Summary
我々は、LC-MS / MSシステムを使用して共調節相互作用タンパク質の精製のための方法を確立しました。
Introduction
タンパク質 - タンパク質相互作用は、多くの生物学的機能において重要な役割を果たしています。このように、これらの相互作用は、シグナル伝達に関与しています。細胞膜を横切るタンパク質輸送;細胞代謝; DNA複製、DNA損傷修復、組換え、および転写1、2、3、4を含む、いくつかの核プロセス。これらの相互作用に関与するタンパク質を同定することは、これらの細胞プロセスの理解を進めることが重要です。
免疫沈降（IP）は、タンパク質 - タンパク質相互作用を分析するために使用される検証技法です。共免疫沈降したタンパク質の同定を容易にするために、質量分析がしばしば利用されて5、6、7、8、9。抗体とタンパク質複合体の既知のメンバーを標的とすることにより、タンパク質複合体を単離するために、続いて質量分析を介して、その未知の成分を同定することが可能です。 ARIP4（アンドロゲン受容体相互作用タンパク質4）、転写補調節因子は、文脈に依存した方法9、10でその標的プロモーターを活性化または抑制するために、核内受容体タンパク質と相互作用します。より良いこれらの核因子を支配する転写調節機構を理解するために、我々は、精製し、LC-MS / MSシステムを使用してARIP4相互作用するタンパク質を同定するための包括的方法を記載しています。
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Protocol
1.トランスフェクション
- 100 mmの培養プレートでHEK293細胞を播種（2×10 6細胞/皿）。培養10％ウシ胎児血清、100μg/ mlのストレプトマイシン、および100単位/ mlのペニシリンを補充したダルベッコ改変イーグル培地中の細胞。 5％CO 2、37℃の加湿インキュベーター中で細胞をインキュベートします。
- 翌日、製造業者の指示11に従ってトランスフェクション試薬を40μlを用いて、FLAGタグ付きARIP4プラスミド10μgの細胞をトランスフェクト。
2.タンパク質抽出
- 約36時間のトランスフェクション後、氷冷PBSで細胞を洗浄し、スクレーパーを用いて細胞を採取します。 1.5 mltubeに細胞を移し、4℃で2分間、8,000×gで、それを遠心します。吸引した上清と5倍に細胞ペレットを再懸濁し、0.4MのKClバッファーのペレット体積（高塩緩衝液：20mMのトリスHCl（pH8.0）、0.4 MのKCl、5mMのMgCl 2、10％グリセロール、0.1％NP-40、10mMのB -メルカプトエタノール、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）。 4℃で20分間、混合物を回転させます。
- 4℃で10分間、17,700×gでチューブを遠心。
- 新しい2 mLのチューブに上清（全細胞抽出物）を転送し、3×0 MのKCl緩衝液（希釈緩衝液の初期容量追加：20mMのトリス-HCl（pH8.0）に、5mMのMgCl 2、10％グリセロール、 0.1％NP-40、10mMのβメルカプトエタノール、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）。
- 別の遠心分離（4℃で10分間、17,700×gで）を実行し、新しい2 mlチューブに上清（全細胞抽出物）を転送。
3.免疫沈降
- 遠心分離（2.4）中、0.1MのKCl緩衝液（低塩緩衝液で2回洗浄し、続いてPBSで抗FLAGビーズ、0.1 Mグリシン - 塩酸、次いで1 Mトリス塩酸、50μlの洗浄：20mMのトリスを塩酸液（pH 8.0）、0.1 MのKCl、5mMのMgCl 2を、10％グリセロール、0.1％NP-40 10 m個Mβ-メルカプトエタノール、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）。この洗浄工程の遠心分離を4℃で1分間、2,000×gで行われます。
- 全細胞抽出物でFLAGビーズの50μLを混合し、穏やかに2-4°C（全細胞抽出物を1％ステップ2.4からは、将来の使用のために-80℃で維持されるべきで4時間混合物を回転させます）を入力として。
- マイクロスピンカラム（重力落下）にサンプルを転送します。 （入力フロースルーウェスタンブロット分析を使用して、両方のタンパク質レベルをチェック）、1.5mlチューブにフロースルーを保つ液体窒素を用いて凍結し、-80℃で保管します。
- FLAGビーズ（重力落下）を洗浄するために、0.1MのKCl緩衝液（低塩緩衝液）の1ミリリットルを追加します。
- 3.4少なくとも4回（5回の洗浄の合計のための）手順を繰り返し。
4.溶出
- それは1分間2,000×gで1.5ミリリットルチューブと遠心分離機に列を配置します。ビーズが乾燥します。
- の底部キャップ列。
- 0.1 Mグリシン-HCl（pH2.5）の（FLAGビーズの容積に等しい）50μLを加えます。
- 穏やかに室温で10分間混合物を振ります。
- 新しい1.5 mlチューブにカラムを置き、1分間2000×gでそれを遠心します。
- 溶出した溶液を1 Mトリス-HCl（pH8.0）10μlので中和します。ピペッティングによりまたは渦機を用いてよく混ぜます。
5.アルキル化し、トリプシン処理
- 混合物（112μlの総容量）に100mMのNH 4 HCO 350μlの、CH 3 CN10μlの、及びジチオスレイトールの2μLを加えます。
- 56℃で30分間、試料をインキュベートします。
- 10分間、室温でサンプルを配置します。
- ヨードアセトアミドサンプルに333 mMと10μlを添加して、37℃で30分間、暗所でそれをインキュベートします。
- 混合物にトリプシン10μlの（33 ngの/μl）を加え、37℃で一晩静置します。
- 一晩のトリプシン処理後、LC-MS / MS機能または分析12のためにサードパーティの質量分析研究所に、最終製品を輸送します。
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Representative Results
私たちは、160 KDaの周りに、強いARIP4信号を識別し、同様にモックサンプル制御および他のいくつかの未知のタンパク質（ 図1）のもの。 LC-MS / MS分析は、FLAGビーズ（ 表1）の画分内ARIP4複合ペプチド及び潜在的なペプチド補因子の両方を同定しました。 P62（Sequestosome1）、既知ARIP4補因子11は、このシステム11の有効性を確認する、分析（ 表1）において同定されました。また、ARIP4と対話する他の多くの以前に報告されているタンパク質を同定しました。このようにして、SUMO2 10とDryK 13は、LC-MS / MS分析によって検出しました。 ARIP4ペプチドはまた、IPは、高品質であったことを示唆してLC-MS / MS分析を用いて同定しました。全体として、LC-MS / MS技術は、未知の核イベントのリンクを識別するために使用できる強力なツールでありますタンパク質 - タンパク質相互作用に編。完全な質量分析の結果は、リクエストに応じて利用できるようになります。
図1：ARIP4複合体の精製。 FLAGエピトープタグARIP4（ARIP4-F）の銀染色は、FLAG特異的抗体を用いてHEK293細胞および免疫沈降において発現しました。精製されたタンパク質は、ゲル電気泳動を用いて分離し、銀染色で可視化しました。コントロールとして、モック精製は、外因性タンパク質を発現しないHEK293細胞で行いました。分子量標準が左側に示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1：Identificatio新規ARIP4結合タンパク質のN。精製されたタンパク質複合体に結合したFLAGビーズはトリプシンベースの消化により分離しました。これらのタンパク質は、続いてLC-MS / MS分析を用いて同定しました。 LC-MS / MSデータは、スイスProtデータベースとMASCOTソフトウェアを用いて分析しました。ペプチドの数およびこれらのタンパク質の同一性が示されています。重要なMASCOTスコア（P <0.05）とのタンパク質のみを選択しました。
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Discussion
効率的なトランスフェクションは、このプロトコルで成功した結果を得ることが不可欠です。したがって、我々は免疫沈降FLAGタグ付きタンパク質レベルを決定するために、ウェスタンブロット分析を使用することをお勧めします。このステップでは、IPが正常に実行されたこと、また、興味のあるタンパク質が適切に過剰発現していることを確認し、することができます。 FLAG標識タンパク質レベルはまた、質量分析の前にチェックする必要があります。
モックサンプルは、偽陽性の結果を得ることを避けるために、真の相互作用から背景を区別するため、陰性対照として使用されるべきです。ヒトタンパク質を研究するときにまた、実験では、汚染を避けるために、比較的クリーンな環境（ 例えば、クリーンルーム）で行われるべきです。高塩濃度（0.3〜0.4 M）を有するタンパク質抽出緩衝液は、時折核タンパク質を抽出するために使用することができるが、0.1〜0.15 Mの塩濃度を有するIP緩衝液は、最もあり10お勧めします。これは、IP手順は、タンパク質 - タンパク質相互作用を中断することなく続行することができます。さらに、バックグラウンド信号を最小にするために、磁気ビーズは、精製工程のために使用することができます。偽陽性の結果を減少させるために細胞溶解条件を最適化することも重要です。
他の技術に関連して、本研究に記載された方法の重要性（ゲル中で、例えば、消化系の単一タンパク質の同定）5、10、11は 、ユーザがハイスループット同定のためにLC-MS / MS分析を実行することを可能にすることです核補因子とその結合パートナーとの間のタンパク質相互作用の。転写後遺伝子調節は、配列特異的DNA結合タンパク質の協力に大きく依存します。したがって、転写因子は、多くの場合、標的遺伝子の発現を変化させるために補助因子の多数と相互作用します。目優れた標的タンパク質活性が最も重要である促進する転写パートナーを識別し、これらの転写のメカニズムを支配する細胞事象を理解するerefore、。我々の方法は、ユーザーがすぐに興味のそれらの転写因子を介して推定される核補因子を特定することを可能にし、さらに、転写調節機構の理解を高めます。
FLAGペプチドはまた、溶出プロセス中の0.1 Mグリシン-HCl液（pH 2.5）の代わりに使用することができます。本変形例を採用する場合は、FLAGペプチドを希釈するために使用される緩衝液のpHは、モニターされるべきです。 3X FLAGペプチドはまた、FLAGビーズからタンパク質を溶出するために使用されるべきです。従って、比較的高いpHを有する溶液は、これらの修正された条件の下でFLAGペプチドを希釈するために使用されるべきです。適切なタンパク質 - タンパク質相互作用を維持するために、サンプルを繰り返し凍結融解を回避することも重要です。
T ">とき、トリプシン処理プロセスの最適化は、タンパク質相互作用のスクリーニングの結果の精度を高めるために必要とされ得る。LC-MS / MS法は、核との間の相互作用を同定するために使用することができるツールであるがタンパク質、その限界の一つは、タンパク質複合体の組み立てに関する正確な詳細を提供しないことである。複合体の安定性を向上させるために、化学処理を架橋14を使用することができる。別の方法としては、キャピラリー電気泳動、MS / MSにも有用である15 。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x) | nacalai tesque | 03969-21 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Micro Bio-Spin Columns | BIO-RAD | 732-6204 |
References
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