pigmentierung) zu einem Durchmesser von 35 mm Petrischale mit Hilfe einer Plastik Pasteur - Pipette (schneiden Sie die zurück zu einem Öffnungsdurchmesser von 1,5 mm).
Anmerkung: Die hier beschriebenen Mikroinjektionssystem von der durch Kressmann und Birnstiel 22 berichtet abgeleitet ist.
- Bereiten cRNAs von den entsprechenden cDNAs kodierend für die Untereinheiten der α 4 β 2 δ GABA A Rezeptor durch in vitro Transkription, die Zugabe eines Poly (A +) -Schwanz und RNA Quantifizierung durch Gelelektrophorese 23.
- Bereiten Sie die Mikroinjektion Pipetten aus Borosilikatglas Kapillaren (1,0 mm Außendurchmesser (OD), 0,58 mm Innendurchmesser (ID), 100 mm Länge) mit einer Mikropipette Puller. Brechen Sie die Spitzen der Glaskapillaren unter einem Mikroskop mit einem Mikromanipulator und microfilament mit einem Spitzendurchmesser von 12 zu schaffen - 15 & mgr; m mit einer abgeschrägten Spitze.
- Verfüllen die Mikroinjektionspipette mit Paraffinöl mit einem 10-ml-Spritze und dann montieren Sie die Mikroinjektionspipette auf ein selbstgebautes microinjection Vorrichtung (Abbildung 2).
HINWEIS: Die Selbstbau ölhydraulische Injektionsgerät besteht aus einem Grill Motor durch einen Fußschalter gesteuert. Ein zusätzlicher Schalter verändert den Drehbetrieb des Motors. Dieser Motor treibt eine Mikrometerschraube (0,5 mm / Umdrehung), die vor- oder zurückzieht, um den Kolben einer 10 & mgr; l-Glasspritze. Die Injektion mit einer Geschwindigkeit von etwa 3 Upm und eine 0,5 wiederum entspricht einer 50 nL Injektion in einen Follikel. Die Spitze der Spritze verbunden ist dickwandig Polytetrafluorethylen Schlauch, der sich an der Injektionsnadel durch ein sehr kurzes Stück Tygon-Schlauch verbunden ist. Die Injektions Kapillare wird durch ein Bohrfutter gehalten, die von einem Mikromanipulator gesteuert wird. Das gesamte System wird mit Paraffinöl gefüllt. Luftblasen sollten vermieden werden, da sie das Injektionssystem beeinträchtigt. Die Einrichtung ist mit einer Kaltlichtquelle beleuchtet. Ein Stereomikroskop ist für die optische Kontrolle erforderlich. Follikeln unter kaltem Licht mit einer stereomicr sichtbar gemachtOscope (40-facher Vergrößerung). Leistung der Einspritzaufbau wird durch die Injektion von radioaktiven Tracers in Xenopus Oozyten getestet. Ein Volumen von 45 - 55 nL sollte pro Injektion geliefert werden. - Mit einer Pipette mit einem sterilen Kunststoffspitze, testen Sie die Konfiguration durch einen Tropfen steriles Wasser auf die saubere innerhalb eines feuchtigkeitsbeständigen thermoplastischen Platzierung (2 x 2 cm). Tauchen Sie die Spitze der Injektionspipette in diesem Tröpfchen, und dann den Motor drehen Sie den Kolben (Unterdruck im Inneren der Injektionspipette) zurückzuziehen.
HINWEIS: Das Wasser sollte die Pipette eingeben und eine sichtbare Schnittstelle mit dem Öl bilden. - Ziehen Sie die Spitze der Pipette aus dem Tröpfchen und gelten Überdruck auf der Innenseite der Injektionspipette. Ein Wassertröpfchen sollte an der Spitze der Injektionspipette bilden.
- Vorbereitung für das Einspritzen der Follikel, indem sie sich mit den pflanzlichen Pole nach oben zeigend in den Zwischenräumen ein Nylonnetz (G: 0,8 mm) geklebt Futter auf den Boden eines Petri Schale (60 mm) mit MBS abgedeckt.
- Dispense 2 & mgr; l der mRNA eine Pipette mit einer sterilen Plastikspitze auf die saubere innerhalb eines thermoplastischen verwenden. Nehmen Sie die mRNA nach oben in die Injektionspipette durch Unterdruck auf der Innenseite der Injektionspipette aufgebracht wird.
- Positionieren Sie die Injektionspipette über einen einzelnen Follikel mit dem Mikromanipulator.
- Legen Sie die Injektionsnadel in der Mitte des vegetativen Pol und injizieren 50 nL der mRNA bei einer Flussrate von 0,6 & mgr; l / min durch Überdruck auf der Innenseite der Pipette angelegt wird. Warten von 5 bis 10 s vor der Injektion Pipettenspitze aus dem Follikel zu entfernen mRNA Flucht zu verhindern.
HINWEIS: Die mRNA sollte in das pflanzliche (gelblich) Pol injiziert werden, die Injektion in den Nucleus zu vermeiden, die in der Tier Hemisphäre befindet. - Übertragen Sie die injizierten Follikel auf eine neue Petrischale (35 mm), gefüllt mit 2 ml MBS. Die Schale in einen Weinkühler auf 18 ° C eingestellt. Inkubieren der injizierten Follikel für 1 -7 d vor der Aufnahme in Abhängigkeit von der Identität des neu exprimierten Proteins.
3. Abisolieren der Follikel (Figur 3)
HINWEIS: Wie oben erwähnt, ist die Eizelle von einem vitelline Schicht Follikelzellen bedeckt und Bindegewebe, die die Blutgefäße 24 enthält, ist bekannt als "Follikel." Alle Schichten mit Ausnahme der Dotterschicht, die ohne verhindert den Zugang von Lösungen an die Zelloberfläche mechanische Stabilität bietet, muss vor elektrophysiologischen Experimenten entfernt werden. Der Follikel ohne die umgebenden Zellschichten hat zuvor eine "entblößten" Eizelle 25 bezeichnet worden. Dieser Schritt wird in der Regel am selben Tag wie die elektrophysiologischen Experimenten durchgeführt.
- Transfer zehn injiziert Follikel mit einem Rohr Borosilicatglas 0,5 ml MBS, 1 mg / ml Kollagenase und 0,1 mg / ml Trypsin-Inhibitor enthält. Eintauchen des Rohres in ein Wasserbad bei 36 ° C gehalten. inkubieren derFollikel für 20 Minuten und schütteln gelegentlich die Rohre.
- Spülen Sie die Follikel, indem sie in ein zweites Röhrchen, das 1 ml MBS bei RT übertragen. Lassen Sie sie für etwa 10 s in die Röhre.
- Übertragung der Follikel mit einem dritten Rohr mit 0,5 ml doppelt konzentrierter MBS , enthaltend 4 mM Ethylenglycol-bis (2-aminoethylether) - N, N, N ', N'- tetraessigsäure (EGTA), und inkubiere sie für 4 min bei RT. Das Röhrchen wird gelegentlich.
HINWEIS: Die hypertonischen Lösung (doppelt konzentriert MBS) wird verwendet, innerhalb Follikel Zellschichten Schrumpfung der Eizellen zu induzieren, wodurch follikulären Zellschichten von der Eizelle löst; EGTA zugegeben Kollagenase-Aktivität zu hemmen. - Spülen Sie die Follikel, indem sie in ein zweites Röhrchen, das 1 ml MBS bei RT übertragen. Lassen Sie sie für etwa 10 s in die Röhre.
- Übertragen Sie die Eizellen in eine Petrischale (35 mm Durchmesser), die 2 ml MBS. Unter einem Stereomikroskop, trennen Sie die äußeren Hüllen aus den Follikeln voneinfaches Drücken die nackte Eizelle entfernt die Platin-Schleife.
HINWEIS: Die äußeren Einhüllenden der Oozyten fest an der Kulturschale haften und leicht aus den Oozyten getrennt werden können. Einige Eizellen spontan ihre äußeren Hüllen verlieren und als entblößte Eizellen gewonnen werden. Dieses Verfahren führt zu einer relativ stabilen Präparation, die die kugelförmige Erscheinung der Oozyten hält.
4. Schnelle Lösung Ändern Sie rund um die Oozyten
- Führen Sie eine Spannungsklemm Experiment, wie 9,26 beschrieben.
- Ändern, um die Lösung der Schwerkraft gespeisten Perfusionssystem durch die Perfusion Schalter drehen, wie durch den Versuch benötigt.
- Gelten die Perfusionslösung bei 6 ml / min durch eine Glaskapillare mit einem Innendurchmesser von 1,35 mm, die Mündung davon platziert ist etwa 0,4 mm von der Oberfläche der Oozyte, schnelle Veränderungen der Agonistenkonzentration zu erlauben um die Eizelle.
HINWEIS: Die Änderungsrate war vorher Schätzungd als 70% in weniger als 0,5 s 27.
- Gelten die Perfusionslösung bei 6 ml / min durch eine Glaskapillare mit einem Innendurchmesser von 1,35 mm, die Mündung davon platziert ist etwa 0,4 mm von der Oberfläche der Oozyte, schnelle Veränderungen der Agonistenkonzentration zu erlauben um die Eizelle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Xenopus - Oozyten wurden mit einer Platinöse mechanisch herausgehoben (Figur 1). 0,5: 2,5 fmol / Oocyte (Abbildung 2) Die Oozyten wurden mit mRNA kodierend für den GABA A -Rezeptor - Untereinheiten & agr; 4 & bgr; 2, δ, 0,5 mikroinjiziert. Nach 4 d wurden follicular Zellschichten entfernt werden (Abbildung 3). Oocyten wurden Spannung bei -80 mV eingespannt und ausgesetzt steigenden Konzentrationen von γ-Aminobuttersäure (GABA) in Gegenwart von 1 uM 3α, 21-dihydroxy-5α-pregnan-20-on (THDOC), ein potenter positive allosterische Modulator der GABA - A - Rezeptor. 4A zeigt ursprünglichen Stromspuren in einem solchen Experiment aufgezeichnet. 4B zeigt hervorgerufene Stromamplitude in Abhängigkeit von den GABA - Konzentrationen. Dies erlaubt die Bestimmung der Empfindlichkeit dieser Untereinheit-Kombination gegenüber GABA. Die einzelnen Kurven wurdenausgestattet und standardisiert auf I max und gemittelt anschließend. Die Gleichung war ich (c) = I max / (1+ (EC 50 / c) n), wobei c die Konzentration von GABA ist, 50 EG die Konzentration von GABA (in Gegenwart von 1 & mgr; M THDOC) Hervorrufen einer Hälfte - maximale Stromamplitude ist I max der maximale Stromamplitude, I die Stromamplitude ist, und n der Hill - Koeffizient. Die EG 50 des α 4 β 2 δ GABA - A - Rezeptor belief sich auf 0,41 ± 0,12 uM und n betrug 0,76 ± 0,04.
Abbildung 1: Platinschleife. Der Platindrahtschleife in Protokoll Schritt 1.4 erwähnt. Platin ist ein Metall, das ohne Erzeugung Splitter gebogen werden kann, und es klebt nichtBiologisches Material. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Eigenbau Mikroinjektions Vorrichtung. Das Gerät ist in Protokoll Schritt 2 a, Grillmotor beschrieben; b, Mikrometerschraube; c, Feder zwischen Spritze und Kolben; d, 10 & mgr; l - Glasspritze; e, dickwandigen Polytetrafluorethylen Schläuche; f, Hand Bohrfutter; g, Injektionspipette; h, Stereo; und i, Motorsteuerung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Schematische Darstellung der Defolliculation eines Oozyten. Oozyten werden zuerst in einer Kollagenase-Lösung in einem Wasserbad bei 36 ° C für 20 min inkubiert. Oocyten werden dann in einer modifizierten Barth-Medium gewaschen. Die endgültige Inkubationsschritt ist in einer hypertonischen EGTA-Lösung bei RT für 4 min. Als Ergebnis werden das Bindegewebe und die Follikelzellen entfernt Weg zum denudierten Oozyten zu geben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Aktuelle Spuren von einer Zwei-Elektroden - Voltage - Clamp - Experiment. EIN, Aktuelle Spuren von einer GABA-Konzentration-Antwort-Kurve in den presrenz von 1 uM THDOC aus einer Eizelle die A - Rezeptor α 4 β 2 δ GABA exprimieren Xenopus erhalten. Die Balken zeigen die Zeitdauer von GABA / 1 uM THDOC Perfusion. Steigende Konzentrationen an GABA wurden an den Oozyten angewendet, und die entsprechenden Stromamplituden wurden bestimmt. GABA-Konzentrationen werden über den Balken angegeben. B, Gemittelt Konzentrations - Wirkungs - Kurven des α 4 β 2 δ GABA - A - Rezeptor. Einzelne Kurven wurden zunächst normiert auf die Einbau maximale Stromamplitude und wurden anschließend gemittelt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD gezeigt, n = 3. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Methoden , die in diesem Artikel beschriebenen abweichen von denen traditionell 7-9 verwendet. Es ist Standard , um die Lappen der Ovarien auf eine 1 bis 2 h Kollagenasebehandlung 8 zu exponieren; isolieren unbeschädigte, entblößte Eizellen; und injizieren sie mit mRNA kommerzielle Injektionsgeräte verwenden. Dieses klassische Verfahren hat die folgenden Nachteile: 1) Die Oozyten werden wahrscheinlich durch die lange Exposition gegenüber hohen Konzentrationen von Kollagenase beschädigt werden. 2) Die instabilen entblößte Eizellen müssen bis zum Experiment gespeichert werden. 3) Denuded Eizellen sind eher bei der Mikroinjektion als Follikel zu leiden. Kommerzielle Injektionsvorrichtungen verwenden mit großem Durchmesser (etwa 20 um), Injektionsnadeln, wahrscheinlich in einer relativ hohen Rate einer Beschädigung führen. Die Vorteile des verbesserten Verfahrens hier beschrieben sind, sind wie folgt: Die Einwirkung der Kollagenase ist auf 20 min, denudierten Oozyten haben nicht gespeichert zu werden, und die kleinen Spitzendurchmesser der Pipetten (etwa 12 bis 15 um) für microinjecti verwendetauf erfordert keine vorherige "defolliculation" der Follikel für die mRNA-Injektion. Der einzige kritische Schritt besteht darin, dass die Follikel Inkubationstemperatur in Kollagenase-Lösung sollte sorgfältig auf 36 ° C eingestellt werden, und es sollte nicht überschreiten.
Lösungs Änderungen in elektrophysiologischen Experimenten, sehr oft die Lösung in der Messkammer geändert wird, die eine erhebliche Menge an Zeit in Anspruch nimmt, je nach Größe der Kammer und der Durchblutungsrate. Mit Hilfe der Perfusion Kapillare vermieden dies.
Der größte Nachteil der Expression von Ionenkanälen in Xenopus Oocyten ist ihre giant Größe. Die Spannungssteuerung schneller als etwa 2 ms ist schwierig und sehr schnell (<0,5 s) Lösung Änderungen erfordern aufwendige Verfahren. Weiterhin stark hydrophoben Substanzen können fast irreversibel an das Eigelb der Eizelle gebunden sein.
Die Methoden, die hier skizziert haben uns erlaubt, zu untersuchenin einer zeitsparenden Weise die funktionellen Eigenschaften von rekombinanten GABA A Rezeptoren, deren Modulation durch synthetische Verbindungen und Pflanzenstoffe, deren Untereinheit Anordnung und die Lage der Arzneimittelbindungsstellen in Rezeptoren verschiedener Untereinheit Zusammensetzung. Die hier beschriebenen Methoden sind für die Expression von jedem Protein der Wahl in der Xenopus Oozyte geeignet. Die sehr einfache Methode für die schnelle Lösung Änderungen des Mediums, um die Eizelle kann auf die Untersuchung von jeder ligandengesteuerten Ionenkanal oder einen Träger aufgetragen werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | 71380 | |
| KCl | Sigma | P-9541 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
| CaCl2 | Sigma | 223560 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/mL and 100 μg streptomycin/mL |
| Platinum wire loop | home-made | ||
| Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μL, Type 701N |
| Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
| Nylon net, G: 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
| Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
| Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
| EGTA | Sigma | E3389 | |
| Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 Length mm (for microinjection) |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD x 0.69 ID x 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
| γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
| 3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
| grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
| micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
| Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |
References
- Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells. Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).
- Soreq, H. The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes. CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).
- Sigel, E. Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins. J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).
- Dascal, N. The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels. CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).
- Sigel, E. Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid. J Physiol. 386, 73-90 (1987).
- Sigel, E., Minier, F. The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins. Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).
- Colman, A. Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes. Transcription and Translation'A Practical Approach. Hames, B. D., Higgins, S. J. , IRL Press. Oxford. 49-69 (1984).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M.
- Smart, T. G., Krishek, B. J. Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression. Patch-Clamp Applications and Protocols. Boulton, A. A., Baker,, Wolfgang, W. alz , Humana Press. New Jersey. 259-305 (1995).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital. Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity. Sci Rep. 6, 25943 (2016).
- Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Towards understanding functional properties and subunit arrangement of α4β2δ GABAA receptors. J Biol Chem. 291 (35), 18474-18483 (2016).
- Burgunder, J. M., et al. Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese. Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).
- Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes. FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei. J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth. Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).
- Wu, M., Gerhart, J.
- Gurdon, J. B. American clawed frogs. Methods in developmental biology. Wilt, F. H., Wessels, N. K. , Thomas Y. Crowell Co. New York. 75-84 (1967).
- Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation. Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).
- Green, S. L. Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis). Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).
- Kressmann, A. Birnstiel M.L. Surrogate genetics. Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells. Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. , Plenum Press. 388-407 (1980).
- Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site. Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).
- Dumont, J. N., Brummett, A. R. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues. J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).
- Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3',5'-cyclic monophosphate. J Physiol. 352, 551-574 (1984).
- Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides. Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).
- Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Möhler, H., Malherbe, P. The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function. Neuron. 5, 703-711 (1990).
