Insamling av Serum och Feeder fria Mouse embryonala stamceller konditionerade medium för ett cellfritt Approach
Summary
Detta protokoll ger en metod för insamling av mus embryonala stamceller (Mesc) -konditionerat medium (Mesc-CM) härstammar från serum (fetalt bovint serum, FBS) – och matar (mus embryonala fibroblaster, MEF) -fria förutsättningar för en cell -fri tillvägagångssätt. Det kan vara tillämplig för behandling av åldrande och åldersassocierade sjukdomar.
Abstract
The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.
Introduction
Målet med detta protokoll är att samla mus embryonala stamceller (Mesc) -konditionerat medium (Mesc-CM) från serum-och matarfria odlingsbetingelser och för att karakterisera dess biologiska funktioner.
I allmänhet, embryonala stamceller (ESC) har stor potential för regenerativ medicin och cellterapi på grund av deras pluripotens och förmåga till självförnyelse 1-3. Emellertid den direkta transplantation av stamceller har flera begränsningar, såsom immunavstötning och tumörbildning 4,5. Därför kan ett cellfritt förhållningssätt ger en alternativ terapeutisk strategi för regenerativ medicin och åldrande insatser 6,7.
Åldrande ses som en cellulär motsvarighet till den åldrande vävnader och organ, som kännetecknas av ett permanent tillstånd av tillväxthämning, förändrad cellfysiologi, och beteenden. Åldrande är den viktigaste riskfaktorn för sjukdomarna inklusive cancer, hjärt- och kärlsjukdomar, tYP 2-diabetes, och neurodegeneration 8. En av de uppenbara egenskaperna hos åldrande är nedgången i regenerativ potential vävnader, som orsakas av stamcells åldrande och utmattning 9. Många betydande studier har visat farmakologiska molekyler, såsom rapamycin 9, resveratrol 10, och metformin 11, och blodburna systemiska faktorer, nämligen GDF11 12, som har förmågan att konsekvent fördröja åldrande och förlänga livslängden.
I den aktuella studien har Mesc-CM skördats utan serum (fetalt bovinserum, FBS) och matare (mus embryonala fibroblaster, MEF) skikt för att utesluta kontaminering av serumfaktorer och sekretoriska faktorer från MEF. Dessa villkor är tillåtna för en serum-och matarfria CM som därmed möjliggjorde korrekt identifiering av Mesc specifika sekretoriska faktorer.
Denna föreslagna protokoll är mycket effektiv, relativt kostnadseffektiv och lättatt driva. Denna teknik ger insikter i karakterisering av Mesc härledda lösliga faktorer som kan förmedla en anti-åldrande effekt, som kan användas för att utveckla en säker och potentiellt fördelaktiga cellfritt terapeutiskt tillvägagångssätt mot insatser för äldre relaterade sjukdomar och andra regenerativ behandlingar.
Protocol
Representative Results
Discussion
För en framgångsrik insamling av serum-och feeder-fri Mesc-CM, bör följande förslag beaktas. Den mest kritiska faktorn är att använda tidig passage mESCs för insamling av Mesc-CM. Tidigare har det visat sig att en tidig passage Mesc-CM har bättre anti-aging effekter jämfört med slutet av passage mESCs. Passagen antalet mESCs har rapporterats påverka deras utvecklingspotential 16 och pluripotens 17.
Medan ytterligare forskning behövs för att analysera de sp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av Basic Science Research Program (2013R1A1A2060930) och Medical Research Center Program (2015R1A5A2009124) genom National Research Foundation of Korea (NRF), som finansieras av ministeriet för vetenskap, IT och framtida planering. Denna forskning stöds också av en start-up driftsbidrag från sjukhuset för sjuka barn (HK Sung). Vi vill tacka Laura Barwell och Sarah JS Kim för deras utmärkta hjälp att redigera detta manuskript och Dr Andras Nagy för att tillhandahålla G4 Mesc linje.
Materials
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50units/ml penicillin and 50mg/ml strepto |
| -mycin. | |||
| L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2mM |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100uM |
| β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100uM |
| Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100units/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1mg/ml |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5mM |
| potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2mM |
| Mytomycin C | Sigma | #M4287 | 10ug/ml |
| Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50ug/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| Bottle top filter, | Corning | #430513 | 0.2μm |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model. Nat Commun. 3, 608 (2012).
- Woo, D. H., et al. Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice. Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).
- Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
- Moon, S. H., et al. A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation. Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).
- Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age. Circulation. 118, 9-16 (2008).
- Lazarous, D. F., et al. Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial. J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).
- Adams, P. D. Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence. Mol Cell. 36, 2-14 (2009).
- Harrison, D. E., et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature. 460, 392-395 (2009).
- Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan. Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).
- Martin-Montalvo, A., et al. Metformin improves healthspan and lifespan in mice. Nat Commun. 4, 2192 (2013).
- Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153, 828-839 (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
- Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway. FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).
- Li, X. Y., et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).
- Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS. J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).
- Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).
- Kim, K. S., et al. Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells. Aging Cell. 6, 535-545 (2007).
- Kim, K. S., et al. Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism. Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).
- Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).
