Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Lys Sheet Fluorescensmikroskopi av planterøttene vokser på overflaten av en Gel

Published: January 18, 2017 doi: 10.3791/55044
Automatic Translation
1, 2, 1
1Developmental and Cell Biology of Plants, Institute of Science and Technology Austria, 2Bioimaging Facility, Institute of Science and Technology Austria

Introduction

En av de viktigste spørsmålene i forståelse anlegget utvikling er hvordan enkeltceller oppfører seg under orgel differensiering og vekst. Ideelt sett cellulære hendelser, som genuttrykksmønster og intracellulært protein lokalisering, kan ses i lys av en større sammenheng av vevet. Dette målet utgjør tekniske utfordringer og krever hele organ observasjon med høy romlig samt tidsmessig oppløsning over lengre perioder, som kan forårsake fototoksiske effekter. Siden planter raskt tilpasse seg miljøendringer, må vekstforhold bli kontrollert. For å gjøre langvarig avbildning uten å forstyrre den fysiologiske tilstand av anlegget, tre ting må sikres, 1) vekstbetingelser i prøvekammeret, 2) stabil prøve montering over lange tidsperioder, og 3) den avbildning med lav lysintensitet å unngå foto-skade og ikke-fysiologiske forhold.

Fysiologisk voksende Kondisjoneons i mikroskopet prøvekammeret er avgjørende for langsiktig eksperimenter. Det finnes en rekke protokoller som er tilgjengelige som beskriver avbildningsvekstkammer for konfokale mikroskop 1 - 3. Men introduserer konfokalmikroskopi høy lys intensitet til anlegget, noe som kan føre til stressreaksjoner og vanligvis hemmer veksten fire. I tillegg har de fleste konvensjonelle mikroskop tillate bare horisontal posisjonering av prøven, som ikke er optimal for planter, siden de forsøker å reorientere seg og vokse inn i vektoren av tyngdekraften. I løpet av de siste ti årene, har lys-ark mikros dukket opp som et kraftig verktøy for å fange opp utviklingen av store prøver på celle oppløsning for tidsperioder på opp til flere dager 5 - 9. Lys-ark mikroskopi tillater plassering av prøven vertikalt og blir stadig mer brukt i planteforskning studere rotutvikling 10-21, nylig gjennomgått av Berthet og Maizel 22. Mange av de nevnte studiene 10,13 - 18,21 ble optimalisert og utført i laboratoriet av Ernst HK Stelzer anvendelse av en spesiell måte å prøve monterings karakterisert ved voksende roten på overflaten av en gel 17. I disse studiene ble en skreddersydd mikroskop, karakterisert ved at anlegget holdes fra bunnen. I motsetning til flertallet av bredt tilgjengelige lys-ark mikroskoper holde prøven fra toppen. Således, denne fremstillingsmetoden kan ikke lett anvendes. Metoden som presenteres her gir en protokoll for de veletablerte på-montering metoden gjelder for OpenSPIM 23, en åpen tilgang plattform for å påføre og styrke Selektiv Plane Illumination Mikroskopi (SPAM).

Det overordnede målet med denne protokollen er å gi langsiktig avbildning av Arabidopsis røtter i OpenSPIM lys-ark mikroskop. Dette oppnås ved å dyrke en plante oppreist på surface av en gel med røttene i et flytende medium mens bladene forblir i luften. For å sikre fotosyntetiske aktivitet av anlegget, tennes et skreddersydd lyssystem bladene, men ikke røttene (figur 1).

Protocol

1. Arabidopsis Dyrking før bildebehandling

  1. Forbered ½ MS medium (halv styrke Murashige og Skoog-medium) ved å tilsette 2,15 g MS-mediet, 10 g sukrose, 0,97 g MES (2- (N -morpholino) etansulfonsyre) og en L DDH 2 O (dobbeltdestillert vann ) i en 1-liters flaske. Juster pH-verdien til 5,8 ved hjelp av KOH.
  2. Tilsett 15 g / l gellan-gummi til ½ MS medium og autoklavere den i 20 minutter ved 121 ° C.
  3. Hell 30 ml av det varme medium i kvadratiske petriskåler (245 x 245 x 25 mm) for å opprette et lag av gel med en tykkelse på ca. 2 mm. La retter avkjøles til romtemperatur for å tillate mediet å stivne.
  4. Sette steriliserte Arabidopsis frø inn i et 1,5 ml reaksjonsrøret inneholdende 1 ml steril H2O plukke opp frøene ved hjelp av en glass pipette eller en 1000 ul pipettespiss og sår dem på overflaten av gelen. Plasser frøene separat ca 10 mm fra hverandre. Tett plate med tape.
  5. Platen inkuberes i 24 timer ved 4° C (lagdeling).
  6. Dyrke plate i en inkubator vekst, for eksempel ved 22 ° C i en 16/8 h dag / natt syklus med 120-140 pmol / m / s mengden av lys i 6 dager. Opp til 10 dager gamle planter kan anvendes.

2. Plant Prøvepreparering Method

Merk: Prøveholderen kan enten 3D trykte eller håndlaget i en maskin verksted ved hjelp av dimensjoner som er avbildet i figur 2C. 3D-modellen fil er gitt i supplerende materiale (Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl). Se link for bestilling av 3D-print i materialliste.

  1. Tilsett 5 g lav-smelte agarose i en 50 ml flaske som inneholder 50 ml ½ MS medium og autoklavere den i 20 minutter ved 121 ° C.
  2. Alikvot 1% lavtsmeltende agarose-løsning i 1,5 ml reaksjonsrørene. Oppbevar ved 4 ° C (kan brukes i minst to måneder).
  3. Smelt en delmengde av en %% lavt smelte agarose ved 80 ° C og la det avkjøles til33 ° C.
  4. Rengjør prøveholderen i en ultralyd enhet. Sterilprøveholderen med 70% etanol og vask med sterilt vann.
  5. Skjær gel rundt anlegget ved hjelp av en skalpell.
  6. Løft blokken med en flat spatel og skyv den forsiktig på prøveholderen ved hjelp av en andre slikkepott.
  7. Lim gelen på prøveholderen med 1% agarose (ved 33 ° C) under anvendelse av en 100 ul pipette.
  8. Lim anlegget på gelen med 1% agarose ved hjelp av en 10 ul pipette. Bruk en stereo mikroskop for å verifisere at bladene ikke er dekket med gel. Ikke plasser gel direkte på regionen av interesse.
  9. For å hindre at planten tørker ut, jobbe uavbrutt. Sett prøveholder inn i et 1000 mL pipettespiss når det er mulig. Bruk pipettespiss som en hette og skyve det forsiktig over den ene ende av prøveholderen, hvor anlegget er plassert.
  10. Sett prøveholderen i en pipette tips boksen og forberede flere planter om nødvendig. Planter kan være rettly avbildes eller sette tilbake i vekst kuvøse.

3. Sett opp mikroskopet

MERK: LED-belysning system er en spesialbygd lampe. De tekniske detaljene som kreves for å bygge LED-ringen kan bli funnet i figur 3, og materialet listen. Se supplerende materiale fil (Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd) for styret design.

  1. Skrue eller lim (for eksempel dobbeltsidig tape) LED-ringen på den nedre side av OpenSPIM x / y / z / θ-trinns arm.
  2. Koble LED ring med en justerbar strømforsyning (0-30 V, maks 2 A).
  3. Justere spenningen til ønsket lysintensitet (for Arabidopsis, 120-140 umol / m2 / s, figur 3D).
  4. Sterilprøvekammeret med 70% etanol og vask med sterilt vann.
  5. Rengjør objektiv med bensin og linsepapir. Sterilisere objektiv med 70% etanol.
  6. Koble perfusipå rør til prøvekammeret i en enveisanordning. Sett en 1 liters flaske inneholder frisk ½ MS medium og en annen tom flaske ved siden av den peristaltiske perfusjon pumpe. Koble flaske med medium med det nedre innløp av prøvekammeret ved hjelp av en perfusjon rør. Koble øvre utløp av prøvekammeret med den tomme flasken for å kaste brukte medium med en annen perfusjon rør.
  7. Sette hastigheten av strømningen til 1 ml / min.
    NB: For å ikke overspill prøvekammeret, er det viktig å ha en høyere strøm enn innløps. Enten øke pumpehastigheten eller bruke et rør med en større innvendig diameter for utstrømningen.
  8. Skjær en svart plastfolie i 3 mm små firkanter, vask med 70% etanol og la dem tørke før du legger dem i prøvekammeret på vannoverflaten.
  9. Fjern det pipettespiss fra prøveholderen og sett prøveholderen i prøvekammeret. Hvis nyprodusert prøveholderen ikke passer inn i den fasen armen, bruker du en fin sandpapir for å gjøre den tynnere, eller bruk av en O-ring (∅ 6 mm) i tilfelle den er for tynn.
  10. For å opprette lokkene, klippe den svarte aluminiumsfolie i to 50 x 25 mm stykker. Lag en 5 mm kutt i midten av en side av hvert stykke. Brett for å lage en trekant innrykk (figur 1D). Lukker prøvekammeret med de to lokkene ved å sette et lokk på toppen av prøvekammeret med trekant fordypninger som vender mot prøveholderen. Pass på at planten bladene er ikke i skyggen av lokkene og motta lys fra lyssystemet.
  11. Finn den regionen av interesse å bruke x / y / z og rotasjon scenen for å plassere en ny side rot i synsfeltet.
  12. Før innspillingen, la systemet stabilisere seg i minst 15 min.
  13. Oppsett bildet oppkjøpet.
    1. Sett en stabel av 217 bilder med tre mikrometer z-avstanden (650 nm) og stille inn tiden lapse med 15 min bildeintervallet for en total periode på 17 timer.
      MERK: En detaljert dokumentasjon omhvordan å operere OpenSPIM programvaren kan bli funnet på (http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack).
  14. Start opptaket.

Representative Results

Denne prøven fremstillingsmetode tillater dyrking av anlegget inne i mikroskopet prøvekammeret mens observere rotsystemet med en lys-ark mikroskop (figur 1). Planten vokser på overflaten av et lag av gel (½ MS medium inneholdende 1,5% gellangummi) montert på et spesialdesignet prøveholder (figur 2). Prøveholderen er 3D skrives ut med en gjennomsiktig harpiks som materiale. En fremstilt versjon fremheve de dimensjoner er vist i figur 2C. Røttene er nedsenket i væske (½ MS medium), som kontinuerlig oppdateres av en perfusjon system. Bladene forblir i luften og blir kontinuerlig belyst med en lysintensitet på 130 umol / m / s som kommer fra blå og røde lysdioder som er anordnet i en ring over anlegget (figur 1 A, B og figur 3A-C). LED-ring er produsert i vår maskin verksted ogVi tilbyr tekniske detaljer om hvordan å bygge LED-ringen i figur 3 og materialliste. Lysintensiteten kan justeres kontinuerlig varierende 30-250 umol / m 2 / s (figur 3D). Rotsystemet er skyggelagt av små plater av en svart plast folie som dekker vannflaten (figur 1). Enhver strølys fra belysning som er samlet inn av deteksjons objektivet er filtrert av GFP filter (Figur 3E).

Med dette oppsettet var en tid forfalle av en voksende Arabidopsis lateral root innspilt i 17 timer med en 20X / 0.5-objektiv (figur 4). Den laterale rot har sin opprinnelse i pericycle cellelaget, som ligger dypt inne i den primære roten. For å demonstrere bildemulighetene enda dypere inne i et vev i lengre tidsperioder, ble en høyere forstørrelse (40x / 0,75) brukes til å fange dannelse av en lateral root fra det første trinn primordium til fremveksten ut av den primære rot i løpet av et tidsrom på 38 timer (figur 5). Et eksempel på en 2D stykke av datasettet er vist i fig. 5B. Denne innspillingen tillater oss å følge dynamikken i lateral root formasjon i 3D (figur 5A) med en mobil løsning.

Figur 1
Figur 1: Økende forholdene inne i OpenSPIM prøvekammeret. A) Skisse av bildekammeret. Planten vokser oppreist på overflaten av en gel, som er montert på en spesialbygget prøveholder (se også figur 2). Røttene vokser i et flytende medium, som kontinuerlig utvekslet med et perfusjon system. Anlegget later vokse i luft og er opplyst av røde og blå lysdioder (se også figur 3). Rotsystemet er skyggelagt vidd h små ark av et svart plast folie som dekker vannflaten. Et lokk laget av to stykker av svart aluminiumsfolie ytterligere reduserer mengden av lys under vannflaten og opprettholder fuktigheten i prøvekammeret. Det forstørrede panel på høyre side fremhever den plante som vokser på overflaten av en blokk av gel nedsenket i det flytende medium. En dråpe av agarose monterer rot på gelen. Den stiplede boksen indikerer regionen av interesse observert av mikroskopet. B) Fotografi av bildekammeret (uten lokk). Tallene (1) - (10) i A og B representerer: (1): x / y / z / θ-trinns med LED-ring, (2) prøveholderen (3) lokk (4): Arabidopsis thaliana , (5): ark av sort plast folie, (6): perfusjon system, (7): deteksjon objektivlinse, (8): flytende medium, (9): prøvekammeret (10): belysning objektiv. C) Lokket er laget av to stykker av svart aluminiumsfolie. target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Utvalget holder. A) 3D-modell. 3D-modellen fil er gitt i supplerende materiale. B) Fotografi av 3D-utskrifter ved hjelp av ulike materialer (1) - (3): gjennomsiktig akryl plast, (4) og (5): harpiks, (6): gjennomsiktig harpiks. C) Teknisk tegning av prøveholderen, tallene representerer millimeter. D) Fotografi av den fremstilte prøveholderen med en plante montert. Den stiplede området kan bli observert av mikroskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

laste opp / 55044 / 55044fig3.jpg "/>
Figur 3: Plant belysning oppsett. A) Skjematisk kretsdiagram av lampen. Par av lysdioder kan slås av / på individuelt for retnings lyn. LED: light-emitting diode, R: motstand, T: transistor, JP: knappenålshode. B) Den endelige utformingen av belysning lampen ble tegnet med en PCB-programvare (PCB: kretskortet). Vi gir styret design filen i supplerende materiale. Styret ble deretter produsert og montert i vår instituttets MIBA maskinverksted. C) Fotografi av LED-ringen slått på. Fire par av en rød og en blå LED er anordnet i en ring. D) De ulike spenning kan justeres mellom 3,5 V og 14,0 V. Resistances ble anvendt for å oppnå mengden av lys i området 30-250 umol / m 2 / s (R1-8: 220 Ohm, R9-12: 1220 Ohm ). E) Utslipps spekteret av lampen, GFP og YFP. tp: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Tid lapse opptak av Arabidopsis thaliana lateral root. Den 5 dager gamle frøplante uttrykker en membran markør (pUBQ10 :: YFP-PIP1, 4) og en kjernefysisk reporter (pGATA23 :: NLS-GUS-GFP) spesifikt merking pericycle celler som utvikler seg til en lateral root. En stabel av 217 bilder (3 mikrometer z-avstand) ble tatt hvert 15 min i 17 timer opptak med en 20X / 0.5 objektiv. A) Fire tidspunkter av 69 er vist i en maksimal intensitet projeksjon. B) Seks av 217 enkelt skiver av en z-bunke med ett tidspunkt vises. Skala barer i A og B representerer 100 mikrometer.belastning / 55044 / 55044fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Tid lapse opptak av Arabidopsis thaliana lateral root. Den 6 dager gamle frøplante uttrykker en membran markør (pUBQ10 :: YFP-PIP1, 4) og en kjernefysisk reporter (pGATA23 :: NLS-GUS-GFP) spesifikt merking pericycle celler som utvikler seg til en lateral root. En bunke med 200 bilder (1,5 mikrometer z-avstand) ble tatt hver 15 min for 38 timer opptak med en 40X / 0.75 objektiv. A) 3D-rendring av fire tidspunkter, tallene i nettet representerer um, B) enkeltsnitt gjennom midtplanet av hoved roten. Scale bar representerer 50 mikrometer. Vær så snillKlikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl. 3D-modellen fil er gitt. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplemental File LED Ring Board.brd. Styret utformingen fil er gitt. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Lett Blad Fluorescensmikroskopi har den store fordel å kombinere lav fototoksisitet og ultra anskaffelse hastighet, som kan brukes til å fange et stort volum med et høyt rom-tid-oppløsning samtidig holde prøven i en fysiologisk tilstand. Oppløsningen av en lys ark mikroskop kan sammenlignes med den for et konfokalt mikroskop 9. Imidlertid lysspredning og absorpsjon skjer langs eksitasjon og emisjon sti enkeltvis og den generelle bildekvaliteten kan være betydelig lavere på innsiden ugjennomsiktig vev i forhold til overflaten. For å unngå denne komplikasjon kan man benytte muligheten til å rotere prøven langs den vertikale aksen, og observere det samme volum fra forskjellige retninger. Men dette er ikke alltid en fordel, for eksempel lateral røtter dukke opp på den ene siden av roten og bildebehandling bakfra resulterer i en lav bildekvalitet uten å få mer informasjon. Imidlertid kan rotasjons hovedsak skal brukes for å posisjonere sample på best mulig måte. Den klassiske horisontale anordning av objektivlinser åpner for nye måter å prøve montering. Planter dra nytte av en vertikal posisjon. Presentert her, er "på overflaten av gelen" monteringsmetode har flere fordeler sammenlignet med andre festemetoder, slik som å bygge inn roten innsiden av en gel 24,25. 1) Den rotsystemet er i direkte kontakt med det flytende medium. Prøvekammeret er koblet til en perfusjon system som tilveiebringer kontinuerlig friskt medium. Den kan også brukes til hurtig å utveksle hele volumet av prøvekammeret for å bruke forskjellige medier eller medikamenter. 2) Før prøveopparbeidelse planter vokser som de er vant til å dyrke i laboratorier. Planter kan velges under en fluorescens mikroskop og bare de ønskede planter trenger å være forberedt. 3) anlegget blir overført fra petriskålen til prøveholderen, uten å bli berørt. Derved kan anlegget kan videreutvikle på den samme gelen det vokste på i vekst incubator og mekaniske påkjenninger reduseres til et minimum. 4) Visningen på prøven er uhindret og optiske aberrasjoner blir minimalisert fordi rommet mellom prøven og deteksjons målet er utelukkende fylt med medium og ingen andre materialer med forskjellige brytningsindekser.

For å kunne utføre langvarige avbildning, er anlegget belysningssystemet er nødvendig for å sikre at fotosyntetiske aktivitet av anlegget. I de fleste laboratorier planter vokser på en gjennomsiktig gel, dvs. røttene blir utsatt for lys. Dette kan føre til ulike reaksjoner på deres miljø og induserer endringer i biokjemi og utvikling 26,27. For å redusere mengden av lys på rotsystemet, ble sort plast folie som brukes til å dekke vannflaten, samt et lokk fremstilt av svart aluminiumsfolie dekket prøvekammeret. Lys kan nå planten går ut gjennom det sentrale hull i lokket. I dette oppsettet, ble det ikke observert noen økning i bakgrunnslyset, suggesting at ​​mengden av strølys fra de røde og blå lysdioder ble betydelig redusert ved GFP filter og skyggelegging tilnærminger. Dette gjorde holde lyset slått på under bildet oppkjøpet uten å øke kameraets bakgrunnsstøy.

Prøveholderen er designet for 3D-utskrift. Imidlertid er valget av materiale avgjørende som flere plastmaterialer som ble testet ikke var 100% stabilt, noe som resulterer i en drift av prøven. Derfor er det anbefalt å bruke harpiks i stedet, eller bygge prøveholderen ved å frese en Polyetylen (PEP) stang. Ved bruk av en lett plate mikroskop oppsett med dobbeltsidig belysningssystem prøveholderen kan påvirke en av de lette plater, avhengig av rotasjonsvinkelen. For å redusere mekanisk påkjenning under øste anlegget fra platen, bruk en flat vinkel på slikkepott. Anlegget kan raskt tørke ut og erfaring luftstrøm for aller første gang. Prøv å unngå luft utkast (raske bevegelser, air-condition flow), work uavbrutt og skyv prøveholderen inn i en 1000 mL pipette tips når det er mulig. Inne i mikroskop, er det viktig å ikke dyppe hele anlegget i flytende og holde bladene tørre.

Teknikken er ideell for avbilding av tidlige stadier av lateral rot formasjonen. Når du utfører langsiktig avbildning av modne root tips man må huske på at Arabidopsis røttene vokser med 100-300 nm / t raskt ut av synsfeltet. En veldig nyttig fremtidig implementering kan være en automatisert sporing algoritme, som ville tillate følgende rotspissen vekst over lengre perioder. Evnen til å kontrollere omgivelsesforhold som lys og næringsblanding av mediet under innhentingsprosessen gjør det mulig å undersøke hvordan plantene tilpasse seg endringer. Roten er i direkte kontakt med det flytende mediet, som kan anvendes for å påføre legemidler for kjemisk å aktivere genekspresjon, for eksempel ved anvendelse av deksametason-induserbar 28 eller den β-estradiol induserbar system 29. Det tar imidlertid tid å bytte hele volumet av prøvekammeret for å vaske ut et medikament. Oppsettet kan forbedres ved å minimere volumet av prøvekammeret for å akselerere medium utveksling. Likevel har denne teknikken et stort potensial. Kombinasjonen av monteringsprosedyren, standardiserte vekstforhold og den milde bilde oppkjøpet ved hjelp av lys-ark mikroskopi tillater langtidsstudier av anlegget utvikling med høy oppløsning på en fysiologisk nivå. Dette vil hjelpe forskerne til å utforske grunnleggende mekanismer av planteutvikling.

Acknowledgments

Vi takker Matyáš Fendrych for kritisk lesing / visning og Stephan Stadlbauer for lydutstyr. Takket være Miba Machine Shop på IST Østerrike for deres bidrag til OpenSPIM. Den forskning som fører til disse resultatene har mottatt støtte fra Folke Programme (Marie Curie Actions) i EUs sjuende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) under REA tilskuddsavtalen n ° [291734] og European Research Council (prosjekt ERC-2011 -StG-20101109-PSDP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose, low melting VWR AFFY3282125GM
Black aluminum foil Thorlabs BKF12
Black plastic foil Carl Roth HT83.2
LED blue (453 nm) OSRAM LD CN5M-1R1S-35-1
LED red (625 nm) OSRAM LR T66F-ABBB-1-1
LED board - PCB design software Cadsoft Eagle
MES monohydrate Duchefa M1503.0100
Micropore Surgical Tape 3M 1530-1
Murashige & Skoog Medium (MS-Medium) Duchefa M0221
Phytagel Sigma-Aldrich P8169
Sample holder 3D print i.materialise https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1
Square Petri dishes (245 x 245 x 25 mm) VWR 734-2179
Sucrose Sigma-Aldrich 84097-1KG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grossmann, G., Guo, W. -J., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
  2. Busch, W., Moore, B. T., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).
  3. Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods. Plant Methods. 11 (1), 22 (2015).
  4. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. Plant J. 36 (2), 280-290 (2003).
  5. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  6. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  7. Keller, P. J., Schmidt, A. D., et al. high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
  8. Höckendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. Quantitative Analysis of Embryogenesis: A Perspective for Light Sheet Microscopy. Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).
  9. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat Methods. 12 (1), 23-26 (2015).
  10. Maizel, A., Von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy. Plant J. 68 (2), 377-385 (2011).
  11. Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy. PLoS ONE. 6 (6), e21303 (2011).
  12. Costa, A., Candeo, A., Fieramonti, L., Valentini, G., Bassi, A. Calcium Dynamics in Root Cells of Arabidopsis thaliana Visualized with Selective Plane Illumination Microscopy. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
  13. Šamajová, O., Takáč, T., von Wangenheim, D., Stelzer, E. H. K. Update on methods and techniques to study endocytosis in plants. Endocytosis in Plants. , 1-36 (2012).
  14. Rosquete, M. R., Von Wangenheim, D., et al. An auxin transport mechanism restricts positive orthogravitropism in lateral roots. Curr Biol. 23 (9), 817-822 (2013).
  15. Lucas, M., Kenobi, K., et al. Lateral root morphogenesis is dependent on the mechanical properties of the overlaying tissues. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (13), 5229-5234 (2013).
  16. Vermeer, J., von Wangenheim, D., et al. A Spatial Accommodation by Neighboring Cells Is Required for Organ Initiation in Arabidopsis. Science. 343 (6167), 178-183 (2014).
  17. Von Wangenheim, D., Daum, G., Lohmann, J. U., Stelzer, E. H. K., Maizel, A. Live Imaging of Arabidopsis Development. Arabidopsis Protocols. 1062, 539-550 (2014).
  18. Berson, T., von Wangenheim, D., et al. Trans-Golgi network localized small GTPase RabA1d is involved in cell plate formation and oscillatory root hair growth. BMC Plant Biol. 14 (1), 252 (2014).
  19. Langhans, M., Meckel, T. Single-molecule detection and tracking in plants. Protoplasma. 251 (2), 277-291 (2014).
  20. Novak, D., Kucharova, A., Ovecka, M., Komis, G., Samaj, J. Developmental nuclear localization and quantification of GFP-tagged EB1c in Arabidopsis root using light-sheet microscopy. Front Plant Sci. 6, (2015).
  21. Von Wangenheim, D., Fangerau, J., et al. Rules and Self-Organizing Properties of Post-embryonic Plant Organ Cell Division Patterns. Curr Biol. 26 (4), 439-449 (2016).
  22. Berthet, B., Maizel, A. Light sheet microscopy and live imaging of plants. J Microsc. , (2016).
  23. Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat Methods. 10 (7), 598-599 (2013).
  24. de Luis Balaguer, M. A., et al. Multi-sample Arabidopsis Growth and Imaging Chamber (MAGIC) for long term imaging in the ZEISS Lightsheet Z.1. Dev Biol. 419 (1), (2016).
  25. Ovečka, M., Vaškebová, L., Komis, G., Luptovčiak, I., Smertenko, A., Šamaj, J. Preparation of plants for developmental and cellular imaging by light-sheet microscopy. Nat Protoc. 10 (8), 1234-1247 (2015).
  26. Yokawa, K., Kagenishi, T., Kawano, T., Mancuso, S., Baluška, F. Illumination of Arabidopsis roots induces immediate burst of ROS production. Plant Signal Behav. 6 (10), 1460-1464 (2011).
  27. Silva-Navas, J., et al. D-Root: a system for cultivating plants with the roots in darkness or under different light conditions. Plant J. 84 (1), 244-255 (2015).
  28. Aoyama, T., Chua, N. -H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. Plant J. 11 (3), 605-612 (1997).
  29. Brand, L., et al. A versatile and reliable two-component system for tissue-specific gene induction in Arabidopsis. Plant Physiol. 141 (4), 1194-1204 (2006).

Tags

Plant Biology Lightsheet Mikros Lys-ark lys Sheet Fluorescensmikroskopi LSFM Selektiv Plane Illumination Mikros SPAM Arabidopsis planter fluorescens mikroskopi organogenesen utvikling
Lys Sheet Fluorescensmikroskopi av planterøttene vokser på overflaten av en Gel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

von Wangenheim, D., Hauschild, R.,… More

von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel. J. Vis. Exp. (119), e55044, doi:10.3791/55044 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter