Ljus Sheet fluorescensmikroskopi av växtrötter som växer på ytan av en gel

Introduction

En av de viktigaste frågorna i förståelse växtens utveckling är hur enskilda celler beter under organdifferentiering och tillväxt. Helst cellulära händelser, såsom gen-uttrycksmönster och intracellulär proteinlokalisering, kan ses i ljuset av ett större sammanhang av vävnaden. Detta mål innebär tekniska utmaningar och kräver hela organ observation med en hög rumslig liksom temporal upplösning över längre tidsperioder, vilket kan orsaka fototoxisk effekt. Eftersom växter snabbt anpassa sig till förändringar i miljön, måste de växande villkor hårt kontrollerad. För att göra en långsiktig avbildning utan att störa den fysiologiska tillstånd av anläggningen, har tre saker att säkerställas, 1) odlingsförhållanden i provkammaren, 2) stabil prov montering under långa tidsperioder, och 3) bild med låga ljusintensiteter för att undvika bild-skador och icke-fysiologiska betingelser.

Fysiologisk växande conditions i mikroskop provkammaren är avgörande för långtidsförsök. Det finns ett antal protokoll som finns tillgängliga som beskriver avbildande odlingskammare för konfokala mikroskop ^{1 - 3.} Emellertid introducerar konfokalmikroskopi hög ljusintensitet till anläggningen, vilket kan orsaka stressreaktioner och vanligtvis hämmar tillväxten ^4. Dessutom har de flesta konventionella mikroskop tillåter endast horisontell positionering av provet, vilket inte är optimalt för växter eftersom de försöker att omorientera sig och växa till vektorn av tyngdkraften. Under de senaste tio åren har ljus ark mikroskop framträtt som ett kraftfullt verktyg för att fånga utvecklingen av stora prover på cell upplösning för tidsperioder av upp till flera dagar ^{5 - 9.} Ljus ark mikroskopi tillåter placering av provet vertikalt och används alltmer inom växtforskning studerar rotutveckling ^10-21, som nyligen granskats av Berthet och Maizel ^22. Många av de nämnda studierna ^{10,13 - 18,21} var optimerade och genomförs i laboratoriet Ernst HK Stelzer utnyttjar ett speciellt sätt att provet montering präglas av växande roten på ytan av en gel ^17. I dessa studier var en skräddarsydd mikroskop används, där växten hålls från botten. Däremot var majoriteten av i stort sett tillgängliga mikroskop ljus ark hålla provet från toppen. Således, denna speciella framställningsmetod kan inte lätt anbringas. Den metod som presenteras här ger ett protokoll för den väletablerade på ytmontering metod som är tillämplig för OpenSPIM ^23, en öppen tillgång plattform för att tillämpa och förbättra Selektiv Plane Belysning Microscopy (SPIM).

Det övergripande målet med detta protokoll är att möjliggöra en långsiktig avbildning av Arabidopsis rötter i OpenSPIM ljus ark mikroskop. Detta åstadkoms genom att odla en växt upprätt på de surface av en gel med rötterna i ett vätskemedium medan bladen förblir i luften. För att säkerställa en fotosyntetisk aktivitet av anläggningen, belyser en skräddarsydd belysningssystem bladen men inte rötterna (figur 1).

Protocol

1. Arabidopsis Odling Före Imaging

1. Förbereda ½ MS-medium (halv styrka Murashige och Skoog-medium) genom att tillsätta 2,15 g MS-medium, 10 g sackaros, 0,97 g MES (2- (N morfolino) etansulfonsyra) och en L DDH ₂ O (dubbeldestillerat vatten ) in i en 1 L flaska. Justera pH till 5,8 med hjälp av KOH.
2. Tillsätt 15 g / L gellangummi till ½ MS-medium och autoklavera den under 20 min vid 121 ° C.
3. Häll 30 ml av den varma mediet i fyrkantiga Petri-skålar (245 x 245 x 25 mm) för att skapa ett skikt av gel med en tjocklek av ca 2 mm. Låt skålarna svalna till rumstemperatur för att tillåta mediet att stelna.
4. Sätta steriliserade Arabidopsis frön in i en 1,5 ml reaktions rör innehållande 1 ml sterilt _H2O Plocka upp fröna med användning av en glas pipett eller en 1000 mikroliter pipettspets och sår dem på ytan av gelén. Placera frön separat ca 10 mm från varandra. Förslut plattan med tejp.
5. Inkubera plattan i 24 h vid 4° C (skiktning).
6. Odla plattan i ett tillväxt inkubator, t ex vid 22 ° C i en 16/8 h dag / nattcykel med 120-140 | imol / m ^ / s mängden ljus i 6 dagar. Upp till 10 dagar gamla växter kan användas.

2. Växtprovberedning Metod

Obs: Provhållaren kan antingen 3D tryckta eller handgjorda i en maskinverkstad med hjälp av dimensioner som visas i figur 2C. 3D-modellen filen är anordnad i det kompletterande materialet (Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl). Se länk för beställning av 3D tryck i materiallistan.

1. Lägg 5 g låg-smält agaros i en 50 ml flaska innehållande 50 ml ½ MS-medium och autoklavera den under 20 min vid 121 ° C.
2. Alikvotera 1% låg-smält agaros-lösning i 1,5 ml reaktionsrör. Lagra vid 4 ° C (kan användas i minst två månader).
3. Smält en delmängd av en %% låg smältpunkt agaros vid 80 ° C och låt det svalna till33 ° C.
4. Rengör provhållaren i en ultraljudsenhet. Sterilisera provhållaren med 70% etanol och tvätta med sterilt vatten.
5. Skär gel runt anläggningen med hjälp av en skalpell.
6. Lyft block med en platt spatel och skjut försiktigt på provhållaren med hjälp av en andra spatel.
7. Limma gelen på provhållaren med 1% agaros (vid 33 ° C) med användning av en 100 mikroliter pipett.
8. Limma anläggningen på gelén med 1% agaros med användning av en 10 mikroliter pipett. Använda ett stereomikroskop för att kontrollera att bladen inte är täckta med gel. Placera inte gelen direkt på regionen av intresse.
9. För att förhindra växten från att torka ut, arbeta oavbrutet. Sätt in provhållaren i en 1000 mikroliter pipettspets när det är möjligt. Använda pipettspetsen som ett lock och skjut den försiktigt över en ände av provhållaren, där anläggningen är placerad.
10. Placera provhållaren i en pipettspets rutan och förbereda fler växter vid behov. Växter kan vara directly avbildas eller sätta tillbaka i tillväxt inkubatorn.

3. Ställ in mikroskop

OBS: LED-belysningssystemet är en specialbyggd lampa. De tekniska detaljerna som krävs för att bygga upp den LED-ringen kan återfinnas i Figur 3 och materialet listan. Se kompletterande material filen (Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd) för ombord design.

1. Skruv eller lim (t.ex. dubbelhäftande tejp) LED ringen på den nedre sidan av OpenSPIM x / y / z / θ steg arm.
2. Anslut LED ring med en justerbar strömförsörjning (0-30 V, max 2 A).
3. Justera spänningen till önskad ljusintensitet (för Arabidopsis, 120-140 mikromol / m ² / s, figur 3D).
4. Sterilisera provkammaren med 70% etanol och tvätta med sterilt vatten.
5. Rengör objektiv med bensin och linsrengöringsservett. Sterilisera objektivlins med 70% etanol.
6. Anslut perfusipå rör till provkammaren i en enkelriktad anordning. Sätt en 1 L flaska innehållande färsk ½ MS-medium och en annan tom flaska bredvid den peristaltiska perfusion pumpen. Ansluta flaskan med medium med den nedre inloppet till provkammaren med hjälp av en perfusion rör. Anslut den övre utlopp provkammaren med den tomma flaskan till papperskorgen använda mediet med hjälp av en annan perfusion rör.
7. Ställa in hastigheten på flödet till 1 ml / min.
   OBS: För att inte överhörningen provkammaren, är det viktigt att ha en högre utflöde än inflödet. Antingen öka pumphastigheten eller använda ett rör med en större innerdiameter, för utflöde.
8. Skär en svart plastfolie i 3 mm små fyrkanter, tvätta med 70% etanol och låt dem torka innan de placeras i provkammaren på vattenytan.
9. Avlägsna pipettspetsen från provhållaren och sätt in provhållaren i provkammaren. Om nytillverkade provhållaren inte passar in på scenen armen, använd en fin sandpapper för att göra det tunnare eller använda en O-ring (∅ 6 mm) i fall det är för tunt.
10. För att skapa locken, skär den svarta aluminiumfolien i två 50 x 25 mm bitar. Göra en 5 mm skurna i mitten av en sida av varje stycke. Vik att skapa en triangel indrag (figur 1D). Stäng provkammaren med de två locken genom att sätta ett lock på toppen av provkammaren med triangel fördjupningar vetter mot provhållaren. Se till att växtblad inte befinner sig i skuggan av locken och ta emot ljus från belysningssystemet.
11. Hitta regionen av intresse genom att använda x / y / z och rotation skede att placera en ny sido rot i synfältet.
12. Innan inspelningen låta systemet jämvikt under åtminstone 15 minuter.
13. Setup bilden förvärvet.
    1. Ställ en bunt med 217 bilder med 3 um z-avstånd (650 nm) och ställ in time lapse med 15 min imaging intervall för en period på totalt 17 timmar.
       OBS: En detaljerad dokumentation omhur du använder OpenSPIM programvara kan hittas på (http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack).
14. Starta inspelningen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low melting	VWR	AFFY3282125GM
Black aluminum foil	Thorlabs	BKF12
Black plastic foil	Carl Roth	HT83.2
LED blue (453 nm)	OSRAM	LD CN5M-1R1S-35-1
LED red (625 nm)	OSRAM	LR T66F-ABBB-1-1
LED board - PCB design software	Cadsoft Eagle
MES monohydrate	Duchefa	M1503.0100
Micropore Surgical Tape	3M	1530-1
Murashige & Skoog Medium (MS-Medium)	Duchefa	M0221
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Sample holder 3D print	i.materialise	https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1
Square Petri dishes (245 x 245 x 25 mm)	VWR	734-2179
Sucrose	Sigma-Aldrich	84097-1KG