Introduction
Цель этого метода заключается в создании воспроизводимой модели для тяжелой, течения индуцированной легочной артериальной гипертензии у крыс и измерить его принцип гемодинамические и гистопатологические конечные точки.
Легочной артериальной гипертензии (ЛАГ) является клиническим синдромом, который охватывает прогрессивное увеличение легочного сосудистого сопротивления, ведущего к правожелудочковой недостаточности и смерти. В вышестоящем спектра заболеваний легочных гипертонической болезни (PH), ЛАГ является самой тяжелой формой и тот , который остается без лечения 1. Основополагающей артериопатия в PAH характеризуется типичной формой ремоделирования сосудов, что закупоривает просвет сосуда. Muscularization нормальных , не muscularized сосудов и гипертрофии медиальной слоя сосуда рассматриваются как ранние явления болезни при ЛАГ, наблюдаются также в других формах ЛГ 2, и , как полагают, быть обратимым 3. Как ПАГ аdvances, интимы слой начинает перестраивать, в конце концов , образуя характерные неоинтимального поражения 2. Неоинтимального типа легочного сосудистого ремоделирования является эксклюзивным для ЛАГ и в настоящее время считается необратимым 4.
Как PAH является редким заболеванием, прогресс в его pathobiological понимания и разработка новых методов лечения уже в значительной степени полагались на животных моделях. Monocrotalin (MCT) модели у крыс простой одиночный удар модель , которая была, и до сих пор, часто используется. МСТ является токсин , который вызывает повреждение легочных артериол и региональное воспаление 5. 60 мг / кг МСТ приводит к увеличению среднего давления в легочной артерии (MPAP), легочное сосудистое сопротивление (PVR), и гипертрофия правого желудочка (РВГ) через 3 - 4 недели 6. Histomorphology характеризуется изолированной медиальной гипертрофии без неоинтимы поражений 5. МСТТаким образом, модель крысы представляет собой умеренную форму PH, а не PAH, хотя обычно представляется как последний.
У детей с ЛАГ , связанной с врожденным слева направо шунта (PAH-КБС), увеличение легочного кровотока считается существенным триггером для развития неоинтимы поражений 7, 8, 9. У крыс, усиление легочного кровотока может быть индуцирована путем создания шунта между брюшной аортой и полой веной, методика впервые была описана в 1990 году 10. Альтернативы создают повышенную легочную потока являются односторонними пневмонэктомии либо подключичную к анастомоза легочной артерии 11. Концептуальные недостатки этих моделей состоит из потенциальной компенсационного роста оставшегося легкого и адаптивной активации пути, вызванного пневмонэктомии или ятрогенного повреждения легочной сосудистой сети из-зак анастомозом легочной артерии, как путая последствия увеличения легочного кровотока.
Когда аорто-кавальной шунт создается и усиление легочного кровотока индуцируется в качестве второго попадания в МСТ крыс, характерные неоинтимального поражения происходят, и тяжелая форма ЛАГ и связанных с ними недостаточность правого желудочка (ФВР) развиваются через 3 недели после того, как увеличение 12 потока. Прогрессирование гемодинамика ЛАГ в этой модели можно оценить в естественных условиях с помощью эхокардиографии и катетеризации правых отделов сердца. Сосудистый histomorphology, толщина стенки сосуда, степень артериол окклюзии, а также параметры для правого желудочка неудачи образуют устои экс естественных характеристик ЛАГ.
Этот метод описывает подробные протоколы для операции аорто-кавальной шунта (AC-шунт), катетеризация правых отделов сердца, а также качественную и количественную оценку сосудистого histomorphology.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры с участием субъектов животных были одобрены ЦК Голландской Эксперименты на животных и Комитетом по уходу животных в университетском медицинском центре Гронингена (Нидерланды) с помощью. Оба были использованы Wistar и крыс Льюиса с весом от 180 до 300 г.
1. Корпус и акклиматизации
- После прибытия в центральном виварии, крыс в домашних группах по 5 животных на клетку. В период акклиматизации 7-дневного, приучить крыс к человеческому обращению, но не выполняют никаких экспериментальных процедур.
2. Подготовка и инъекция стерильного Monocrotalin
- Для получения 1 мл 60 мг / мл monocrotalin (MCT) раствор, взвешивают 60 мг monocrotalin в трубе 2-мл. Добавить 700 мкл 0,9% NaCl. Добавить 200 мкл 1 М HCl. Нагреть раствор в трубке под струей горячей водопроводной воды и вихря его. С помощью 6 N NaOH, чтобы довести рН 7,0 в сторону. Использование стерильной техники для приготовления МСТ для инъекций в грызунов. Вводят 1 мл стерильного 60 мг / мл МСТ раствора на кг подкожно в шею (0,3 мл 60 мг / мл МСТ для 300-г на крысу). Примечание: Мы предпочитаем не использовать меньшие объемы в связи с большей вероятностью, что впрыскивается доза не будет уместен.
3. аорто-кавальной шунтированием
- Обезболивание.
- Заполните индукционную камеру с 5% изофлуран / 100% O 2 (расход: 1 л / мин) и помещают крысу в камере. Проверьте наличие адекватной глубины анестезии, выполняя носок щепотку задних. Взвесьте крысы.
- Бритье и очистить живот на площади, которая имеет длину приблизительно 8 см и шириной 3 см. Поместите крысу на спине на циновке тепла (37 ° C), охватываемый стерильную мата.
- Поместите мордой в маске вентиляции / капот с 2 - 3% изофлуран / 100% O 2 (расход: 1 л / мин). Проверьте глубину анестезии, выполняя носок щепотку задних. Нанесите мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
- Шунт SurГери.
- Скраб кожу с хлоридно-hexidine для дезинфекции. Вводят 0,01 мг / кг подкожно бупренорфин для послеоперационного обезболивания.
- Используйте стерильные инструменты для хирургии. Сделайте надрез с # 10 лезвие скальпеля в животе по средней линии, начиная с 1 см ниже диафрагмы выступающую вниз чуть выше половых органов.
- Поднимите кишечник с помощью ватного тампона, покрывают кишечник в стерильной, влажной марлей (0,9% NaCl), и поместить их в левую сторону животного.
- Используйте ватные тампоны, чтобы отделить мембраны, которые крепят брюшной аорты и нижней полой вены в окружающие ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не вскрывать мембраны между аортой и полой вене. - Используя Пинцет, удалите периваскулярное аортального жира чуть выше развилки, только на правой стороне аорты и только на месте, где будет вставлена игла.
- Используйте ватные тампоны, чтобы отделить аорта и полая вена от 2 мм супермаркеRIOR к месту, где игла будет вставлена для того, чтобы создать пространство для зажима Бимер.
- В этой области, первое место рыхлую лигатуры (5-0 шовный) вокруг аорты. Создание напряженности на лигатуры, помещая зажим Кохера на нем, а затем поместить Кохер выше разреза (рис 1А). Поместите Бимер зажим как раз превосходит лигатуры (Figur е 1А).
- Используя ватный тампон, сжимать полую вену , как дистально , насколько это возможно , чтобы воспрепятствовать потоку (Рис . 1А) Изгиб иглы (18 G в данном протоколе) в угол 45 градусов, с отверстием , указывающей в направлении наружу (рис 1А).
- Под углом 90 градусов, вставить иглу в аорте, как раз над бифуркацией, с отверстием иглы , указывающей влево (Рис . 1А) Манипулирование кончик иглы влево и вставьте его в полую вену.
ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь кончик иглы должен быть VisiBLE в полую вену (рис 1B). - Используйте второй ватный тампон, чтобы подтолкнуть оставшуюся кровь в аорту из места введения, чтобы предотвратить тромбоз. Сушат область вокруг шунта с стерильную марлю для того, чтобы клей надлежащим образом придерживаться.
- Вытащите всю иглу из аорты и сразу же нанесите каплю клея ткани на месте прокола в аорте. Убедитесь в том, чтобы не приклеить ватный тампон к ткани. Освободить аорту.
- Проверьте шунт вручную, потянув и отпустить лигатуры на аорте проксимальнее шунта. Рыхление должен цвет полая вена дистальнее шунта в ярко-красный и создают турбулентность на месте шунта.
ПРИМЕЧАНИЕ: затяжка превратит кровь в полую вену обратно до темно-красного. - Поместите кишок обратно в животное. Закройте мышечный слой и кожу с рассасывающихся 4-0 швами. Проветривайте животное с 100% O 2 , чтобы оправиться от наркоза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте ЭниMAL без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее.
- Sham хирургии.
- Выполнение всех вышеуказанных процедур для введения иглы в аорту за исключением.
- Послеоперационный уход.
- Поместите крысу в одной клетке, и в инкубаторе при 37 ° С до следующего утра.
- Около 6 часов после операции, вводят 0,01 мг / кг подкожно бупренорфин для послеоперационного обезболивания. Повторите следующее утро, если крыса показывает признаки дискомфорта.
Примечание: Первые 3 дня после операции, у крыс, как правило, есть и пить меньше (это особенно важно, когда чау или питьевой воды смешиваются с наркотиками). Большинство крыс показывают нормальное поведение 3 дня после операции. Если нет, то внимательно следить. Потеря веса более чем на 15% в течение 1 недели считается ненормальным, и такие крысы должны быть подвергнуты эвтаназии путем экстракции объема циркулирующей крови в то время как под анестезией.
Примечание: В этом протоколе животное эвтаназии путем экстракции объема циркулирующей крови в то время как под анестезией.
- Жертвоприношение 1 день после операции (MF8) для ранних клеточных и функциональных реакций к увеличению потока легочной крови (например, ген , повышающей регуляции или ранних факторов транскрипции).
- Жертвоприношение через 1 неделю после операции (MF14) для ранней стадии PAH сосудистого фенотипа (медиальная гипертрофия без неоинтимы поражений).
- Жертвоприношение через 2 недели после операции (MF21) для запущенной стадии PAH сосудистого фенотипа (помечено медиальной гипертрофии и образование неоинтимы) с мягким повышением в РВП и MPAP.
- Жертвоприношение через 3 недели после операции (MF28) для терминальной стадии PAH сосудистого фенотипа (отмечен неоинтимы окклюзия) и сильного подъема в РВП и MPAP. Клинические признаки недостаточности правого желудочка обычны в данной стадии.
- Жертвоприношение после того, как 28-й день (MF-ЛРВ) Для ПАГ-ассоциированной недостаточности правого желудочка (ФВР), клинически определяется как одышка, сильная вялость и потеря веса (<10% в течение 1 недели). Terminate крыс, когда один из этих признаков присутствует. Часто, крысы развиваются эти симптомы между днями 28 и 35 и, если оставить без присмотра, умирают спонтанно в течение этого интервала времени.
5. катетеризация правых отделов сердца
- Обезболивание.
- Заполните индукционную камеру с 5% изофлуран / 100% O 2 (расход: 1 л / мин) и поместить крысу в коробку. Проверьте наличие адекватной глубины анестезии, выполняя носок щепотку задних. Взвесьте крысы.
- Бритье и очистить шеи в правой вентральной стороне крысы и, для протокола эхокардиографии, грудной клетки и верхней части живота.
- Поместите крысу на его спине на циновке тепла (37 ° C) и поместите морду в вентиляционной маски / капот с 2 - 3% изофлуран / 100% O 2 (расход: 1 л / мин). Морда должна быть обращены вверх к исследователю.
- Протокол эхокардиографии.
- Выполните эхокардиографию в соответствии с протоколом , описанным Бриттан и соавт. в Jove 13.
- Протокол Катетеризации.
Примечание: Этот протокол использует жесткую канюлю с предварительно наконечником согнуты на 20 градусов , чтобы направлять кремния катетера 15 см с мячом 2 мм от кончика. 20-G иглы с отверстием слегка согнуты внутрь используется для вставки канюлю в правую яремную вену (см перечень материалов). Крысы в любой фазе PAH прогрессии и контроля могут быть использованы в данном протоколе.- Лечить шею с хлоридно-hexidine. Сделать 1,5 см разрез в с # 10 лезвие скальпеля в правой вентральной сторонешеи, от правой ключицы к нижнечелюстной кости.
- Распространение ткани с помощью ножниц. С помощью пинцета, осторожно потяните ткань друг от друга до тех пор, пока не появится яремной вены. Рассеките мембраны вокруг яремной вены с помощью Пинцет.
- Помещенный напряжение на шейную вену, помещая рыхлую лигатуры (5-0 шовный) вокруг судна. Увеличьте натяжение и ленты лигатуры на вентиляционную маску (рис 2А).
- Вниз по течению от места введения, поместите свободную лигатуру вокруг сосуда , чтобы затянуть после того, как канюля на месте для того , чтобы предотвратить утечку и потерю давления.
- С помощью ручки пинцета, слегка согнуть кончик 20-G иглы с отверстием на внутренней части, чтобы провести полую иглу с катетером.
- Ввести наконечник 20-G иглы в вену и быстро поместить канюли, содержащий катетер внутри сосуда. Вытащите иглу, а затем закройте лигатурыкоторый был подготовлен в шаге 5.3.4.
- Провести канюли, содержащий катетер в яремную вену. Кончик канюли на кривой 20 градусов (этап 5.3.5). Маневр канюлю под ключицы и заранее немного , чтобы войти в правое предсердие (рис 2C).
- Для входа в правый желудочек, направьте кончик полой иглы влево, в сторону сердца (рис 2D). На мониторе прикроватная, кривая давления RV должна появиться, сопоставив Рисунок 2D.
- Когда кривая давления RV постоянна, запишите систолическое и диастолическое давление правого желудочка 1 (sRVP1 / dRVP1).
- Манипулирование кончик полой иглы влево и вверх. Продвигать катетер внутри канюли (рис 2E).
- Предварительный катетер в легочной артерии (ПА). Ни один сопротивление не должно ощущаться при прохождении клапана легочной артерии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда катетер входит в основной легочной артерии, Дiastolic давление будет расти. На мониторе прикроватная, кривая давления PA должна появиться, сопоставив Рисунок 2E. - Когда кривая давления PA постоянна, запишите систолическое, диастолическое и среднее давление PA 1 (sPAP1, dPAP1, mPAP1).
- Дальнейшее продвижение катетера внутри канюли, пока мяч на кончик катетера не застрянет в легочной артерии. Обратите внимание на кривую давления на перепад монитора прикроватного и соответствует кривой давления клина на рисунке 2F.
- Когда кривая клин давления постоянна, запишите систолическое, диастолическое и среднее давление клина.
- Отойдите катетер медленно, а затем измеряют и записывают значения для sPAP2, dPAP2, mPAP2, sRVP2 и dRVP2, как показано на мониторе прикроватный.
- Когда в RV, слегка оттяните канюлю и катетер для измерения средней давление в правом предсердии (RAP). Кривая должна соответствовать кривой RAP на рисунке 2А.
НЕТTE: В этом протоколе крыс умерщвляли после протокола катетеризационную путем экстракции объема циркулирующей крови в то время как под наркозом.
6. Морфология и морфометрия Оценка
Примечание: В этом протоколе животное эвтаназии путем экстракции объема циркулирующей крови в то время как под анестезией. Крысы в любой фазе PAH прогрессии и контроля могут быть использованы в данном протоколе.
- После того, как жертва, вынимают легкие путем разрезания трахеи около 5 мм над бронхиальной развилки и сосудов, которые соединяют легкие к сердцу. Помещенный легкие в холодном солевом растворе. Рассеките левое легкое. Вырезать левого главного бронха на развилке.
- Заполнить 50-мл шприц с 4% параформальдегида, присоедините трубку с канюлю шприца, и повесить шприц около метра над рабочим столом. Установить канюлю в левом главном бронха пассивно заполнить легкие с параформальдегидом.Ручка параформальдегида с осторожностью.
- Выдержите левое легкое в параформальдегидом в течение 48 часов.
- Обезвоживают левое легкое путем инкубирования его последовательно в 70% -ном этаноле (1 ч), 80% этанола (1 ч), 90% этанола (1 ч), 100% этанола (3 ч), ксилола (2 ч) и парафина ( 2 ч).
- Встраивание левое легкое в парафин, с рубчиком легкого, обращенной к кассету.
- Пятно залитых парафином, 4 мкм срезах легких с помощью окрашивания Verhoeff или Elastica-ван Гизону, в соответствии с инструкциями изготовителя 29. Убедитесь , что упругое Пластинки хорошо дифференцированы (как показано на рисунке 3). Сканирование окрашенных срезов при 40-кратном увеличении.
- Разделите легких на 4 квадранта. В каждом квадранте, найти 10 судов с наружным диаметром <50 мкм (интра-ацинарные) и 10 судов с наружным диаметром> 50 мкм (предварительно ацинарные). Сфотографируйте (2 х 40 кадров в легких). Увеличение случайным образом до 20x увеличением и фотография каждого суднав этом поле зрения, чтобы минимизировать смещение отбора.
- Исключено сосуды, которые имеют самый длинный / короткий соотношение диаметра> 2, неполную круглую форму, или крах более чем на одну четверть стенки сосуда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пример исключенного судна показан на рисунке 3b Сделайте каждое изображение на том же увеличении (40х) и включают в себя масштабную линейку. - Открыть ImageJ и первая картина. Нарисуйте прямую линию на шкале дистанций на картинке , чтобы установить масштаб с помощью "Analyse" и "Установить масштаб" . Для "известном расстоянии" использовать значение по шкале бара картинки. Используйте микрометров (мкм) в качестве единицы длины. Установите масштаб глобальной.
- Использование "выборы от руки" нарисовать линию на внутренней границе зоны просвету (рисунок 3), и использовать "измерения" (Crtl м), чтобы измерить эту область. Затем проведите линию вокруг внешнего ELASTIC пластинкой (рис 3) для измерения общей площади сосуда.
- Вычислить полостную и наружный диаметр (
) с помощью 
, - Рассчитать толщину стенки с помощью
, - Вычислить соотношение стенки / светового потока с помощью
, - Вычислить счет закупорки, используя
, - Оценка судна на muscularization (нет, частичная или общая muscularization) (рис 3B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Суда с двойной эластичной пластинки для более половины окружности определяются как полностью muscularized. Сосуды с двойной эластичной оболочкой менее половины окружности определяются как частично muscularized. - Оценка судна на присутствии Неине ntima (да или нет) (рис 3C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Суда без четко определенной внутренней упругой пластинки в сочетании с (часто эксцентричный) полостной окклюзии определяются как неоинтимы поражений.
) с помощью 
, 
, 
, 
, Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Типичные результаты представлены на рисунке 4. Представленные результаты показывают характеристики МСТ + FLOW у крыс Льюиса в следующих группах: Контроль (n = 3), MF8 (п = 5), MF14 (п = 5), MF28 (п = 5) и MF-ФВР ( п = 10). Статистический анализ проводили с использованием одностороннего ANOVA с коррекцией Бонферрони.
60 мг / кг МСТ и усиление легочного свинца приток крови к средним повышением систолического давления правого желудочка (sRVP) (23 ± 6 до 56 ± 11 мм рт.ст.), систолическое давление в легочной артерии (СПаП) (20 ± 4 до 54,0 ± 10 мм рт.ст. ), и среднее давление в легочной артерии (MPAP) (16 ± 3 до 36 ± 4 мм рт.ст.) на 28 дней (MF28). Они остаются столь же высоко вплоть до стадии , когда развивается недостаточность правого желудочка (MF-ФВР) (рисунок 4). На ранних стадиях PAH (MF8 и MF14), не наблюдается рост sRVP, SPAP и MPAP. Диастолическое PAP и влевоувеличение давления проб в конце фазы, но не значительно. давление клина существенно не изменяются в течение прогрессирования заболевания.
Правого желудочка к левого желудочка и септальные соотношение веса значительно возрастает от MF14 до MF-ЛРВ, что указывает на гипертрофия правого желудочка. Отношение влажного к сухому веса печени в значительно увеличивается в MF-ЛРВ стадии, что указывает на отек печени и застойной недостаточности правого желудочка.
Muscularization внутриевропейских ацинарной сосудов <50 мкм прогрессивно увеличивается во время PAH прогрессии. Суда такого размера обычно не имеют мышечный слой медиальной у контрольных крыс. В MF14, почти половина из этих сосудов (43 ± 17%) имеет общую мышечную среды (как показано на Рисунке 3B). На MF28 и MF-ЛРВ, почти каждый артериол является muscularized (98,7 ± 2,5% и 100 ± 0%). Неоинтимального поражения первой происходятв MF21, в то время как MF28 и MF-ЛРВ, около 65% всех артериол имеют неоинтимы слой (как показано на рисунке 3C). Артериол и соотношение прикуса баллов стены к просвету и значительно больше по сравнению с MF14 до MF28 (соответственно, 10,4 ± 3,9 до 71,5 ± 30 (CON: 7,1 ± 0,2) и 20,0 ± 2,8 до 54,7 ± 10,6 (CON: 12,2 ± 0,3) ). Гемодинамические и гистоморфологические характеристики ПАГ прогрессии в MCT + FLOW у крыс Wistar подобны 14.
Рисунок 1. Схематическое изображение Аорто-НПВ хирургии шунта. А) Аорта натягивается и зажимают выше места введения. Полая сжимают уступает место ввода. Игла, согнуты под углом 45 °, и с отверстием наружу, вставляется в аорту под углом 90 °. Б) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Процедура Катетеризация правых отделов сердца и Характерные кривые давления. А) Правая яремной вены натягивается с лигатуры и приклеенный на маску вентиляции. Катетер помещен в яремную вену. Б) прикроватный монитор отображения правого желудочка волну давления. С) Катетер внутри канюли , помещенной в правом предсердии после введения в правую яремную вену. Внизу: типичный правом предсердии волны давления. D) катетер внутри канюли , помещенной в правый желудочек. Внизу: типичный правый ventriculВолна давления ар в терминальной стадии ЛАГ. Е) Катетер продвигают в канюлю , чтобы войти в главную легочную артерию. Внизу: типичная легочная волна артериального давления. F) Катетер продвигают в легочной артерии , пока волна давления клина не отображается на мониторе. Внизу: типичная легочная волна давления клина. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Сосудистые Морфология и морфометрия у контрольных животных и ЛАГ. A) Нормальный, не muscularized сосуд с окклюзионной счетом 3,7%. Б) полностью muscularized артериол с окклюзионной счетом 24,3%. С). Неоинтимы поражение с окклюзией счетом 54,1%. D) Е) Измерение общей площади сосуда и полостной (в сосуде с схематическим изображением поражения неоинтимы), в том числе расчетов. Полосы представляют 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Представитель Результаты легочной гемодинамики и сосудистому морфологический / морфометрии. Статистический анализ проводили с использованием одностороннего ANOVA с Бонферрони поправок. Значения представлены как среднее ± SEM. дистанционного управления: управление; MF (monocrotalin + поток); ФВР: недостаточность правого желудочка; s: систолическое; d: диастолическое; м: среднее; ДПР: давление правого желудочка; РАР: pulmonarу артериальное давление; RAP: давление в правом предсердии. RV: правый желудочек; LV: левый желудочек; IVS: межжелудочковой перегородки; BW: масса тела. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод описывает хирургическую процедуру с аорто-кавальной шунта у крыс, предварительно обработанных МСТ для создания индуцированной движением PAH и методики оценки принцип гемодинамические и гистопатологические конечные точки, которые характеризуют PAH и эту модель.
Критические шаги в рамках Протокола и устранение неисправностей
Хирургии и после операции. Во время аорто-кавальной хирургии шунта, наиболее важным шагом является рассечение аорты и полой вене. Мембраны, которые заключите аорта и полая вена должна быть расчленена достаточно, чтобы создать 1) хорошую видимость аорты области, где будет вставлена игла, и положения иглы в полую вену после введения и 2) достаточно места для зажать аорту выше места введения. Те же мембраны, однако, также используются для проведения аорте кровь через место прокола между обоими судами (Рисунок 1). Анатомический мембраны слишком много будетвызывают шунт к утечке. Ткань клей может решить утечку, но затем может также просачиваться в шунта, ставя под угрозу его размер. Когда клей ограничила поток через шунт или любой из сосудов, клей можно удалить осторожно, но разрыв полой вене или мембран, которые проводят может произойти шунт. Размер или адекватность шунта можно оценить путем сравнения разницы в цвете и степень турбулентности крови в полую вену во время компрессии и декомпрессии проксимального отдела аорты с помощью ватного тампона.
18-G иглы было показано , чтобы создать адекватную шунт , что приводит к последовательной и воспроизводимой форме ПАГ прогрессии Льюиса (эта статья) и Wistar (см Reference 14) крыс и правого желудочка объемом перегрузки 15. 18-G иглы создали наиболее хорошо сбалансированный шунт, со значительным увеличением легочного потока с одной стороны, и низкий уровень послеоперационного осложнения с другой стороны. Наиболее распространенным послеоперационная проблема является потеря веса. Потеря веса до 10% в течение 1 недели происходит у всех крыс после операции, предположительно, из-за снижения потребления в первые несколько дней после операции. Крыс умерщвляют, когда потеря веса превышает 15% в течение 1 недели, так как это считается признаком недомогания. Жидкий чау может улучшить кормление в течение первой недели после операции. Редкие послеоперационные осложнения задней ноги и паралич кишечника ишемии, которые также приводят к эвтаназии. В общей сложности, менее 5% крыс должны были быть умерщвлены в послеоперационном периоде.
Катетеризация. Критические шаги во время протокола катетеризационную начать с регулированием анестезии. Глубина анестезии должна быть минимально возможной (1,5 - 2% изофлуран в данном протоколе), а увеличение глубины анестезии, как представляется, уменьшить правого желудочка и давление в легочной артерии, особенно у крыс с правожелудочковой. Измерения имеют тенденцию к becomе ненадежны, когда протокол превышает 20 минут в продолжительности.
Следующим важным шагом является манипулирование катетера в RV и в главной легочной артерии. Это может быть сложным. Промывка катетера может помочь кривой катетер в тракте оттока, когда наконечник застрял в трабекул Р.В. в. Сама манипуляция может привести к RV дискинезия, которая показывает нерегулярные кривые давления на мониторе прикроватный. Введение катетера в правый желудочек и легочную артерию должны работать плавно. Когда кончик застревает на легочный клапан, сопротивление чувствуется. Нажатие через это сопротивление может привести к легочного клапана к разрыву, что ограничивает надежность последующих измерений.
В настоящем протоколе крыс забивали после процедуры катетеризации. В теории, тем не менее, яремной вены и хирургическая рана может быть закрыта после того, как катетер вытягивается, как животные могут жить только состальные покинули яремную вену.
Морфометрия. При оценке толщины стенок сосудов и прикуса баллов, наиболее важным шагом является определение упругой пластинки. Из опыта, вероятность успеха с этой целью является наибольшим с хорошо дифференцированной Verhoeff или Elastica-ван-Гизону окрашивания. В то время как просвет, как правило, можно легко отличить от интиме (для измерения внутренней области сосудистой), различие в средствах массовой информации от адвентиции может потребовать более близкий взгляд (для измерения внешней области сосудов). Некоторые протоколы измерения интимы и медиального толщина отдельно, определяя интиму в качестве слоя между просветом и внутренней эластичной оболочкой, а также в средствах массовой информации в качестве слоя между внутренней и внешней эластичной оболочкой. Это, как правило, возможно в ранней стадии MCT + FLOW ПАУ. Тем не менее, артериол в поздних стадиях заболевания, особенно неоинтимального поражения, может отображать несколько упругую и пластинок часто теряют целостность эластичного пластинками ( Преимущества и ограничения Добавление потока в качестве триггера Использование увеличения притока крови легких для создания ПАУ у крыс имеет ряд преимуществ, наиболее заметным в том, что он является известным (пато-) физиологический спусковой механизм для заболевания, что способствует перевод человеческому тьфу-КБС (Эйзенменгер физиология), но и к другим формам ЛАГ 9. Модель учитывает регулирование потока путем изменения размера иглы при создании AC-шунта. В HuЧеловек PAH-CHD, закрытие шунта приведет к восстановлению ПАУ в ранней стадии заболевания, а прогрессирование ЛАГ в более поздних стадиях заболевания. Закрытие шунта в естественных условиях позволило бы исследовать эффект удаления триггера в различные моменты времени прогрессирования заболевания и , таким образом , чтобы исследовать механизмы (не) обращения ЛАГ. К сожалению, в настоящее время, шунт закрытие не представляется возможным в текущей модели. Эффекты гемодинамической нормализации (например, удаление избыточного потока и нормализации давления в легочной артерии) у крыс с потоком ассоциированных с ПАУ могут быть исследованы с помощью трансплантации пораженного левого легкого в крысы - реципиента с нормальной циркуляции. Было показано , что ранее гемодинамический нормализация, у крыс после трансплантации легких и в человеческой PAH-CHD путем закрытия сердечного шунта, приводит к регрессу медиальной гипертрофии в ранней стадии ПАГ 21. Эффекты гемодинамических нормальногозация в продвинутой стадии экспериментального потока-тьфу в настоящее время неизвестны. Значение по отношению к альтернативным моделям МСТ модель с одним хитом. Подкожная инъекция 60 мг / кг МСТ представляет собой простой и эффективный способ создания модели для легочной гипертензии у крыс. МСТ индуцирует повреждение легочной артерии эндотелиальных клеток, с последующим гипертрофии мышечного слоя легочных артерий 5. Хотя точные механизмы остаются неясными, различные пути и факторы роста были идентифицированы, которые участвуют в медиальной гипертрофии следующие MCT. Фармацевтическое вмешательство на эти пути часто успешно снижается медиальной гипертрофии и MPAP в МСТ-крыс. Тем не менее, так как медиальная гипертрофия , как известно, имеют естественную тенденцию к возмещена в организме человека 3 и также было описано для обратного спонтанно в МСТ крыс 16, влияние этих обработокдолжны оцениваться критически. Дважды ударил MCT + FLOW модель. Добавление повышенной легочной кровотока через 7 дней после инъекции MCT критически изменяет (сосудистую) фенотип в характерном зависящим от времени способом. В MF14 (через 7 дней после индукции увеличенного потока), как правило, не muscularized сосуды начинают развиваться мышечный слой медиальной. При MF21, медиальная увеличивается толщина и первые неоинтимального повреждения происходят. В MF28, А неоинтимы слой разработал в большинстве судов. Между MF28 и MF35, большинство крыс развиваются недостаточности правых отделов сердца и умереть от его sequellae. Предыдущие исследования в MCT + крыс потока показали, что добавление потока к МСТ приводит к активации специфических кластеров генов. В некоторых кластеров, поток против эффектов, вызываемых МСТ; в других, течь усиливается эти эффекты, и один кластер содержал гены , которые были специально повышающей регуляции после потока 17. Один из этих генов потока конкретных являетсяраннего роста ответа-1 ген 14 (EGR-1). Раннее торможение СГП-1 привело к ослаблению ЛАГ и формирования неоинтимы в MCT + крыс потока 18. Egr-1 был также связан с неоинтимального ремоделирования в человеческом PAH (ПАГ-КБС и идиопатической ЛАГ) 19. Эти наблюдения добавить доказательства, что увеличение или нарушенного легочный кровоток является существенным толчком для формирования неоинтимы. Единственный хит поток только модель. У крыс с аорто-кавальной шунта без MCT-инъекции, легочная гипертензия (MPAP> 25 мм рт.ст.) развивается между 10 и 20 недель после того, как шунтирующий индукции 20. На 20-й недели, легочная сосудистая гистологии преобладают медиальной гипертрофии предварительно ацинарными артерий и нео-muscularization внутрипартийной ацинарными артериол. Хотя некоторые неоинтимального поражения также были описаны в этой модели 20, развитие этих поражений нуждается т O быть подтверждена и количественно. Модель Sugen-гипоксия. Еще одна распространенная модель для ПАУ с неоинтимы поражений является Sugen5416-Гипоксия (SuHx) крысы. Sugen5416 блокирует фактор роста эндотелия (VEGF) рецепторов сосудистой. Это вызывает повреждение эндотелиальных клеток и сигнальный каскад , который, в сочетании с гипоксией, вызывает эндотелиальную апоптоза и пролиферации 22. После того, как Sugen5416 инъекции крысу помещают в гипоксической камере в течение 4-х недель, после которых развивается ФАГ. Крысу затем вновь подвергается воздействию нормоксии в течение 4-х недель. Фармакологические соединения , которые нацелены на эндотелиальную апоптоз сопротивление или сигнальные каскады TGF-B и BMP показали потенциал вспять неоинтимального поражения в этой модели 23, 24, 25. Новый вариант модели SuHx является модель Sugen-пневмонэктомия, что также приводит к тяжелой ЛАГ с неоинтимы поражений > 26. Тем не менее, эта модель еще полностью не охарактеризованы. Новый генетический метод для индукции ЛГ у крыс включает мутацию в гене ВМР-рецептор-2, что приводит к значительному muscularization (PH) , но без образования неоинтимы (PAH) 27. Сопоставимые результаты были получены в отношении количества неоинтимы повреждений и степени полостной окклюзии в терминальной стадии необработанного SuHx и MCT + крыс потока 28. Основные различия между двумя моделями являются : 1) , что MPAP в MCT + Flow постепенно увеличивается, в то время как в SuHx, то MPAP было показано постепенно снижаться после повторного воздействия нормоксии 28; 2), что МСТ модель + Flow знает ранней стадии заболевания, характеризующегося медиальной гипертрофии и эндотелиальной дисфункции; 3), что время, которое требуется, чтобы обе модели достигают терминальной стадии, где недостаточность правого желудочка начинает развиваться (4 недели в MCT + Flow, 8 недель в SuHx)ЭФ "> 28 отличается, и 4) , что Sugen5416 вмешивается в молекулярном пути (VEGF), роль в патогенезе ЛАГ до сих пор неясно Это может затруднить перевод к человеческому PAH.. Будущие приложения или направления В различные фазы заболевания МСТ + модели потока позволяют 1), чтобы проверить механизмы прогрессирования заболевания (ткани человека в целом доступно только из посмертного или эксплантов процедур) и 2) для тестирования вмешательств в различных стратегий. Профилактическая стратегия может быть начато на строительстве шунта (MF7). Раннее вмешательство может быть начато на MF14. Это может быть уместным в качестве стратегии лечения до начала шунтирования закрытия у детей с врожденной сердечной шунт и связанного с ЛАГ, который прогрессировал в серую зону между обратимой и необратимой болезни. стратегии разворота может быть инициировано на MF21 или MF28. На более поздних стадиях, как показывают неоинтимального поражений, проявление терминальной стадии ЛАГ. </ Р> В заключение, добавление увеличенного легочного потока к МСТ у крыс создает модель прогрессивного и тяжелой ЛАГ, которая имитирует человеческое развитие болезни. Катетеризация правых отделов сердца и качественная и количественная оценка сосудистой гистопатологией формируют краеугольные характеристики заболевания в этой и других моделей для ПАУ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shunt Surgery | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Duratears Eye ointment | Alcon | 10380 | |
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Histoacryllic tissue glue | B. Braun Medical | 1050052 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Safil 4-0 sutures violet resorbable | B. Braun Medical | ||
| 18 G needle | Luer | NN1838R BD | tip bent in 45 degrees orifice to the outside |
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Temgesic Buprenorphine | RB Pharmaceuticals | 5429 | subcutaneous injection |
| Sodium Chloride 0.9% | |||
| Ventilation mask Rat | |||
| Scalple blade | |||
| Biemer clamp 18 mm, 5 mm opening | AgnTho | 64-562 | |
| Heat mat | |||
| Kocher Clamp | |||
| Shaving machine | |||
| Microscope | Leica | ||
| Right Heart Catheterization | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Eye ointment | Duratears | ||
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Needle 20 G | Luer | Tip slightly bent to the inside | |
| Cannula 20 G | Luer | to introduce catheter, tip pre-formed in 20 degrees | |
| Silastic Catheter 15 cm long | 0.5 mm ball 2 mm from tip | ||
| Pressure transducer | Ailtech | ||
| Bedside monitor Cardiocap/5 | Datex-Ohmeda | ||
| Shaving machine | |||
| 10 mL Syringe | |||
| Sodium Chloride 0.9% | for flushing | ||
| Vascular Morphology | |||
| 50 mL Syringe | |||
| 4% Formaldehyde | |||
| 18 G cannula with tube | |||
| Verhoef staining kit | Sigma-Aldrich | HT254 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en®ion=US |
| Digital slide scanner | Hamamatsu | C9600 | |
| ImageJ | |||
| Elastic (Connective Tissue Stain) | Abcam | ab150667 | http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf |
References
- Hoeper, M. M., Bogaard, H. J., Condliffe, R., et al. Definitions and diagnosis of pulmonary hypertension. J Am Coll Cardiol. 62, D42-D50 (2013).
- Stacher, E., Graham, B. B., Hunt, J. M., et al. Modern age pathology of pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 186 (3), 261-272 (2012).
- Levy, M., Maurey, C., Celermajer, D. S., et al. Impaired apoptosis of pulmonary endothelial cells is associated with intimal proliferation and irreversibility of pulmonary hypertension in congenital heart disease. J Am Coll Cardiol. 49 (7), 803-810 (2007).
- Sakao, S., Tatsumi, K., Voelkel, N. F. Reversible or irreversible remodeling in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (6), 629-634 (2010).
- Gomez-Arroyo, J. G., Farkas, L., Alhussaini, A. A., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (4), L363-L369 (2012).
- Jones, J. E. Serial noninvasive assessment of progressive pulmonary hypertension in a rat model. Am J Physiol - Heart Circ Physiol. 283 (1), 364-371 (2002).
- Hoffman, J. I., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Pulmonary vascular disease with congenital heart lesions: Pathologic features and causes. Circulation. 64 (5), 873-877 (1981).
- van Albada, M. E., Berger, R. M. Pulmonary arterial hypertension in congenital cardiac disease--the need for refinement of the evian-venice classification. Cardiol Young. 18 (1), 10-17 (2008).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Borgdorff, M. A., Berger, R. M. The role of disturbed blood flow in the development of pulmonary arterial hypertension: Lessons from preclinical animal models. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 305 (1), L1-L14 (2013).
- Garcia, R., Diebold, S. Simple, rapid, and effective method of producing aortocaval shunts in the rat. Cardiovasc Res. 24 (5), 430-432 (1990).
- Okada, K., Tanaka, Y., Bernstein, M., Zhang, W., Patterson, G. A., Botney, M. D. Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury. A neointimal model of pulmonary hypertension. Am J Pathol. 151 (4), 1019-1025 (1997).
- van Albada, M. E., Schoemaker, R. G., Kemna, M. S., Cromme-Dijkhuis, A. H., van Veghel, R., Berger, R. M. The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension. Eur Respir J. 26 (3), 487-493 (2005).
- Brittain, E. Echocardiographic assessment of the right heart in mice. JVis Exp. (e81), (2013).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Molema, G., et al. Egr-1 expression during neointimal development in flow-associated pulmonary hypertension. Am J Pathol. 179 (5), 2199-2209 (2011).
- Borgdorff, M. A., Bartelds, B., Dickinson, M. G., Steendijk, P., de Vroomen, M., Berger, R. M. Distinct loading conditions reveal various patterns of right ventricular adaptation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (3), H354-H364 (2013).
- Ruiter, G., de Man, F. S., Schalij, I., et al. Reversibility of the monocrotaline pulmonary hypertension rat model. Eur Respir J. 42 (2), 553-556 (2013).
- van Albada, M. E., Bartelds, B., Wijnberg, H., et al. Gene expression profile in flow-associated pulmonary arterial hypertension with neointimal lesions. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (4), L483-L491 (2010).
- Dickinson, M. G., Kowalski, P. S., Bartelds, B., et al. A critical role for egr-1 during vascular remodelling in pulmonary arterial hypertension. Cardiovasc Res. 103 (4), 573-584 (2014).
- van der Feen, D. E., Dickinson, M. G., Bartelds, M. G., et al. Egr-1 identifies neointimal remodeling and relates to progression in human pulmonary arterial hypertension. Jheart lung transplant. 35 (4), 481-490 (2016).
- Rungatscher, A. Chronic overcirculation-induced pulmonary arterial hypertension in aorto-caval shunt. Microvasc Res. 94, 73-79 (2014).
- O'Blenes, S. B., Fischer, S., McIntyre, B., Keshavjee, S., Rabinovitch, M. Hemodynamic unloading leads to regression of pulmonary vascular disease in rats. J Thorac Cardiovasc Surg. 121 (2), 279-289 (2001).
- Sakao, S., Taraseviciene-Stewart, L., Lee, J. D., Wood, K., Cool, C. D., Voelkel, N. F. Initial apoptosis is followed by increased proliferation of apoptosis-resistant endothelial cells. FASEB J. 19 (9), 1178-1180 (2005).
- Spiekerkoetter, E. FK506 activates BMPR2, rescues endothelial dysfunction, and reverses pulmonary hypertension. J Clin Invest. 123 (8), 3600-3613 (2013).
- Nickel, N. P., Spiekerkoetter, E., Gu, M., et al. Elafin reverses pulmonary hypertension via caveolin-1-dependent bone morphogenetic protein signaling. Am J Respir Crit Care Med. 191 (11), 1273-1286 (2015).
- Meloche, J., Potus, F., Vaillancourt, M., et al. Bromodomain-containing protein 4: The epigenetic origin of pulmonary arterial hypertension. Circ Res. 117 (6), 525-535 (2015).
- Happé, C. M. Pneumonectomy combined with SU5416 induces severe pulmonary hypertension in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 310 (11), L1088-L1097 (2016).
- Ranchoux, B., Antigny, F., Rucker-Martin, C., et al.
- de Raaf, M. A. SuHx rat model: Partly reversible pulmonary hypertension and progressive intima obstruction. Eur Respy J. 44 (1), 160-168 (2014).
- Elastic (Connective Tissue Stain) Instructions for Use. , Available from: http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf (1506).
