Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

शंट सर्जरी, सही दिल कैथीटेराइजेशन, और संवहनी Morphometry एक चूहे मॉडल में प्रवाह प्रेरित पल्मोनरी धमनी उच्च रक्तचाप के लिए

Published: February 11, 2017 doi: 10.3791/55065
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 1, 1
1Center for Congenital Heart Diseases, Department of Pediatric Cardiology, Beatrix Children's Hospital, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 2Research and Development Facility, University Medical Center Groningen, University of Groningen

Introduction

इस पद्धति का लक्ष्य चूहों में गंभीर, प्रवाह प्रेरित फेफड़े के धमनी उच्च रक्तचाप के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल बनाने के लिए और अपने सिद्धांत रक्तसंचारप्रकरण और histopathological अंत अंक उपाय है।

पल्मोनरी धमनी उच्च रक्तचाप (PAH) एक नैदानिक ​​सिंड्रोम है कि सही निलय विफलता और मौत के लिए अग्रणी फेफड़े संवहनी प्रतिरोध में एक प्रगतिशील वृद्धि शामिल है। फेफड़े के उच्च रक्तचाप से ग्रस्त रोगों (पीएच) के उच्चकोटी रोग स्पेक्ट्रम के भीतर, पीएएच सबसे गंभीर रूप है और एक कि एक इलाज 1 के बिना बनी हुई है। पीएएच में अंतर्निहित धमनीविकृति कि पोत लुमेन occludes संवहनी remodeling के एक विशिष्ट रूप की विशेषता है। सामान्य गैर muscularized वाहिकाओं और औसत दर्जे का पोत परत की अतिवृद्धि के Muscularization पीएएच में जल्दी रोग घटना के रूप में माना जाता है, भी पीएच 2 के अन्य रूपों में देखा जाता है, और प्रतिवर्ती 3 माना जाता है। पीएएच एक के रूप मेंdvances, intimal परत फिर से तैयार करने के लिए, अंत में विशेषता neointimal घावों 2 बनाने शुरू होता है। Neointimal प्रकार फेफड़े संवहनी remodeling पीएएच के लिए विशेष है और वर्तमान में अपरिवर्तनीय 4 होना करने के लिए माना जाता है।

पीएएच एक दुर्लभ बीमारी है, इसकी pathobiological समझ में प्रगति और उपन्यास उपचारों के विकास के पशु मॉडल पर काफी भरोसा है। चूहों में monocrotalin (एमसीटी) मॉडल एक सरल एकल हिट मॉडल है कि कर दिया गया है, और अब भी, अक्सर इस्तेमाल किया जाता है। एमसीटी एक विष है कि फेफड़े धमनियों और क्षेत्रीय सूजन से 5 चोट का कारण बनता है। 60 मिलीग्राम / किग्रा एमसीटी मतलब फेफड़े के धमनी दबाव (mPAP), फेफड़े संवहनी प्रतिरोध (पीवीआर) में वृद्धि हो जाती है, और सही निलय अतिवृद्धि (RVH) 3 के बाद - 4 सप्ताह 6। Histomorphology neointimal घावों 5 के बिना पृथक औसत दर्जे का अतिवृद्धि की विशेषता है। एमसीटीचूहे मॉडल इस प्रकार, पीएच की एक उदारवादी रूप है, और न पीएएच का प्रतिनिधित्व करता है, हालांकि यह आमतौर पर बाद के रूप में प्रस्तुत किया है।

एक जन्मजात बायें से दायें अलग धकेलना (PAH-सीएचडी) के साथ जुड़े पीएएच के साथ बच्चों में वृद्धि हुई फेफड़े के रक्त के प्रवाह neointimal घावों 7, 8, 9 के विकास के लिए आवश्यक ट्रिगर के रूप में माना जाता है। चूहों में, वृद्धि हुई फेफड़े के रक्त के प्रवाह को उदर महाधमनी और रग कावा, पहली बार 1990 में 10 में वर्णित एक तकनीक के बीच एक अलग धकेलना के निर्माण के द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। बढ़ी हुई फेफड़े के प्रवाह पैदा करने के लिए विकल्प एकतरफा न्यूमोनेक्टॉमी द्वारा या फेफड़े के धमनी सम्मिलन से 11 subclavian से कर रहे हैं। इन मॉडलों के वैचारिक नुकसान न्यूमोनेक्टॉमी, या कारण फेफड़े vasculature की चिकित्सकजनित चोट के द्वारा प्रेरित शेष फेफड़ों और अनुकूली मार्ग सक्रियण के संभावित प्रतिपूरक विकास से मिलकर बनता हैफेफड़े के धमनी सम्मिलन के लिए, दोनों में वृद्धि हुई फेफड़े के रक्त के प्रवाह के प्रभाव confounding।

एक aorto-Caval अलग धकेलना बनाया और बढ़ फेफड़े के रक्त के प्रवाह एमसीटी इलाज चूहों में एक दूसरे हिट के रूप में प्रेरित किया जाता है, जब विशेषता neointimal घावों होते हैं, और पीएएच की एक गंभीर रूप और संबद्ध सही निलय विफलता (RVF) 3 सप्ताह विकसित के बाद बढ़ा प्रवाह 12। इस मॉडल में पीएएच का रक्तसंचारप्रकरण प्रगति इकोकार्डियोग्राफी और सही दिल कैथीटेराइजेशन द्वारा विवो में मूल्यांकन किया जा सकता है। संवहनी histomorphology, पोत दीवार मोटाई, arteriolar रोड़ा की डिग्री है, और मानकों को सही निलय विफलता के लिए पीएएच के पूर्व vivo लक्षण वर्णन के खंभे के रूप में।

इस विधि aorto-Caval अलग धकेलना (एसी-अलग धकेलना) सर्जरी के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल, सही दिल कैथीटेराइजेशन, और नाड़ी histomorphology के गुणात्मक और मात्रात्मक आकलन बताता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं और पशु प्रयोगों के लिए डच केंद्रीय समिति विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर ग्रोनिंगन में पशु की देखभाल समिति (NL) द्वारा अनुमोदित किया गया है। 180 और 300 ग्राम के बीच वजन के साथ दोनों Wistar और लुईस चूहों का इस्तेमाल किया गया।

1. आवास और Acclimatization

  1. केंद्रीय जानवरों की सुविधा, पिंजरे प्रति 5 के समूह में घर चूहों पर आने के बाद। एक 7 दिन अभ्यस्त अवधि के दौरान, मानव से निपटने के लिए चूहों accustom, लेकिन किसी भी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का प्रदर्शन नहीं करते।

2. तैयारी और बाँझ Monocrotalin इंजेक्शन

  1. 60 मिलीग्राम / एमएल monocrotalin (एमसीटी) समाधान के 1 मिलीलीटर के लिए, एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में monocrotalin के 60 मिलीग्राम वजन। 0.9% NaCl के 700 μL जोड़ें। 1 एम एचसीएल के 200 μL जोड़ें। गर्म चल रहा पानी के नल और यह भंवर के तहत ट्यूब में समाधान गर्म। 6 एन NaOH का उपयोग 7.0 पीएच की ओर लाने के लिए। मूषक में इंजेक्शन के लिए एमसीटी की तैयारी के लिए बाँझ तकनीक का प्रयोग करें। बाँझ 60 मिलीग्राम / एमएल एमसीटी किलो subcutaneously प्रति गर्दन में (60 मिलीग्राम / एमएल एमसीटी के 0.3 एमएल 300-जी चूहे के लिए) समाधान के 1 एमएल इंजेक्षन। नोट: हम अधिक से अधिक मौका है कि इंजेक्शन की खुराक उचित नहीं होगा के कारण छोटे संस्करणों का उपयोग करने के लिए पसंद नहीं है।

3. महाधमनी-Caval शंट सर्जरी

  1. संज्ञाहरण।
    1. (प्रवाह: 1 एल / मिनट) 5% isoflurane / 100% ओ 2 के साथ प्रेरण कक्ष भरें और चैम्बर में चूहे जगह है। एक हिंद पैर की अंगुली चुटकी प्रदर्शन से संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई के लिए जाँच करें। चूहे वजन।
    2. दाढ़ी और एक क्षेत्र है कि लगभग 8 सेमी लंबी और 3 सेमी चौड़ा है पर पेट साफ। एक गर्मी चटाई (37 डिग्री सेल्सियस) एक बाँझ चटाई द्वारा कवर पर अपनी पीठ पर चूहे रखें।
    3. 3 isoflurane% / 100% ओ 2 (: 1 एल / मिनट प्रवाह) - 2 के साथ एक वेंटिलेशन मुखौटा / हुड में थूथन रखें। एक हिंद पैर की अंगुली चुटकी प्रदर्शन से संज्ञाहरण की गहराई की जाँच करें। जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंख मरहम लागू करें।
  2. शंट सुरGery।
    1. कीटाणुशोधन के लिए क्लोराइड-hexidine साथ त्वचा साफ़। 0.01 मिलीग्राम / किलो buprenorphine पोस्ट ऑपरेटिव analgesia के लिए subcutaneously इंजेक्षन।
    2. सर्जरी के लिए बाँझ उपकरणों का प्रयोग करें। midline पर पेट में एक # 10 स्केलपेल ब्लेड के साथ एक चीरा, डायाफ्राम एक बस के जननांग ऊपर से नीचे का विस्तार नीचे 1 सेमी शुरू।
    3. एक कपास झाड़ू के साथ आंत उठाकर एक बाँझ, गीला धुंध (0.9% NaCl) में आंतों को कवर किया है, और उन्हें जानवर के बाईं ओर करने के लिए जगह है।
    4. कपास swabs का उपयोग झिल्ली कि उदर महाधमनी और रग आसपास के ऊतकों को नीचा कावा देते हैं अलग करने के लिए।
      नोट: महाधमनी और रग कावा के बीच झिल्ली काटना मत करो।
    5. किरच संदंश का प्रयोग, बस विभाजन ऊपर परिवाहकीय महाधमनी चर्बी हटाने, केवल महाधमनी के सही पक्ष पर और केवल साइट है जहाँ सुई डाला जाएगा पर।
    6. 2 मिमी supe से महाधमनी और रग कावा अलग करने के लिए कपास swabs का प्रयोग करेंसाइट है जहाँ सुई के क्रम में एक Biemer दबाना के लिए जगह बनाने के लिए में डाला जाएगा करने के लिए rior।
    7. इस क्षेत्र में पहली बार एक ढीला संयुक्ताक्षर (5-0 सिवनी) महाधमनी के आसपास जगह है। उस पर एक कोचर दबाना रखकर संयुक्ताक्षर पर तनाव बना, और फिर कोचर चीरा (चित्रा 1 ए) के लिए बेहतर जगह है। जगह Biemer दबाना सिर्फ संयुक्ताक्षर (Figur ई 1 ए) के लिए बेहतर।
    8. एक कपास झाड़ू का प्रयोग, रग कावा संक्षिप्त रूप में संभव के रूप में distally प्रवाह (चित्रा 1 ए) में बाधा डालती। Bend एक सुई (इस प्रोटोकॉल में 18 जी) एक 45 डिग्री के कोण में, बाहर (चित्रा 1 ए) की ओर इशारा करते हुए छिद्र के साथ।
    9. 90 डिग्री के कोण पर, महाधमनी में सुई डालने सिर्फ विभाजन ऊपर, बाएं (चित्रा 1 ए) के लिए सुई की ओर इशारा करते के छिद्र के साथ। बाईं ओर सुई की नोक हेरफेर और रग कावा में डालें।
      नोट: visi सुई की नोक अब होना चाहिएरग कावा (चित्रा 1 बी) में ble।
    10. प्रविष्टि साइट से बाहर महाधमनी में रक्त शेष पुश करने के लिए घनास्त्रता को रोकने के लिए एक दूसरे कपास झाड़ू का प्रयोग करें। गोंद पर्याप्त रूप से छड़ी करने के लिए आदेश में एक बाँझ धुंध के साथ अलग धकेलना के आसपास के क्षेत्र सूखी।
    11. महाधमनी के बाहर पूरे सुई खींचो और तुरंत महाधमनी में पंचर साइट पर ऊतक गोंद की एक बूंद लागू होते हैं। ऊतकों को कपास झाड़ू गोंद के लिए नहीं सुनिश्चित करें। महाधमनी Unclamp।
    12. पर खींच रहा है और अलग धकेलना को महाधमनी समीपस्थ पर संयुक्ताक्षर जारी करके मैन्युअल रूप से अलग धकेलना की जाँच करें। ढीला उज्ज्वल लाल रंग में अलग धकेलना को रग कावा बाहर का रंग और अलग धकेलना स्थल पर अशांति पैदा करना चाहिए।
      नोट: कस वापस गहरे लाल रंग के रग कावा में खून बंद हो जाएगा।
    13. आंतों जानवर में वापस जगह है। पेशी परत और resorbable 4-0 टांके के साथ त्वचा को बंद करें। संज्ञाहरण से उबरने के लिए 100% 2 हे के साथ पशु हवादार।
      नोट: एक ani मत छोड़ोमल पहुंच से बाहर है जब तक यह पर्याप्त होश आ गया है स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए।
  3. नकली सर्जरी।
    1. महाधमनी में सुई की प्रविष्टि के लिए छोड़कर ऊपर प्रक्रियाओं के सभी को पूरा करें।
  4. शल्य चिकित्सा के बाद की देखभाल।
    1. एक भी पिंजरे में और अगली सुबह तक 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में चूहे रखें।
    2. चारों ओर 6 घंटे की सर्जरी के बाद, पोस्ट ऑपरेटिव analgesia के लिए इंजेक्षन 0.01 मिलीग्राम / किलो buprenorphine subcutaneously। अगली सुबह दोहराएँ अगर चूहे तकलीफ के लक्षण दिखाता है।
      नोट: सर्जरी के बाद पहले 3 दिन, चूहों (यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब चाउ या पीने के पानी दवाओं के साथ मिश्रित कर रहे है) खाने और कम पीने के लिए करते हैं। ज्यादातर चूहों 3 दिन सर्जरी के बाद सामान्य व्यवहार प्रदर्शित करते हैं। यदि नहीं, तो बारीकी से निगरानी। वजन 1 सप्ताह में 15% से अधिक नुकसान असामान्य माना जाता है, और इस तरह के चूहों घूम रक्त की मात्रा है, जबकि संज्ञाहरण के तहत की निकासी के द्वारा euthanized किया जाना चाहिए।

नोट: इस प्रोटोकॉल में, पशु घूम रक्त की मात्रा है, जबकि संज्ञाहरण के तहत की निकासी के द्वारा euthanized है।

  1. बढ़ी हुई फेफड़े के रक्त के प्रवाह को जल्दी सेलुलर और कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं (जैसे, अप-विनियमन या जल्दी प्रतिलेखन कारक जीन) के लिए सर्जरी (MF8) के बाद 1 दिन बलिदान।
  2. एक प्रारंभिक चरण पीएएच संवहनी phenotype (neointimal घावों के बिना औसत दर्जे का अतिवृद्धि) के लिए सर्जरी (MF14) के बाद 1 सप्ताह के बलिदान।
  3. एक उन्नत चरण पीएएच संवहनी phenotype के लिए सर्जरी (MF21) (चिह्नित औसत दर्जे का अतिवृद्धि और neointimal गठन) RVP और mPAP में हल्के ऊंचाई के साथ के बाद 2 सप्ताह बलिदान।
  4. एक अंत चरण पीएएच संवहनी phenotype के लिए सर्जरी (MF28) (चिह्नित neointimal रोड़ा) और मजबूत ऊंचाई RVP और mPAP में 3 सप्ताह के बाद बलिदान। सही निलय विफलता के नैदानिक ​​लक्षण इस चरण में आम हैं।
  5. 28 दिन (एमएफ-RVF के बाद बलिदान) पीएएच जुड़े सही निलय विफलता (RVF), चिकित्सकीय श्वास कष्ट, गंभीर सुस्ती, और वजन घटाने (<1 सप्ताह में 10%) के रूप में परिभाषित किया गया है। चूहों बर्खास्त जब इन लक्षणों में से एक मौजूद है। अक्सर, चूहों दिन 28 और 35 के बीच है और ये लक्षण विकसित, अगर बेपनाह छोड़ दिया है, इस समय अंतराल के दौरान अनायास मर जाते हैं।

5. सही दिल कैथीटेराइजेशन

  1. संज्ञाहरण।
    1. (प्रवाह: 1 एल / मिनट) 5% isoflurane / 100% ओ 2 के साथ प्रेरण कक्ष भरें और बॉक्स में चूहे जगह है। एक हिंद पैर की अंगुली चुटकी प्रदर्शन से संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई के लिए जाँच करें। चूहे वजन।
    2. दाढ़ी और चूहे की सही-उदर पक्ष में गर्दन को साफ और, इकोकार्डियोग्राफी प्रोटोकॉल, छाती और पेट के ऊपरी हिस्से के लिए।
    3. एक गर्मी चटाई (37 डिग्री सेल्सियस) पर अपनी पीठ पर चूहे की जगह और 2 के साथ एक वेंटिलेशन मुखौटा / हुड में थूथन जगह - 3% isoflurane / 100% ओ 2 (प्रवाह: 1 एल / मिनट)। थूथन शोधकर्ता की ओर का सामना करना पड़ा जाना चाहिए।
  2. इकोकार्डियोग्राफी प्रोटोकॉल।
    1. प्रोटोकॉल Brittain एट अल द्वारा वर्णित के अनुसार इकोकार्डियोग्राफी प्रदर्शन करना। जौव 13 में।
  3. कैथीटेराइजेशन प्रोटोकॉल।
    नोट: इस प्रोटोकॉल एक preformed टिप के साथ एक कठोर प्रवेशनी 20 डिग्री आमादा सिरे से एक गेंद 2 मिमी के साथ 15 सेमी सिलिकॉन कैथेटर मार्गदर्शन करने के लिए उपयोग करता है। अपने छिद्र से थोड़ा अंदर करने के झुकाव के साथ एक 20-जी सुई सही गले नस में प्रवेशनी डालने के लिए प्रयोग किया जाता है (सामग्री की सूची देखें)। पीएएच प्रगति और नियंत्रण के किसी भी चरण में चूहे इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. क्लोराइड-hexidine के साथ गर्दन कीटाणुरहित। सही-उदर पक्ष में एक # 10 स्केलपेल ब्लेड के साथ एक 1.5 सेमी चीरागर्दन की, सही कॉलर बोन से जबड़े की हड्डी के लिए।
    2. कैंची का उपयोग ऊतक बिखरा हुआ है। चिमटी का प्रयोग, धीरे ऊतक अलग खींच जब तक गले नस प्रकट होता है। किरच संदंश का उपयोग नस गले के चारों ओर झिल्ली काटना।
    3. पोत के चारों ओर एक ढीला संयुक्ताक्षर (5-0 सिवनी) रखकर गले नस पर तनाव डाल दिया। तनाव में वृद्धि और वेंटिलेशन मुखौटा (2A चित्रा) पर संयुक्ताक्षर टेप।
    4. प्रविष्टि साइट के बहाव के बाद प्रवेशनी आदेश रिसाव और दबाव की हानि को रोकने के लिए बगल में है कसने के लिए पोत के चारों ओर एक ढीला संयुक्ताक्षर जगह है।
    5. एक संदंश के हैंडल का उपयोग करना, थोड़ा कैथेटर के साथ प्रवेशनी संचालन करने के लिए अंदर करने के लिए छिद्र के साथ एक 20-जी सुई की नोक मोड़।
    6. नस में 20-जी सुई की नोक परिचय और जल्दी से पोत के अंदर कैथेटर युक्त प्रवेशनी जगह है। सुई बाहर खींचो, और फिर संयुक्ताक्षर बंदउस कदम 5.3.4 में तैयार किया गया था।
    7. गले नस में कैथेटर युक्त प्रवेशनी आचरण। प्रवेशनी की नोक एक 20 डिग्री की अवस्था में है (कदम 5.3.5 देखें)। कॉलर बोन के नीचे प्रवेशनी पैंतरेबाजी और सही आलिंद (चित्रा -2) में प्रवेश के लिए एक छोटी सी अग्रिम।
    8. सही वेंट्रिकल में प्रवेश करने के लिए, बाईं ओर प्रवेशनी की नोक, दिल (चित्रा 2 डी) की ओर इशारा करते हैं। बेडसाइड मॉनिटर पर, एक आर.वी. दबाव की अवस्था प्रकट करना चाहिए, चित्रा 2 डी मिलान।
    9. जब आर.वी. दबाव वक्र स्थिर है, सिस्टोलिक और डायस्टोलिक सही निलय दबाव 1 लिखने के नीचे (sRVP1 / dRVP1)।
    10. बाएं और ऊपर की तरफ करने के लिए प्रवेशनी की नोक हेरफेर। प्रवेशनी (चित्रा 2 ई) के भीतर कैथेटर अग्रिम।
    11. मुख्य फेफड़े के धमनी (पीए) में कैथेटर अग्रिम। कोई प्रतिरोध जब फेफड़े के वाल्व गुजर महसूस किया जाना चाहिए।
      ध्यान दें: कैथेटर मुख्य फेफड़े के धमनी में प्रवेश करती है, घiastolic दबाव बढ़ जाएगा। बेडसाइड मॉनिटर पर, एक फिलीस्तीनी अथॉरिटी दबाव की अवस्था प्रकट करना चाहिए, चित्रा 2 ई मिलान।
    12. जब पीए दबाव वक्र स्थिर है, सिस्टोलिक, डायस्टोलिक नीचे लिखते हैं, और पीए दबाव 1 (sPAP1, dPAP1, mPAP1) मतलब है।
    13. इसके अलावा प्रवेशनी भीतर कैथेटर अग्रिम जब तक कैथेटर की नोक पर गेंद एक फेफड़े के धमनी में अंकित हो जाता है। बिस्तर पर नजर रखने के ड्रॉप पर दबाव की अवस्था का निरीक्षण करें और चित्रा 2 एफ में कील दबाव वक्र मेल खाते हैं।
    14. जब कील दबाव वक्र स्थिर है, सिस्टोलिक, डायस्टोलिक लिख, और कील दबाव मतलब है।
    15. धीरे-धीरे और बाद में कैथेटर वापस खींचो मापने के लिए और के रूप में बेडसाइड मॉनिटर पर प्रदर्शित sPAP2, dPAP2, mPAP2, sRVP2, और dRVP2 के लिए मूल्यों को नीचे लिखें।
    16. जब आर.वी. में, थोड़ा वापस प्रवेशनी और कैथेटर को मापने के लिए खींच सही आलिंद दबाव (आरएपी) मतलब है। वक्र चित्रा 2A में आरएपी वक्र मेल खाना चाहिए।
      नहींते: इस प्रोटोकॉल में, चूहों कैथीटेराइजेशन प्रोटोकॉल के बाद घूम रक्त की मात्रा की निकासी जबकि संज्ञाहरण के तहत द्वारा euthanized हैं।

6. आकृति विज्ञान आकलन और Morphometry

नोट: इस प्रोटोकॉल में, पशु घूम रक्त की मात्रा है, जबकि संज्ञाहरण के तहत की निकासी के द्वारा euthanized है। पीएएच प्रगति और नियंत्रण के किसी भी चरण में चूहे इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. बलिदान के बाद, ब्रोन्कियल विभाजन ऊपर 5 मिमी और वाहिकाओं है कि दिल को फेफड़ों कनेक्ट के बारे में श्वासनली काटने से फेफड़ों के लिए बाहर ले। ठंड खारा में फेफड़ों रखो। बाएं फेफड़े काटना। बंटवारे पर छोड़ मुख्य श्वसनी कट।
  2. 4% paraformaldehyde के साथ एक 50 मिलीलीटर सिरिंज भरें, सिरिंज के लिए एक प्रवेशनी के साथ एक ट्यूब देते हैं, और काम की मेज के ऊपर एक मीटर के बारे में सिरिंज लटका। बाईं मुख्य श्वसनी में प्रवेशनी फ़िट निष्क्रिय paraformaldehyde के साथ फेफड़ों को भरने के लिए।सावधानी के साथ paraformaldehyde संभाल लेना।
  3. 48 घंटे के लिए paraformaldehyde में बाएं फेफड़े सेते हैं।
  4. 70% इथेनॉल (1 ज), 80% इथेनॉल (1 ज), 90% इथेनॉल (1 घंटे), 100% इथेनॉल (3 घंटे), XYLOL (2 घंटे), और आयल में लगातार इसे incubating द्वारा बाएं फेफड़े निर्जलीकरण ( 2 ज)।
  5. पैराफिन में बाएं फेफड़े एम्बेड, फेफड़ों कैसेट का सामना करना पड़ के साथ नाभिका।
  6. एक Verhoeff या Elastica वैन Gieson धुंधला का उपयोग आयल एम्बेडेड, 4-माइक्रोन फेफड़ों वर्गों दाग, निर्माता के निर्देशों के अनुसार 29। सुनिश्चित करें कि लोचदार laminae अच्छी तरह से (चित्रा 3) के रूप में भेदभाव कर रहे हैं। 40x बढ़ाई पर दाग वर्गों के लिए स्कैन।
  7. 4 quadrants में फेफड़ों की फूट डालो। प्रत्येक चक्र में, <एक बाहरी व्यास के साथ 50 माइक्रोन (इंट्रा-कोष्ठकी) और 10 जहाजों> एक ​​बाहरी व्यास के साथ 10 जहाजों में 50 माइक्रोन (पूर्व कोष्ठकी) लगता है। एक चित्र (2 x 40 फेफड़ों के प्रति चित्रों) ले लो। में ज़ूम बेतरतीब ढंग से 20x बढ़ाई और फोटोग्राफ हर पोत अपदेखने के इस क्षेत्र में चयन के पूर्वाग्रह को कम करने के लिए।
  8. जहाजों> 2 के एक सबसे लंबे समय तक / कम से कम व्यास का अनुपात, एक अधूरी गोल आकार, या पोत दीवार के एक से अधिक तिमाही के एक पतन है कि खाये।
    नोट: एक बाहर रखा पोत का एक उदाहरण चित्र में दिखाया गया है एक ही बढ़ाई (40X) पर प्रत्येक चित्र बनाओ और एक पैमाने पर पट्टी शामिल 3 बी।
  9. ओपन ImageJ और पहली तस्वीर। "विश्लेषण" के माध्यम पैमाने पर सेट करने के लिए चित्र में बड़े पैमाने पट्टी पर एक सीधी रेखा खींचना और "पैमाने निर्धारित करें।" के लिए "ज्ञात दूरी," तस्वीर के पैमाने पर पट्टी पर मूल्य का उपयोग करें। लंबाई की इकाई के रूप में माइक्रोमीटर (माइक्रोन) का प्रयोग करें। वैश्विक पैमाने पर सेट।
  10. का प्रयोग "मुक्तहस्त चयन," ल्यूमिनल क्षेत्र (चित्रा 3) के भीतर की सीमा पर एक रेखा खींचना, और उपयोग करने के "उपाय" (Crtl मीटर) इस क्षेत्र को मापने के लिए। फिर, बाहरी ELAST के चारों ओर एक रेखा खींचनाआईसी पटल (चित्रा 3) कुल पोत क्षेत्र को मापने के लिए।
  11. ल्यूमिनल और बाहरी व्यास की गणना ( समीकरण ) का उपयोग समीकरण ।
  12. का उपयोग कर दीवार मोटाई की गणना समीकरण ।
  13. का उपयोग कर दीवार / लुमेन अनुपात की गणना समीकरण ।
  14. का उपयोग करते हुए रोड़ा स्कोर की गणना समीकरण ।
  15. Muscularization पर स्कोर पोत (नहीं, आंशिक या कुल muscularization) (चित्रा 3 बी)।
    नोट: आधे से अधिक परिधि के लिए एक डबल लोचदार पटल के साथ जहाजों परिभाषित कर रहे हैं के रूप में पूरी तरह से muscularized। एक डबल लोचदार पटल आधे से भी कम परिधि के साथ जहाजों के रूप में परिभाषित कर रहे हैं आंशिक रूप से muscularized।
  16. एक neoi की उपस्थिति पर स्कोर पोतntima (हाँ या नहीं) (चित्रा 3 सी)।
    नोट: (अक्सर सनकी) ल्यूमिनल रोड़ा के साथ संयुक्त एक स्पष्ट रूप से परिभाषित आंतरिक लोचदार पटल बिना वेसल्स neointimal घावों के रूप में परिभाषित कर रहे हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 4 में प्रस्तुत कर रहे हैं। नियंत्रण (एन = 3), MF8 (एन = 5), MF14 (एन = 5), MF28 (एन = 5), और म्यूचुअल फंड-RVF (: परिणाम प्रस्तुत एमसीटी + निम्नलिखित समूहों में लुईस चूहों में प्रवाह की विशेषताओं को दिखाने एन = 10)। सांख्यिकीय विश्लेषण Bonferroni सुधार के साथ एक तरह से एनोवा का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया।

60 मिलीग्राम / किग्रा एमसीटी और सिस्टोलिक सही निलय दबाव में एक मतलब वृद्धि (sRVP) (23 ± 6 56 ± 11 एमएमएचजी के लिए), सिस्टोलिक फेफड़े के धमनी दबाव (sPAP) (20 ± 4 54.0 ± 10 एमएमएचजी करने के लिए फेफड़े के रक्त के प्रवाह नेतृत्व में वृद्धि ), और 16 ± 3 36 एमएमएचजी के लिए ± 4) 28 दिन (MF28) पर इसका मतलब यह फेफड़े के धमनी दबाव (mPAP) (। वे मंच जब सही निलय विफलता विकसित (एमएफ-RVF) (चित्रा 4) के लिए समान रूप से उच्च रहते हैं। जल्दी पीएएच चरणों (MF8 और MF14) में sRVP, sPAP, और mPAP में कोई वृद्धि मनाया जाता है। डायस्टोलिक पीएपी और सही एकदेर चरणों में परीक्षण दबाव वृद्धि हुई है, लेकिन काफी नहीं। कील दबावों रोग प्रगति के दौरान काफी बदल नहीं है।

सही निलय से बाएं निलय और सेप्टल वजन अनुपात MF-RVF को MF14 से काफी बढ़ जाती है, सही निलय अतिवृद्धि का संकेत है। जिगर के गीला करने वाली शुष्क वजन के अनुपात में काफी MF-RVF चरण में वृद्धि हुई है, जिगर शोफ और congestive सही निलय विफलता का संकेत है।

इंट्रा-कोष्ठकी वाहिकाओं के Muscularization <पीएएच प्रगति के दौरान 50 माइक्रोन बढ़ जाती है उत्तरोत्तर। इस आकार के जहाजों सामान्य रूप से नियंत्रण चूहों में एक पेशी औसत दर्जे परत नहीं है। MF14 में, इन जहाजों (43 ± 17%) के लगभग आधे (चित्रा 3 बी के रूप में) कुल पहलवान मीडिया है। MF28 और म्यूचुअल फंड-RVF में लगभग हर धमनिका muscularized है (98.7 ± 2.5% और 100 ± 0%)। Neointimal घावों पहले घटितMF21 पर, MF28 और म्यूचुअल फंड-RVF में हालांकि, सभी धमनियों का लगभग 65% (चित्रा 3 सी के रूप में) एक neointimal परत है। arteriolar दीवार से लुमेन अनुपात और रोड़ा स्कोर MF28 (क्रमशः MF14 से दोनों में काफी वृद्धि, 10.4 ± 3.9 71.5 ± 30 (चुनाव के लिए 7.1 ± 0.2) और 20.0 ± 2.8 54.7 ± 10.6 (चुनाव के लिए: 12.2 ± 0.3) )। रक्तसंचारप्रकरण और histomorphological Wistar चूहों में एमसीटी + प्रवाह में पीएएच प्रगति की विशेषताओं समान 14 हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. Aorto-Caval शंट सर्जरी की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। ए) महाधमनी tensioned और प्रविष्टि साइट से बेहतर clamped है। रग कावा प्रविष्टि साइट के लिए अवर संकुचित है। सुई, 45 डिग्री पर और बाहर करने के लिए छिद्र के साथ तुला, एक 90 डिग्री के कोण पर महाधमनी में डाला जाता है। बी) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. सही दिल कैथीटेराइजेशन प्रक्रिया और प्रतिनिधि दबाव घटता। ए) सही गले नस एक संयुक्ताक्षर साथ tensioned और वेंटिलेशन मुखौटा पर टेप है। कैथेटर गले नस में रखा गया है। बी) के एक बिस्तर पर नजर रखने के लिए एक सही निलय दबाव लहर प्रदर्शित। सी) प्रवेशनी सही गले नस में शुरूआत के बाद सही आलिंद में रखा भीतर कैथेटर। नीचे: एक ठेठ सही आलिंद दबाव लहर। डी) प्रवेशनी सही वेंट्रिकल में रखा भीतर कैथेटर। नीचे: एक ठेठ सही ventriculअंत मंच पीएएच में एआर दबाव लहर। ई) कैथेटर प्रवेशनी में उन्नत मुख्य फेफड़े के धमनी दर्ज है। नीचे: एक ठेठ फेफड़े के धमनी दबाव लहर। जब तक एक कील दबाव लहर मॉनिटर पर प्रदर्शित किया जाता है एफ) कैथेटर फेफड़े धमनियों में उन्नत है। नीचे: एक ठेठ फेफड़े कील दबाव लहर। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. नाड़ी आकृति विज्ञान और Morphometry नियंत्रण और पीएएच चूहे में। ए) एक सामान्य, 3.7% की एक रोड़ा स्कोर के साथ गैर-muscularized पोत। बी) 24.3% की एक रोड़ा स्कोर के साथ एक पूरी तरह से muscularized धमनिका। सी)। 54.1% की एक रोड़ा स्कोर के साथ एक neointimal घाव। डी) ई) की कुल पोत और ल्यूमिनल क्षेत्र की माप (एक neointimal घाव का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व के साथ एक बर्तन में), गणना भी शामिल है। सलाखों के 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. पल्मोनरी hemodynamics और संवहनी आकृति विज्ञान / Morphometry के प्रतिनिधि परिणाम है। सांख्यिकीय विश्लेषण Bonferroni सुधार के साथ एक तरह से एनोवा का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। मान ± SEM के मतलब के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। कांग्रेस: ​​नियंत्रण; म्यूचुअल फंड (monocrotalin + प्रवाह); RVF: सही निलय विफलता; एस: सिस्टोलिक; डी: डायस्टोलिक; M: मतलब; RVP: सही निलय दबाव; पीएपी: pulmonarY धमनी दबाव; आरएपी: सही आलिंद दबाव। आर.वी.: सही वेंट्रिकल; एल.वी.: बाएं वेंट्रिकल; IVS: interventricular पट; BW: शरीर के वजन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस विधि चूहों प्रवाह प्रेरित पीएएच और तकनीक सिद्धांत रक्तसंचारप्रकरण और histopathological अंत बताते हैं कि पीएएच और इस मॉडल को चिह्नित आकलन करने के लिए बनाने के लिए एमसीटी के साथ पूर्व इलाज में एक aorto-Caval अलग धकेलना की शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया का वर्णन करता है।

प्रोटोकॉल और समस्या निवारण के भीतर महत्वपूर्ण कदम

सर्जरी और बाद सर्जरी। aorto-Caval शंट सर्जरी के दौरान सबसे महत्वपूर्ण कदम महाधमनी और रग कावा के विच्छेदन है। झिल्ली कि लगा देना महाधमनी और रग कावा पर्याप्त विच्छेदित किया जाना चाहिए 1) महाधमनी क्षेत्र है, जहां सुई डाला जाएगा की अच्छी दृश्यता बनाने के लिए, और करने के लिए प्रविष्टि के बाद रग कावा में सुई की स्थिति और 2) पर्याप्त स्थान की प्रविष्टि साइट ऊपर महाधमनी दबाना। एक ही झिल्ली, तथापि, यह भी दोनों जहाजों (चित्रा 1) के बीच पंचर साइट के माध्यम से महाधमनी रक्त संचालन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। झिल्ली बहुत ज्यादा विदारक होगाअलग धकेलना रिसाव के कारण। ऊतक गोंद रिसाव का समाधान हो सकता है, लेकिन यह फिर भी अलग धकेलना में रिसना सकता है, इसका आकार समझौता किए। गोंद वाहिकाओं के अलग धकेलना के माध्यम से प्रवाह या तो प्रतिबंधित हो गया है, गोंद धीरे हटाया जा सकता है, लेकिन रग कावा की या झिल्ली कि आचरण अलग धकेलना हो सकता है की टूटना। आकार या अलग धकेलना की पर्याप्तता रंग अंतर और संपीड़न और एक कपास झाड़ू के साथ समीपस्थ महाधमनी के decompression के दौरान रग कावा में रक्त की अशांति की डिग्री की तुलना द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है।

एक 18 जी सुई चूहों (संदर्भ 14 देखें) और सही निलय मात्रा अधिभार 15 की पर्याप्त अलग धकेलना है कि लुईस (इस लेख) और Wistar में पीएएच प्रगति का एक सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के रूप में परिणाम बनाने के लिए दिखाया गया है। एक 18 जी सुई सबसे अच्छी तरह से संतुलित अलग धकेलना बनाया है, साथ काफी एक हाथ पर फेफड़े के प्रवाह और दूसरी तरफ एक कम पोस्ट ऑपरेटिव जटिलता दर में वृद्धि हुई। सबसे आम शल्य चिकित्सा के बाद समस्या वजन कम है। 1 सप्ताह में 10% तक वजन घटाने सर्जरी के बाद सभी चूहों में होता है, शायद कम सेवन के कारण पहले कुछ दिनों सर्जरी के बाद। चूहे, euthanized हैं जब वजन घटाने के 1 सप्ताह में 15% से अधिक के रूप में इस अस्वस्थ होने का एक संकेत माना जाता है। तरल चाउ सर्जरी के बाद पहले सप्ताह में खिला सुधार कर सकते हैं। दुर्लभ पश्चात की जटिलताओं हिंद पैर पक्षाघात और आंत्र ischemia, जो भी इच्छामृत्यु में परिणाम कर रहे हैं। कुल में, चूहों के कम से कम 5% postoperatively euthanized किया जाना था।

कैथीटेराइजेशन। कैथीटेराइजेशन प्रोटोकॉल के दौरान महत्वपूर्ण कदम संज्ञाहरण के विनियमन के साथ शुरू करते हैं। संज्ञाहरण की गहराई के रूप में संभव के रूप में कम से कम होना चाहिए (1.5 - इस प्रोटोकॉल में 2% isoflurane), संवेदनाहारी गहराई में वृद्धि विशेष रूप से सही निलय विफलता के साथ चूहों में, सही निलय और फेफड़े के धमनी के दबाव को कम करने के रूप में प्रकट होता है। माप becom की प्रवृत्ति हैई अविश्वसनीय जब प्रोटोकॉल की अवधि में 20 मिनट से अधिक है।

अगले महत्वपूर्ण कदम आर.वी. में और मुख्य फेफड़े के धमनी में कैथेटर का हेरफेर है। यह चुनौतीपूर्ण हो सकता है। कैथेटर निस्तब्धता जब टिप आर.वी. trabeculae में फंस गया है वक्र करने के लिए बहिर्वाह पथ में कैथेटर की मदद कर सकते हैं। जोड़-तोड़ में ही आर.वी. dyskinesia, जो बिस्तर पर नजर रखने पर अनियमित दबाव घटता से पता चलता पैदा कर सकता है। सही वेंट्रिकल में कैथेटर की शुरूआत और फेफड़े के धमनी को सुचारू रूप से चलाना चाहिए। टिप फेफड़े के वाल्व पर अटक जाता है, जब एक प्रतिरोध महसूस किया है। इस प्रतिरोध के माध्यम से दबाने टूटना करने के लिए पल्मोनरी वाल्व, जो बाद में माप की विश्वसनीयता की सीमा हो सकती है।

वर्तमान प्रोटोकॉल में, चूहों कैथीटेराइजेशन प्रक्रिया के बाद बलिदान कर रहे हैं। सिद्धांत रूप में, हालांकि, गले नस और शल्य घाव के बाद कैथेटर बाहर निकाला जाता है, बंद किया जा सकता जानवरों ही साथ रह सकते हैं के रूप मेंगले नस छोड़ शेष।

Morphometry। संवहनी दीवार मोटाई और रोड़ा स्कोर के आकलन में, सबसे महत्वपूर्ण कदम लोचदार laminae की पहचान है। अनुभव से, यह अंत करने के लिए सफलता की संभावना एक अच्छी तरह से भेदभाव कर Verhoeff या Elastica वैन Gieson धुंधला के साथ सबसे बड़ा है। लुमेन आमतौर पर intima से आसानी से पहचाना जा सकता है (आंतरिक नाड़ी क्षेत्र को मापने के लिए), adventitia से मीडिया का गौरव (बाहरी नाड़ी क्षेत्र को मापने के लिए) एक करीब देखो आवश्यकता हो सकती है। कुछ प्रोटोकॉल के उपाय intimal और अलग से औसत दर्जे का मोटाई, लुमेन और आंतरिक लोचदार पटल, और आंतरिक और बाहरी लोचदार पटल के बीच परत के रूप में मीडिया के बीच परत के रूप में परिभाषित intima। यह प्रारंभिक अवस्था एमसीटी + प्रवाह पीएएच में आम तौर पर संभव है। हालांकि, उन्नत रोग में धमनियों, विशेष रूप से neointimal घावों, कई लोचदार laminae प्रदर्शित कर सकता है और अक्सर लोचदार laminae की अखंडता को खोना (

फायदे और एक उत्प्रेरक के रूप में प्रवाह जोड़ने की सीमाएं

बढ़ी हुई फेफड़े के रक्त के प्रवाह के उपयोग चूहों में पीएएच बनाने के लिए कई फायदे हैं, सबसे प्रमुख जा रहा है कि यह एक ज्ञात (patho-) शारीरिक बीमारी के लिए ट्रिगर है, जो मानव पीएएच-सीएचडी (इसेन्मेन्गेर फिजियोलॉजी) में अनुवाद के पक्ष में है, लेकिन यह भी है पीएएच 9 के अन्य रूपों की। मॉडल सुई के आकार बदलती जब एसी-अलग धकेलना बनाने के द्वारा प्रवाह के नियमन के लिए अनुमति देता है।

में हूआदमी पीएएच-सीएचडी, अलग धकेलना के बंद होने की बीमारी के शुरुआती चरण में पीएएच का उत्क्रमण के लिए सीसा, लेकिन उन्नत रोग चरणों में पीएएच की प्रगति के लिए होगा। विवो में धकेलना के बंद होने से एक रोग प्रगति के विभिन्न बिंदुओं पर समय ट्रिगर के हटाने के प्रभाव की जांच करने के लिए और इस तरह के (गैर) पीएएच का उत्क्रमण तंत्र की जांच करने की अनुमति होगी। दुर्भाग्य से, वर्तमान में, अलग धकेलना बंद नहीं मौजूदा मॉडल में संभव है। रक्तसंचारप्रकरण सामान्य बनाने के प्रभावों (जैसे, अतिरिक्त प्रवाह को हटाने और फेफड़े के धमनी दबाव को सामान्य) प्रवाह से जुड़े पीएएच साथ चूहों में प्रभावित बाएं फेफड़े के प्रत्यारोपण द्वारा सामान्य संचलन के साथ एक प्राप्तकर्ता चूहे में जांच की जा सकती है। यह पहले से दिखाया गया है कि रक्तसंचारप्रकरण सामान्य, फेफड़ों प्रत्यारोपण द्वारा चूहों में और मानव में एक हृदय शंट के बंद होने से पीएएच-एच डी, प्रारंभिक अवस्था में औसत दर्जे का अतिवृद्धि के प्रतिगमन पीएएच 21 की ओर जाता है। सामान्य रक्तसंचारप्रकरण का प्रभावप्रयोगात्मक प्रवाह पीएएच के उन्नत चरण में ization वर्तमान में अज्ञात हैं।

वैकल्पिक मॉडल के सम्बंध में महत्व

एकल हिट एमसीटी मॉडल। 60 मिलीग्राम / किग्रा एमसीटी के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन चूहों में फेफड़े के उच्च रक्तचाप के लिए एक मॉडल बनाने के लिए एक सरल और प्रभावी तरीका है। एमसीटी फेफड़े के धमनी endothelial सेल चोट, फेफड़े धमनियों 5 की पेशी परत की अतिवृद्धि के द्वारा पीछा लाती है। हालांकि सटीक तंत्र अस्पष्ट रहते हैं, विभिन्न रास्ते और विकास के कारकों की पहचान की गई है कि एमसीटी निम्नलिखित औसत दर्जे का अतिवृद्धि में भाग लेते हैं। इन रास्ते पर दवा हस्तक्षेप अक्सर सफलतापूर्वक एमसीटी-चूहों में औसत दर्जे का अतिवृद्धि और mPAP कम हो गया है। हालांकि, एमसीटी-चूहों 16 में अनायास रिवर्स करने के बाद से औसत दर्जे का अतिवृद्धि एक प्राकृतिक मनुष्यों 3 में रिवर्स करने की प्रवृत्ति है के लिए जाना जाता है और यह भी वर्णित किया गया है, इन उपचार का असरगंभीर रूप से उनका आकलन किया जाना चाहिए।

डबल-मारा एमसीटी + प्रवाह मॉडल। बढ़ी हुई फेफड़े के रक्त के अलावा 7 दिन प्रवाह के बाद एमसीटी इंजेक्शन गंभीर रूप से एक विशेषता समय पर निर्भर फैशन में (नाड़ी) phenotype बदल। MF14 पर (7 दिन बढ़ा प्रवाह के शामिल होने के बाद), सामान्य रूप से गैर-muscularized वाहिकाओं एक पेशी औसत दर्जे का परत को विकसित करने के लिए शुरू करते हैं। MF21 में औसत दर्जे का मोटाई बढ़ जाती है और पहली neointimal घावों होते हैं। MF28 पर, एक neointimal परत जहाजों के बहुमत में विकसित किया गया है। MF28 और MF35 के बीच, सबसे चूहों सही दिल की विफलता के विकास और इसकी sequellae के मर जाते हैं। एमसीटी + प्रवाह चूहों में पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एमसीटी के लिए प्रवाह के अलावा जीन के विशिष्ट समूहों के सक्रियण की ओर जाता है। कुछ समूहों में, प्रवाह प्रभाव एमसीटी से प्रेरित विरोध किया; दूसरों में, इन प्रभावों को बढ़ाया प्रवाह, और एक क्लस्टर जीन है कि विशेष रूप से थे प्रवाह 17 के बाद विनियमित निहित। उन प्रवाह विशेष जीनों में से एक हैजल्दी विकास प्रतिक्रिया -1 जीन 14 (EGR -1)। Egr -1 के प्रारंभिक निषेध एमसीटी + प्रवाह चूहों 18 में पीएएच का क्षीणन और neointimal गठन में हुई। Egr -1 भी मानव पीएएच (PAH-सीएचडी और अज्ञातहेतुक पीएएच) 19 में neointimal remodeling के साथ जुड़े थे। इन टिप्पणियों का सबूत है कि वृद्धि हुई है या परेशान फेफड़े के रक्त के प्रवाह neointimal गठन के लिए एक अनिवार्य ट्रिगर है में जोड़ें।

एकल मारा प्रवाह केवल मॉडल। एमसीटी इंजेक्शन के बिना एक aorto-Caval अलग धकेलना के साथ चूहों में, फेफड़े के उच्च रक्तचाप (mPAP> 25 एमएमएचजी) अलग धकेलना प्रेरण 20 के बाद 10 और 20 सप्ताह के बीच विकसित करता है। 20 हफ्तों में, फेफड़े संवहनी ऊतक विज्ञान पूर्व कोष्ठकी धमनियों की औसत दर्जे का अतिवृद्धि और इंट्रा-कोष्ठकी धमनियों की नव-muscularization का प्रभुत्व है। कुछ neointimal घावों भी इस मॉडल 20 में वर्णित किया गया है हालांकि, इन घावों के विकास टी की जरूरत है ओ की पुष्टि की और मात्रा निर्धारित किया।

Sugen-हाइपोक्सिया मॉडल। neointimal घावों के साथ पीएएच के लिए एक अन्य आम मॉडल Sugen5416-हाइपोक्सिया (SuHx) चूहा है। Sugen5416 ब्लॉकों संवहनी endothelial वृद्धि कारक (VEGF) रिसेप्टर। यह endothelial सेल नुकसान और एक संकेत झरना है कि, हाइपोक्सिया के साथ संयोजन में, उदाहरण भी देते हैं endothelial apoptosis और प्रसार 22 लाती है। Sugen5416 इंजेक्शन के बाद, चूहा 4 सप्ताह, जिस पर पीएएच विकसित करने के लिए एक hypoxic कक्ष में रखा गया है। चूहे तो 4 सप्ताह के लिए normoxia को फिर से सामने आ रहा है। औषधीय यौगिकों कि लक्ष्य endothelial apoptosis-प्रतिरोध या TGF-बी और बीएमपी के cascades संकेत यह मॉडल 23, 24, 25 में neointimal घावों को उल्टा करने के लिए संभावित दिखाया है। SuHx मॉडल का एक नया संस्करण Sugen-pneumectomy मॉडल है, जो भी neointimal घावों के साथ गंभीर पीएएच में यह परिणाम है > 26। हालांकि, इस मॉडल को पूरी तरह से अभी तक नहीं बताया गया है। चूहों में पीएच प्रेरित करने के लिए एक उपन्यास आनुवंशिक विधि बीएमपी रिसेप्टर -2 जीन है, जो महत्वपूर्ण muscularization (पीएच) में परिणामों में एक उत्परिवर्तन, लेकिन कोई neointimal गठन (PAH), 27 शामिल है।

तुलनीय परिणाम neointimal घावों की संख्या और इलाज SuHx और एमसीटी + प्रवाह चूहों 28 के अंत चरण में ल्यूमिनल रोड़ा की डिग्री के बारे में सूचना दी गई है। दोनों मॉडलों के बीच मुख्य अंतर 1) कर रहे हैं कि एमसीटी में mPAP + प्रवाह उत्तरोत्तर बढ़ जाती है, जबकि SuHx में, mPAP normoxia 28 को फिर से प्रदर्शन के बाद धीरे-धीरे कम दिखाया गया है; 2) है कि एमसीटी + प्रवाह मॉडल एक प्रारंभिक चरण रोग, औसत दर्जे का अतिवृद्धि और endothelial रोग की विशेषता जानता है; 3) उस समय यह एक अंत मंच (एमसीटी + प्रवाह में 4 सप्ताह, SuHx में 8 सप्ताह) जहां सही निलय विफलता विकसित करने के लिए शुरू होता है तक पहुँचने के लिए दोनों मॉडलों लेता हैएफई "> 28 अलग है, और 4) Sugen5416 एक आणविक मार्ग (VEGF) पीएएच के रोगजनन में जिनकी भूमिका अभी स्पष्ट नहीं है कि यह मानव में हस्तक्षेप करने के लिए पीएएच अनुवाद में बाधा हो सकती।।

भविष्य के अनुप्रयोगों या दिशा-निर्देश

एमसीटी + प्रवाह मॉडल के अलग बीमारी के चरण एक 1) रोग प्रगति के तंत्र का परीक्षण करने की अनुमति (मानव ऊतक सामान्य में पोस्टमार्टम या explant प्रक्रियाओं) और 2) परीक्षण करने के लिए विभिन्न रणनीतियों में हस्तक्षेप से ही उपलब्ध है। एक निवारक रणनीति अलग धकेलना (MF7) के निर्माण पर शुरू किया जा सकता है। एक प्रारंभिक हस्तक्षेप MF14 पर शुरू किया जा सकता है। यह एक उपचार रणनीति एक जन्मजात हृदय अलग धकेलना और संबद्ध पीएएच कि प्रतिवर्ती और अपरिवर्तनीय रोग के बीच ग्रे क्षेत्र में प्रगति की है के साथ बच्चों में बंद होने से पहले अलग धकेलना के रूप में प्रासंगिक हो सकता है। उलटा रणनीतियों MF21 या MF28 पर शुरू किया जा सकता है। बाद में दोनों neointimal घावों, अंत मंच पीएएच की एक मिसाल दिखाने के चरणों। </ P>

अंत में, चूहों में एमसीटी के लिए बढ़ा फेफड़े के प्रवाह के अलावा प्रगतिशील और गंभीर पीएएच का एक मॉडल है कि मानव रोग के विकास mimics बनाता है। सही दिल कैथीटेराइजेशन और नाड़ी ऊतकविकृतिविज्ञानी के गुणात्मक और मात्रात्मक आकलन पीएएच के लिए इस में रोग के लक्षण वर्णन की आधारशिला और अन्य मॉडल के रूप में।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Shunt Surgery
Sterile surgical gloves
Duratears Eye ointment Alcon 10380
Chloride-Hexidine
Cotton swabs
Histoacryllic tissue glue B. Braun Medical 1050052
Silkam 5-0 sutures black non-resorbable B. Braun Medical F1134027
Safil 4-0 sutures violet resorbable B. Braun Medical
18 G needle Luer NN1838R BD tip bent in 45 degrees orifice to the outside
Gauzes 10 x 10 cm Paul Hartmann 407825
Temgesic Buprenorphine RB Pharmaceuticals 5429 subcutaneous injection
Sodium Chloride 0.9%
Ventilation mask Rat
Scalple blade
Biemer clamp 18 mm, 5 mm opening  AgnTho 64-562
Heat mat
Kocher Clamp
Shaving machine
Microscope Leica
Right Heart Catheterization
Sterile surgical gloves
Eye ointment Duratears
Chloride-Hexidine
Cotton swabs
Gauzes 10 x 10 cm Paul Hartmann 407825
Silkam 5-0 sutures black non-resorbable B. Braun Medical F1134027
Needle 20 G Luer Tip slightly bent to the inside
Cannula 20 G Luer to introduce catheter, tip pre-formed in 20 degrees
Silastic Catheter 15 cm long 0.5 mm ball 2 mm from tip
Pressure transducer Ailtech
Bedside monitor Cardiocap/5 Datex-Ohmeda
Shaving machine
10 mL Syringe
Sodium Chloride 0.9% for flushing
Vascular Morphology
50 mL Syringe
4% Formaldehyde
18 G cannula with tube
Verhoef staining kit Sigma-Aldrich HT254 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en&region=US
Digital slide scanner Hamamatsu C9600
ImageJ
Elastic (Connective Tissue Stain)  Abcam ab150667 http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html
http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoeper, M. M., Bogaard, H. J., Condliffe, R., et al. Definitions and diagnosis of pulmonary hypertension. J Am Coll Cardiol. 62, D42-D50 (2013).
  2. Stacher, E., Graham, B. B., Hunt, J. M., et al. Modern age pathology of pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 186 (3), 261-272 (2012).
  3. Levy, M., Maurey, C., Celermajer, D. S., et al. Impaired apoptosis of pulmonary endothelial cells is associated with intimal proliferation and irreversibility of pulmonary hypertension in congenital heart disease. J Am Coll Cardiol. 49 (7), 803-810 (2007).
  4. Sakao, S., Tatsumi, K., Voelkel, N. F. Reversible or irreversible remodeling in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (6), 629-634 (2010).
  5. Gomez-Arroyo, J. G., Farkas, L., Alhussaini, A. A., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (4), L363-L369 (2012).
  6. Jones, J. E. Serial noninvasive assessment of progressive pulmonary hypertension in a rat model. Am J Physiol - Heart Circ Physiol. 283 (1), 364-371 (2002).
  7. Hoffman, J. I., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Pulmonary vascular disease with congenital heart lesions: Pathologic features and causes. Circulation. 64 (5), 873-877 (1981).
  8. van Albada, M. E., Berger, R. M. Pulmonary arterial hypertension in congenital cardiac disease--the need for refinement of the evian-venice classification. Cardiol Young. 18 (1), 10-17 (2008).
  9. Dickinson, M. G., Bartelds, B., Borgdorff, M. A., Berger, R. M. The role of disturbed blood flow in the development of pulmonary arterial hypertension: Lessons from preclinical animal models. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 305 (1), L1-L14 (2013).
  10. Garcia, R., Diebold, S. Simple, rapid, and effective method of producing aortocaval shunts in the rat. Cardiovasc Res. 24 (5), 430-432 (1990).
  11. Okada, K., Tanaka, Y., Bernstein, M., Zhang, W., Patterson, G. A., Botney, M. D. Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury. A neointimal model of pulmonary hypertension. Am J Pathol. 151 (4), 1019-1025 (1997).
  12. van Albada, M. E., Schoemaker, R. G., Kemna, M. S., Cromme-Dijkhuis, A. H., van Veghel, R., Berger, R. M. The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension. Eur Respir J. 26 (3), 487-493 (2005).
  13. Brittain, E. Echocardiographic assessment of the right heart in mice. JVis Exp. (e81), (2013).
  14. Dickinson, M. G., Bartelds, B., Molema, G., et al. Egr-1 expression during neointimal development in flow-associated pulmonary hypertension. Am J Pathol. 179 (5), 2199-2209 (2011).
  15. Borgdorff, M. A., Bartelds, B., Dickinson, M. G., Steendijk, P., de Vroomen, M., Berger, R. M. Distinct loading conditions reveal various patterns of right ventricular adaptation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (3), H354-H364 (2013).
  16. Ruiter, G., de Man, F. S., Schalij, I., et al. Reversibility of the monocrotaline pulmonary hypertension rat model. Eur Respir J. 42 (2), 553-556 (2013).
  17. van Albada, M. E., Bartelds, B., Wijnberg, H., et al. Gene expression profile in flow-associated pulmonary arterial hypertension with neointimal lesions. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (4), L483-L491 (2010).
  18. Dickinson, M. G., Kowalski, P. S., Bartelds, B., et al. A critical role for egr-1 during vascular remodelling in pulmonary arterial hypertension. Cardiovasc Res. 103 (4), 573-584 (2014).
  19. van der Feen, D. E., Dickinson, M. G., Bartelds, M. G., et al. Egr-1 identifies neointimal remodeling and relates to progression in human pulmonary arterial hypertension. Jheart lung transplant. 35 (4), 481-490 (2016).
  20. Rungatscher, A. Chronic overcirculation-induced pulmonary arterial hypertension in aorto-caval shunt. Microvasc Res. 94, 73-79 (2014).
  21. O'Blenes, S. B., Fischer, S., McIntyre, B., Keshavjee, S., Rabinovitch, M. Hemodynamic unloading leads to regression of pulmonary vascular disease in rats. J Thorac Cardiovasc Surg. 121 (2), 279-289 (2001).
  22. Sakao, S., Taraseviciene-Stewart, L., Lee, J. D., Wood, K., Cool, C. D., Voelkel, N. F. Initial apoptosis is followed by increased proliferation of apoptosis-resistant endothelial cells. FASEB J. 19 (9), 1178-1180 (2005).
  23. Spiekerkoetter, E. FK506 activates BMPR2, rescues endothelial dysfunction, and reverses pulmonary hypertension. J Clin Invest. 123 (8), 3600-3613 (2013).
  24. Nickel, N. P., Spiekerkoetter, E., Gu, M., et al. Elafin reverses pulmonary hypertension via caveolin-1-dependent bone morphogenetic protein signaling. Am J Respir Crit Care Med. 191 (11), 1273-1286 (2015).
  25. Meloche, J., Potus, F., Vaillancourt, M., et al. Bromodomain-containing protein 4: The epigenetic origin of pulmonary arterial hypertension. Circ Res. 117 (6), 525-535 (2015).
  26. Happé, C. M. Pneumonectomy combined with SU5416 induces severe pulmonary hypertension in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 310 (11), L1088-L1097 (2016).
  27. Ranchoux, B., Antigny, F., Rucker-Martin, C., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).
  28. de Raaf, M. A. SuHx rat model: Partly reversible pulmonary hypertension and progressive intima obstruction. Eur Respy J. 44 (1), 160-168 (2014).
  29. Elastic (Connective Tissue Stain) Instructions for Use. , Available from: http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf (1506).

Tags

चिकित्सा अंक 120 पल्मोनरी धमनी उच्च रक्तचाप चूहे मॉडल बढ़ फेफड़े के प्रवाह aorto-Caval अलग धकेलना / फिस्टुला सही दिल कैथीटेराइजेशन नाड़ी आकृति विज्ञान
शंट सर्जरी, सही दिल कैथीटेराइजेशन, और संवहनी Morphometry एक चूहे मॉडल में प्रवाह प्रेरित पल्मोनरी धमनी उच्च रक्तचाप के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van der Feen, D. E., Weij, M.,… More

van der Feen, D. E., Weij, M., Smit-van Oosten, A., Jorna, L. M., Hagdorn, Q. A. J., Bartelds, B., Berger, R. M. F. Shunt Surgery, Right Heart Catheterization, and Vascular Morphometry in a Rat Model for Flow-induced Pulmonary Arterial Hypertension. J. Vis. Exp. (120), e55065, doi:10.3791/55065 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter