Introduction
Eine der wichtigsten Fragen für das Verständnis der Pflanzenentwicklung ist, wie einzelne Zellen während der Organ Differenzierung und das Wachstum verhalten. Idealerweise können zelluläre Ereignisse, wie Genexpressionsmustern und intrazelluläre Proteinlokalisation, in dem Licht einer größeren Kontext des Gewebes gesehen werden. Dieses Ziel stellt technische Herausforderungen und erfordert ganze Organ Beobachtung mit einer hohen räumlichen sowie zeitlichen Auflösung über längere Zeiträume, die phototoxische Effekte verursachen können. Da Pflanzen auf Umweltveränderungen schnell anzupassen, sind die Wachstumsbedingungen streng kontrolliert werden. Um mit dem physiologischen Zustand der Anlage ohne störende Langzeit-Bildgebung zu tun, müssen drei Dinge sichergestellt, 1) Wachstumsbedingungen in der Probenkammer sein, 2) stabile Probe über lange Zeiträume Montage und 3) die Abbildungs mit geringen Lichtintensitäten Foto-Schäden und nicht-physiologischen Bedingungen zu vermeiden.
Physiologische wachsenden conditions in der Kammer Mikroskop Probe sind von entscheidender Bedeutung für die langfristige Experimente. Es gibt eine Reihe von Protokollen zur Verfügung , die Abbildungswachstumskammern für konfokale Mikroskope 1 beschreiben - 3. Jedoch führt der konfokalen Mikroskopie eine hohe Lichtintensität auf die Anlage, die 4 Antworten Stress und in der Regel hemmt das Wachstum führen kann. Darüber hinaus erlauben die meisten herkömmlichen Mikroskopen nur horizontale Positionierung der Probe, die für die Pflanzen nicht optimal ist, da sie versuchen, sich neu zu orientieren und zu dem Vektor der Schwerkraft wachsen. In den letzten zehn Jahren hat sich Lichtbogen - Mikroskopie als ein mächtiges Werkzeug entstand die Entwicklung von großen Proben bei zellulärer Auflösung für Zeiträume von bis zu mehreren Tagen 5 zu erfassen - 9. Lichtbogen - Mikroskopie ermöglicht es, die Probe vertikal positioniert und wird zunehmend in der Pflanzenforschung verwendet Wurzelentwicklung studieren 10-21, kürzlich rezensiert von Berthet und Maizel 22. Viele der genannten Studien 10,13 - 18,21 wurden im Labor von Ernst HK Stelzer optimiert und führten eine besondere Art der Probe unter Verwendung Halterung 17 durch Züchten der Wurzel auf der Oberfläche eines Gels gekennzeichnet. In diesen Studien wurde eine maßgefertigte Mikroskop verwendet wird, in dem die Pflanze aus dem Boden gehalten wird. Im Gegensatz dazu halten die Mehrheit der breit verfügbaren Lichtbogen Mikroskope die Probe von der Spitze. Somit ist diese besondere Herstellungsverfahren nicht ohne weiteres angewendet werden können. Die hier vorgestellte Methode liefert ein Protokoll für die gut etablierte auf Oberflächenmontageverfahren anwendbar für die OpenSPIM 23, einem Open - Access - Plattform für die Anwendung und Verbesserung der Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM).
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es langfristige Bildgebung von Arabidopsis Wurzeln in der OpenSPIM Lichtbogen Mikroskop zu ermöglichen. Dies wird durch das Züchten einer Pflanze aufrecht auf den s erreichturface eines Gels mit den Wurzeln in einem flüssigen Medium, während die Blätter in der Luft bleiben. Um die photosynthetische Aktivität der Pflanze, eine maßgeschneiderte Beleuchtungssystem , um sicherzustellen , beleuchtet die Blätter , aber nicht die Wurzeln (Abbildung 1).
Protocol
1. Arabidopsis Anzucht vor der Bildgebung
- Bereiten Sie ½ MS - Medium (halbkonzentriertem Murashige und Skoog - Medium) durch Zusatz von 2,15 g MS-Medium, 10 g Saccharose, 0,97 g MES (2- (N - Morpholino) ethansulfonsäure) und 1 l ddH 2 O (doppelt destilliertem Wasser ) in einen 1-l-Flasche. Stellen Sie den pH-Wert auf 5,8 mit KOH.
- Werden 15 g / l Gellan gum zum ½ MS Medium autoklaviert und für 20 min bei 121 ° C.
- Gießen 30 ml des heißen Mediums in quadratische Petrischalen (245 x 245 x 25 mm), um eine Gelschicht mit einer Dicke von etwa 2 mm zu schaffen. Lassen Sie die Gerichte auf Raumtemperatur abkühlen, um das Medium lassen sich zu verfestigen.
- Setzen Sie sterilisierten Arabidopsis Samen in ein 1,5 - ml - Reaktionsröhrchen mit 1 ml sterilem H 2 O , die Samen mit einer Glaspipette Pick - up oder eine 1000 ul Pipettenspitze und säen sie auf die Oberfläche des Gels. Legen Sie die Samen getrennt ca. 10 mm auseinander. Verschließen Sie die Platte mit Klebeband.
- Inkubiere die Platte für 24 h bei 4° C (Schichtung).
- Pflegen Sie die Platte in einem Wachstums Inkubator, zB bei 22 ° C in einem 16/8 h Tag / Nacht - Zyklus mit 120-140 & mgr; mol / m² / s Lichtmenge für 6 Tage. Bis zu 10 Tage alten Pflanzen eingesetzt werden.
2. Pflanzenprobenvorbereitung
Hinweis: Der Probenhalter kann entweder 3D - Druck oder die Hand in eine Maschine Werkstatt hergestellt unter Verwendung der dargestellten Dimensionen in 2C. Das 3D-Modell-Datei wird in dem Zusatzmaterial (Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl). Siehe den Link in der Materialliste der 3D-Druck zu bestellen.
- 5 g niedrigschmelzende Agarose in einen 50 ml-Flasche mit 50 ml MS-Medium ½ und autoklaviert für 20 min bei 121 ° C.
- Aliquot der 1% niedrigschmelzende Agarose-Lösung in 1,5 ml Reaktionsgefäße. Lagerung bei 4 ° C (für mindestens zwei Monate verwendet werden).
- Schmelzen Sie eine aliquote Menge von 1 %% niedrigschmelzende Agarose bei 80 ° C und lassen Sie es abkühlen33 ° C.
- Reinigen Sie den Probenhalter in einem Ultraschallgerät. Sterilisieren Sie den Probenhalter mit 70% Ethanol und Waschen mit sterilem Wasser.
- Schneiden Sie das Gel um die Pflanze mit einem Skalpell.
- Heben Sie den Block mit einem flachen Spatel und schieben Sie sie vorsichtig auf den Probenhalter eine zweite Spachtel.
- Kleben das Gel auf den Probenhalter mit 1% Agarose (bei 33 ° C) unter Verwendung einer 100 & mgr; l-Pipette.
- Kleben Sie die Anlage auf dem Gel mit 1% Agarose unter Verwendung einer 10 & mgr; l-Pipette. Verwenden Sie ein Stereo-Mikroskop, um zu überprüfen, dass die Blätter nicht mit Gel bedeckt sind. Sie nicht das Gel direkt auf die interessierende Region zu positionieren.
- Um zu verhindern, die Pflanze vor dem Austrocknen, ohne Unterbrechung arbeiten. Setzen Sie den Probenhalter in einem 1000 ul Pipettenspitze, wann immer möglich. Verwenden Sie die Pipettenspitze als eine Kappe und schieben Sie sie vorsichtig über ein Ende des Probenhalters in dem die Anlage steht.
- Setzen Sie den Probenhalter in einer Pipettenspitze Feld und bereiten mehr Pflanzen, wenn nötig. Pflanzen können Richtungen seintly abgebildet oder im Wachstums Inkubator zurückgestellt.
3. Das Mikroskop einrichten
HINWEIS: Die LED-Beleuchtungssystem ist ein custom-built-Lampe. Die technischen Details erforderlich , um die LED-Ring zu bauen ist in Abbildung 3 und der Materialliste zu finden. Siehe die zusätzliche Materialdatei (Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd) für das Board-Design.
- Schrauben oder Kleber (zB doppelseitiges Klebeband) der LED - Ring an der unteren Seite des OpenSPIM x / y / z / θ-Stufe Arm.
- Schließen Sie den LED-Ring mit einer einstellbaren Stromversorgung (0-30 V, max 2 A).
- Einzustellen , die Spannung auf die gewünschte Lichtstärke (für Arabidopsis, 120-140 & mgr; mol / m 2 / s, 3D).
- Sterilisieren Sie die Probenkammer mit 70% Ethanol und Waschen mit sterilem Wasser.
- Reinigen Sie das Objektiv mit Benzin und einem Objektivreinigungstuch. Sterilisieren der Objektivlinse mit 70% Ethanol.
- Schließen Sie die perfusian Rohren zur Probenkammer in einer Einweganordnung. Setzen Sie einen 1-l-Flasche mit frischem ½ MS-Medium und eine weitere leere Flasche neben der peristaltische Perfusionspumpe. Schließen Sie die Flasche mit Medium, das mit dem unteren Einlass der Probenkammer ein Perfusions-Rohr. Schließen Sie den oberen Ausgang der Probenkammer mit der leeren Flasche, die die verwendete Medium unter Verwendung eines anderen Perfusion Rohr in den Papierkorb.
- Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit auf 1 ml / min.
ANMERKUNG: Um nicht die Probenkammer Überlaufen ist es wichtig, eine höhere Ausfluss als der Zufluß zu haben. Entweder die Pumprate zu erhöhen oder ein Rohr mit einem größeren Innendurchmesser für das Ausströmen verwenden. - Schneiden Sie eine schwarze Kunststofffolie in 3 mm kleine Quadrate, Waschen mit 70% Ethanol und trocknen lassen, bevor sie in der Probenkammer auf der Wasseroberfläche platzieren.
- Entfernen Sie die Pipettenspitze aus dem Probenhalter und legen Sie den Probenhalter in der Probenkammer. Wenn der neu hergestellten Probenhalter nicht in die Stufe Arm passt, mit einem feinen SandPapier es dünner zu machen oder einen O-Ring (∅ 6 mm) verwenden, falls sie zu dünn ist.
- Um die Deckel schaffen, schneiden Sie die schwarzen Aluminiumfolie in zwei 50 x 25 mm große Stücke. Machen Sie ein 5 mm geschnitten in der Mitte einer Seite jedes Stück. Fold ein Dreieck Einbuchtung (Figur 1D) zu erzeugen. Schließen Sie die Probenkammer mit den beiden Deckeln durch den Deckel auf der Oberseite der Probenkammer mit dem Dreieck Vertiefungen setzen den Probenhalter gegenüber. Stellen Sie sicher, dass die Pflanzenblätter nicht im Schatten der Lider und empfangen Licht von dem Beleuchtungssystem.
- Finden Sie die Region von Interesse mit der x / y / z und Rotationsstufe eine neu auftretende Seitenwurzel im Blickfeld zu positionieren.
- Vor der Aufnahme kann das System für mindestens 15 min äquilibrieren.
- Richten Sie die Bildaufnahme.
- Legen Sie einen Stapel von 217 Bilder mit 3 & mgr; m z-Abstand (650 & mgr; m) und stellen Sie den Zeitablauf mit 15 min Abbildungsintervall für einen Zeitraum von insgesamt 17 Stunden.
HINWEIS: Eine ausführliche Dokumentation zuwie die OpenSPIM Software bedienen kann auch gefunden werden (http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack).
- Legen Sie einen Stapel von 217 Bilder mit 3 & mgr; m z-Abstand (650 & mgr; m) und stellen Sie den Zeitablauf mit 15 min Abbildungsintervall für einen Zeitraum von insgesamt 17 Stunden.
- Starte die Aufnahme.
Representative Results
Dieses Probenherstellungsverfahren ermöglicht den Anbau der Pflanze in der Kammer Mikroskop Probe , während das Wurzelsystem mit einem Lichtbogen Mikroskop (Abbildung 1) zu beobachten. Die Pflanze wächst auf der Oberfläche einer Schicht aus Gel (½ MS Medium , 1,5% Gellangummi enthielt) auf einem kundenspezifischen Probenhalter montiert ist (Abbildung 2). Der Probenhalter ist 3D mit einem transparenten Harz als Material gedruckt. Eine künstlich hergestellte Version die Dimensionen hervorzuheben ist in 2C dargestellt. Die Wurzeln werden in Flüssigkeit (½ MS-Medium) eingetaucht, die kontinuierlich von einem Perfusionssystem aktualisiert wird. Die Blätter bleiben in der Luft und werden kontinuierlich mit einer Lichtintensität von 130 & mgr; Mol / m² / s Herkunft aus blauen und roten LEDs beleuchtet , die über der Anlage (1A, B und 3A-C) in einem Ring angeordnet sind. Der LED-Ring ist in unserer Maschine Werkstatt gefertigt undWir bieten technische Details, wie die LED-Ring in der Abbildung 3 und der Materialliste zu bauen. Die Lichtintensität kann kontinuierlich im Bereich angepasst 30-250 & mgr; mol / m 2 / s (3D). Das Wurzelsystem wird durch kleine Platten aus einer schwarzen Kunststofffolie Abdecken der Wasseroberfläche (Abbildung 1) schattiert. Jede Streulicht von der Beleuchtung, die durch die Erfassungslinse gesammelt wird , wird durch das GFP - Filter (3E) filtriert.
Mit diesem Aufbau wurde 17 h ein Zeitraffer einer wachsenden Arabidopsis Seitenwurzel verzeichnete einen 20X / 0,5 Objektiv (Abbildung 4) verwendet wird . Die seitliche Wurzel hat seinen Ursprung in der Perizykel Zellschicht, die sich innerhalb der primären Wurzel tief liegt. Um die Abbildungseigenschaften noch tiefer im Inneren eines Gewebes für längere Zeitperioden eine höhere Vergrößerung (40x / 0,75) wurde zu demonstrieren, verwendet, um die Bildung eines seitlichen ro einzufangenot von der ersten Stufe bis primordium die Entstehung aus der primären Wurzel innerhalb einer Zeitdauer von 38 h (Figur 5). Eine beispielhafte 2D - Schicht des Datensatzes ist in Fig. 5B. Diese Aufnahme erlaubt es uns , die Dynamik der Seitenwurzelbildung in 3D mit einem zellulärer Auflösung (5A) zu folgen.
Abbildung 1: Die Anbaubedingungen im Inneren des OpenSPIM Probenkammer. A) Skizze der Imaging - Kammer. Die Pflanze wächst aufrecht auf der Oberfläche eines Gels, montiert auf einem kundenspezifischen Probenhalter eingebaut (siehe auch 2). Die Wurzeln wachsen in einem flüssigen Medium, die kontinuierlich durch ein Perfusionssystem ausgetauscht wird. Die Blätter der Pflanze in der Luft wachsen und werden von roten und blauen LEDs beleuchtet (siehe auch Abbildung 3). Das Wurzelsystem ist wit schattiert h kleine Blätter eines schwarzen Plastikfolie bedeckt die Wasseroberfläche. Ein Deckel aus zwei Stücken von schwarzen Aluminiumfolie verringert weiter die Menge an Licht, unter der Wasseroberfläche und hält Feuchtigkeit in der Probenkammer. Das vergrößerte Panel auf der rechten hebt die Pflanze auf der Oberfläche eines Blocks von Gel in das flüssige Medium eingetaucht wächst. Ein Tropfen Agarose ersteigt die Wurzel auf das Gel. Die gestrichelten Kästchen zeigt die Region von Interesse durch das Mikroskop beobachtet. B) Fotografie der Abbildungskammer (ohne Deckel). Numbers (1) - (10) in A und B: (1): x / y / z / θ-Stufe mit LED - Ring, (2): Probenhalter, (3): Deckel (4): Arabidopsis thaliana (5): Blätter aus schwarzem Kunststoff-Folie, (6): Perfusionssystem, (7): Erkennung Objektivlinse (8): flüssiges Medium, (9): Probenkammer (10): Beleuchtungsobjektivlinse. C) wird der Deckel aus zwei Stücken von schwarzen Aluminiumfolie hergestellt. target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Die Probenhalter. A) 3D - Modell. Das 3D-Modell-Datei wird in dem Zusatzmaterial zur Verfügung gestellt. B) Fotografie von 3D - Drucke mit unterschiedlichen Materialien (1) - (3): transparentem Acryl Kunststoff, (4) und (5): Harz, (6): transparentes Harz. C) Technische Zeichnung des Probenhalters, Zahlen repräsentieren Millimeter. D) Foto des hergestellten Probenhalter mit einer Anlage montiert. Die gestrichelten Bereich kann durch das Mikroskop beobachtet werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
laden / 55044 / 55044fig3.jpg "/>
Abbildung 3: Pflanzenbeleuchtung Setup. A) Schemaschaltbild der Lampe. Paare von LEDs für die Richtungs Blitz ein- / ausgeschaltet einzeln. LED: Leuchtdiode, R: Widerstand, T: Transistor, JP: Stecknadelkopf. Leiterplatte): B) Das endgültige Design der Beleuchtungslampe wurde mit einer PCB-Software (PCB gezogen. Wir stellen die Board-Design-Datei in dem Zusatzmaterial. Die Platte wurde dann hergestellt und in unserem Institut der MIBA Maschinenhalle zusammengebaut. C) Fotografie des LED - Ring eingeschaltet. Vier Paare von einer roten und einer blauen LED sind in einem Ring angeordnet. D) Der Spannungsbereich zwischen 3,5 V und 14,0 V. Die Widerstände eingestellt werden verwendet , um die Lichtmenge von 30 bis 250 & mgr; mol / m 2 / s (R1-8 bis hin zu erreichen: 220 Ohm, R9-12: 1.220 Ohm ). E) Das Emissionsspektrum der Lampe, und GFP YFP. tp: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Zeitrafferaufnahmen von Arabidopsis thaliana Seitenwurzeln. Die 5-Tage alt Sämling drückt eine Membran-Marker (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) und einem Kern Reporter (pGATA23 :: nls-GUS-GFP), die speziell Markierung Perizykel Zellen, die in eine seitliche Wurzel entwickeln. Ein Stapel von 217 Bilder (3 & mgr; m z-Abstand) wurde alle 15 Minuten für 17 h Aufnahme mit Hilfe einer Linse 20X / 0.5 erfasst. A) Vier Zeitpunkte von 69 sind in einer maximalen Intensitätsprojektion gezeigt. B) Sechs von 217 einzelnen Scheiben eines z-Stapel von einem Zeitpunkt gezeigt. Maßstabsbalken in A und B 100 um.Last / 55044 / 55044fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Zeitrafferaufnahmen von Arabidopsis thaliana Seitenwurzeln. Der 6-Tage alt Sämling drückt eine Membran-Marker (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) und einem Kern Reporter (pGATA23 :: nls-GUS-GFP), die speziell Markierung Perizykel Zellen, die in eine seitliche Wurzel entwickeln. Ein Stapel von 200 Bildern (1,5 um z-Abstand) wurde alle 15 Minuten für 38 h Aufnahme unter Verwendung einer Linse 40x / 0,75 erfasst. A) 3D - Rendering von vier Zeitpunkten stellen die Zahlen in der Tabelle um, B) einzelne Scheibe durch die zentrale Ebene der Hauptwurzel. Maßstabsbalken entspricht 50 & mgr; m. Bittehier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl. Das 3D-Modell-Datei zur Verfügung gestellt. Bitte klicken Sie hier , um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei LED Ring Board.brd. Die Board-Design-Datei zur Verfügung gestellt. Bitte klicken Sie hier , um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie hat den großen Vorteil niedrige Phototoxizität und ultraschnelle Aufnahmegeschwindigkeit zu kombinieren, die verwendet werden können, ein großes Volumen mit einer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung zu erfassen, während die Probe in einem physiologischen Zustand zu halten. Die Auflösung eines Lichtblatt - Mikroskop kann mit dem von einem konfokalen Mikroskop 9 verglichen werden. Jedoch tritt Lichtstreuung und Absorption entlang der Anregungs- und Emissionspfad individuell und die Gesamtbildqualität kann innerhalb opaken Gewebe im Vergleich zu der Oberfläche deutlich geringer sein. Um diese Komplikation zu umgehen kann man die Möglichkeit verwenden, um die Probe entlang der vertikalen Achse zu drehen, und das gleiche Volumen aus verschiedenen Richtungen beobachten. Aber dies ist nicht immer von Vorteil, zB Seitenwurzeln entstehen auf der einen Seite der Wurzel und Bildgebung von hinten führt zu einer niedrigen Bildqualität ohne weitere Informationen zu gewinnen. Jedoch kann die Drehung hauptsächlich die samp Positionierung verwendet werden,le in der besten Weise. Die klassische horizontale Anordnung der Objektive ermöglicht neue Wege der Probenmontage. Pflanzen profitieren von einer vertikalen Position. Hier vorgestellte, die "auf der Oberfläche des Gels" Montageverfahren hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Befestigungsarten , wie beispielsweise die Wurzel innerhalb eines Gels 24,25 einzubetten. 1) Das Wurzelsystem ist in direktem Kontakt mit dem flüssigen Medium. Die Probenkammer ist mit einem Perfusionssystem verbunden, die kontinuierlich frisches Medium zur Verfügung stellt. Es kann auch schnell verwendet werden, um das gesamte Volumen der Probenkammer auszutauschen, um verschiedene Medien oder Medikamente anwenden. 2) Vor der Probenvorbereitung Pflanzen wachsen, wie sie in Laboratorien verwendet werden, um zu wachsen. Die Pflanzen können müssen die gewünschten Pflanzen vorbereitet werden unter einem Fluoreszenzmikroskop und nur dann ausgewählt werden. 3) Die Anlage ist aus der Petrischale an den Probenhalter übertragen, ohne berührt zu werden. Dadurch kann die Anlage weiter zu entwickeln auf dem gleichen Gel wurde in der Wachstums incubato wachsen aufr und mechanische Beanspruchung auf ein Minimum reduziert. 4) Die Ansicht auf der Probe ist frei und optische Aberrationen minimiert werden, da der Raum zwischen der Probe und dem Erfassungsziel nur mit Medium und keine anderen Materialien mit unterschiedlichen Brechungsindizes gefüllt ist.
Um eine langfristige Bildgebung, die Anlage Beleuchtungssystem zur Durchführung notwendig photosynthetische Aktivität der Anlage zu gewährleisten. In den meisten Laboratorien Pflanzen wachsen auf einem transparenten Gel, dh die Wurzeln Licht ausgesetzt werden. Dies kann unterschiedliche Reaktionen auf ihre Umwelt verursachen und induziert Veränderungen in ihrer Biochemie und Entwicklung 26,27. Um zu reduzieren, wurde die Menge des Lichts auf das Wurzelsystem, schwarze Plastikfolie verwendet, um die Wasseroberfläche sowie einen Deckel aus schwarzem Aluminiumfolie zu bedecken bedeckt die Probenkammer. Licht kann die Anlage verlässt durch das zentrale Loch im Deckel erreichen. In dieser Konfiguration wurde kein Anstieg der Hintergrundlicht beobachtet, suggesting, die die Menge an Streulicht von den roten und blauen LEDs wesentlich durch die GFP-Filter und die Abschattung Ansätze reduziert wurde. Dies erlaubt das Licht während der Bildaufnahme gedreht zu halten, ohne die Kamera Hintergrundrauschen zu erhöhen.
Der Probenhalter ist für den 3D-Druck entwickelt. Jedoch ist die Auswahl des Materials wichtig, da einige Kunststoffe, die nicht zu 100% stabil getestet wurden, waren, in einer Drift der Probe resultiert. Daher wird empfohlen, Harze stattdessen zu verwenden oder den Probenhalter aufzubauen, indem ein Polyethylen (PEP) Stange Fräsen. Wenn ein Lichtbogen Mikroskopaufbau mit einem doppelseitigen Beleuchtungssystem unter Verwendung der Halter Probe könnte mit einer der Licht Blätter stören auf dem Drehwinkel abhängig. während Schöpfen die Pflanze von der Platte, mit einem flachen Winkel der Spachtel, um mechanische Belastung zu reduzieren. Die Anlage kann schnell austrocknen und Erfahrung Luftstrom zum ersten Mal. Versuchen Sie, jede Zugluft zu vermeiden (schnelle Bewegungen, Klimaanlage Fluss), work ohne Unterbrechung und schieben Sie den Probenhalter in einem 1000 ul Pipettenspitze, wann immer möglich. Im Inneren des Mikroskops ist es entscheidend, die ganze Pflanze in Flüssigkeit nicht tauchen und die Blätter trocken halten.
Die Technik ist ideal für frühe Stadien der Seitenwurzelbildung Bildgebung. Wenn langfristige Darstellung von reifen Wurzelspitzen durchführt, muss man bedenken, dass Arabidopsis Wurzeln mit 100-300 & mgr; m / h wachsen schnell aus dem Blickfeld. Eine sehr nützliche zukünftige Implementierung könnte ein automatisiertes Tracking-Algorithmus sein, der folgende Wurzelspitze Wachstum über längere Zeiträume ermöglichen würde. Die Fähigkeit, Umgebungsbedingungen zu steuern, wie Licht und Nährstoffzusammensetzung des Mediums während des Akquisitionsprozesses ermöglicht es zu untersuchen, wie Pflanzen an Veränderungen anpassen. Die Wurzel ist in direktem Kontakt mit dem flüssigen Medium, die verwendet werden können Medikamente anwenden , um chemisch - Genexpression, beispielsweise unter Verwendung des Dexamethason induzierbar 28 oder die β-estr aktivierenAdiol induzierbares System 29. Allerdings dauert es Zeit, um das gesamte Volumen der Probenkammer zum Austausch eines Arzneimittels auszuwaschen. Das Setup kann durch Minimieren des Volumens der Probenkammer verbessert werden Mediumaustausch zu beschleunigen. Dennoch hat diese Technik ein großes Potenzial. Die Kombination von Montageverfahren, standardisierte Anbaubedingungen und die sanfte Bildaufnahme mit Hilfe von Licht-Blatt-Mikroskopie ermöglicht Langzeitstudien der Pflanzenentwicklung mit hoher Auflösung auf physiologischer Ebene. Dies wird den Forschern helfen, grundlegende Mechanismen der pflanzlichen Entwicklung zu erforschen.
Acknowledgments
Wir danken Matyáš Fendrych für das kritische Lesen / Betrachten und Stephan Stadlbauer für die Audiogeräte. Dank der Miba Machine Shop bei IST Österreich für ihren Beitrag zur OpenSPIM. Die Forschung zu diesen Ergebnissen geführt haben Mittel aus dem Programm Menschen (Marie-Curie-Maßnahmen) der Europäischen Union des Siebten Rahmenprogramms (FP7 / 2007-2013) unter REA Finanzhilfevereinbarung Nr [291734] und European Research Council (ERC-Projekt-2011 erhalten -StG-20101109-PSDP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, low melting | VWR | AFFY3282125GM | |
| Black aluminum foil | Thorlabs | BKF12 | |
| Black plastic foil | Carl Roth | HT83.2 | |
| LED blue (453 nm) | OSRAM | LD CN5M-1R1S-35-1 | |
| LED red (625 nm) | OSRAM | LR T66F-ABBB-1-1 | |
| LED board - PCB design software | Cadsoft Eagle | ||
| MES monohydrate | Duchefa | M1503.0100 | |
| Micropore Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Murashige & Skoog Medium (MS-Medium) | Duchefa | M0221 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Sample holder 3D print | i.materialise | https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1 | |
| Square Petri dishes (245 x 245 x 25 mm) | VWR | 734-2179 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG |
References
- Grossmann, G., Guo, W. -J., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Busch, W., Moore, B. T., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).
- Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods. Plant Methods. 11 (1), 22 (2015).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. Plant J. 36 (2), 280-290 (2003).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., et al. high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
- Höckendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. Quantitative Analysis of Embryogenesis: A Perspective for Light Sheet Microscopy. Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat Methods. 12 (1), 23-26 (2015).
- Maizel, A., Von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy. Plant J. 68 (2), 377-385 (2011).
- Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy. PLoS ONE. 6 (6), e21303 (2011).
- Costa, A., Candeo, A., Fieramonti, L., Valentini, G., Bassi, A. Calcium Dynamics in Root Cells of Arabidopsis thaliana Visualized with Selective Plane Illumination Microscopy. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
- Šamajová, O., Takáč, T., von Wangenheim, D., Stelzer, E. H. K. Update on methods and techniques to study endocytosis in plants. Endocytosis in Plants. , 1-36 (2012).
- Rosquete, M. R., Von Wangenheim, D., et al. An auxin transport mechanism restricts positive orthogravitropism in lateral roots. Curr Biol. 23 (9), 817-822 (2013).
- Lucas, M., Kenobi, K., et al. Lateral root morphogenesis is dependent on the mechanical properties of the overlaying tissues. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (13), 5229-5234 (2013).
- Vermeer, J., von Wangenheim, D., et al. A Spatial Accommodation by Neighboring Cells Is Required for Organ Initiation in Arabidopsis. Science. 343 (6167), 178-183 (2014).
- Von Wangenheim, D., Daum, G., Lohmann, J. U., Stelzer, E. H. K., Maizel, A. Live Imaging of Arabidopsis Development. Arabidopsis Protocols. 1062, 539-550 (2014).
- Berson, T., von Wangenheim, D., et al. Trans-Golgi network localized small GTPase RabA1d is involved in cell plate formation and oscillatory root hair growth. BMC Plant Biol. 14 (1), 252 (2014).
- Langhans, M., Meckel, T. Single-molecule detection and tracking in plants. Protoplasma. 251 (2), 277-291 (2014).
- Novak, D., Kucharova, A., Ovecka, M., Komis, G., Samaj, J. Developmental nuclear localization and quantification of GFP-tagged EB1c in Arabidopsis root using light-sheet microscopy. Front Plant Sci. 6, (2015).
- Von Wangenheim, D., Fangerau, J., et al. Rules and Self-Organizing Properties of Post-embryonic Plant Organ Cell Division Patterns. Curr Biol. 26 (4), 439-449 (2016).
- Berthet, B., Maizel, A. Light sheet microscopy and live imaging of plants. J Microsc. , (2016).
- Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat Methods. 10 (7), 598-599 (2013).
- de Luis Balaguer, M. A., et al. Multi-sample Arabidopsis Growth and Imaging Chamber (MAGIC) for long term imaging in the ZEISS Lightsheet Z.1. Dev Biol. 419 (1), (2016).
- Ovečka, M., Vaškebová, L., Komis, G., Luptovčiak, I., Smertenko, A., Šamaj, J. Preparation of plants for developmental and cellular imaging by light-sheet microscopy. Nat Protoc. 10 (8), 1234-1247 (2015).
- Yokawa, K., Kagenishi, T., Kawano, T., Mancuso, S., Baluška, F. Illumination of Arabidopsis roots induces immediate burst of ROS production. Plant Signal Behav. 6 (10), 1460-1464 (2011).
- Silva-Navas, J., et al. D-Root: a system for cultivating plants with the roots in darkness or under different light conditions. Plant J. 84 (1), 244-255 (2015).
- Aoyama, T., Chua, N. -H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. Plant J. 11 (3), 605-612 (1997).
- Brand, L., et al. A versatile and reliable two-component system for tissue-specific gene induction in Arabidopsis. Plant Physiol. 141 (4), 1194-1204 (2006).
