Ett protein framställningsmetod för hög kapacitet Identifiering av proteiner interagerar med en kärnteknisk Cofactor Använda LC-MS / MS-analys

Summary

Vi har etablerat en metod för rening av samregleringssystem interaktionsproteiner med hjälp av LC-MS / MS-systemet.

Introduction

Protein-proteininteraktioner spelar en viktig roll i många biologiska funktioner. Som sådana har dessa interaktioner varit inblandade i signaltransduktion; transportprotein över cellmembran; cellernas ämnesomsättning; och flera kärnprocesser, inklusive DNA-replikation, DNA-skador reparation, rekombination, och transkription ^{ett, två, tre, fyra.} Identifiera proteiner som är inblandade i dessa interaktioner är därför avgörande för att öka kunskaperna om dessa cellulära processer.

Immunoprecipitation (UP) är en validerad metod som används för att analysera proteinproteininteraktioner. För att underlätta identifieringen av co-immunoprecipiterade proteiner är masspektrometri används ofta ^{5, 6, 7, 8,9.} Genom att rikta en känd medlem av ett proteinkomplex med en antikropp, är det möjligt att isolera den proteinkomplexet och att därefter identifiera dess okända komponenter via masspektrometrianalys. ARIP4 (androgenreceptorn-interagerande protein 4), en transkriptions coregulator, interagerar med nukleära receptorproteiner för att aktivera eller undertrycka sitt mål initiativtagare i en situationsberoende sätt ^{9, 10.} För att bättre förstå de transkriptionsreglerande mekanismer som styr dessa nukleära faktorer, beskriver vi en omfattande metod för att rena och identifiera ARIP4 interagerar proteiner med hjälp av LC-MS / MS-systemet.

Protocol

1. Transfektion

1. Seed HEK293-celler i 100-mm odlingsplattor (2 x 10 ⁶ celler / skål). Odla cellerna i Dulbeccos modifierade Eagles medium kompletterat med 10% fetalt kalvserum, 100 | ig / ml streptomycin och 100 enheter / ml penicillin. Inkubera cellerna i en fuktad inkubator vid 5% _CO2 och 37 ° C.
2. Nästa dag, transfektera cellerna med 10 ^ g av FLAG-märkt ARIP4 plasmid med användning 40 pl transfektionsreagens enligt tillverkarens anvisningar ^11.

2. Protein Extraction

1. Approximativt 36 h efter transfektion, tvätta cellerna med iskall PBS och skörda cellerna med hjälp av en skrapa. Överföra celler i en 1,5 mltube och centrifugera den vid 8000 xg under 2 minuter vid 4 ° C. Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 5x pelleten volym av 0,4 M KCl-buffert (buffert med hög salthalt: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,4 M KCl, 5 mM _MgCl2, 10% glycerol, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, 1x proteasinhibitorcocktail). Rotera blandningen i 20 min vid 4 ° C.
2. Centrifugera röret vid 17.700 xg under 10 min vid 4 ° C.
3. Överför supernatanten (hel-cellextrakt) till en ny två-ml rör och till 3x den ursprungliga volymen av 0 M KCl-buffert (Utspädningsbuffert: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM _MgCl2, 10% glycerol, 0,1% NP-40, 10 mM β merkaptoetanol, 1x proteasinhibitorcocktail).
4. Utföra en annan centrifugering (17.700 xg i 10 min vid 4 ° C) och överför supernatanten (helcellextrakt) i ett annat 2 ml rör.

3. Immunfällning

1. Under centrifugering (2,4), tvätta 50 pl av anti-FLAG pärlor med PBS, 0,1 M glycin-hydroklorid, och sedan en M Tris-hydroklorid, följt av tvättning två gånger med 0,1 M KCl-buffert (buffert med låg salthalt: 20 mM Tris- HCl (pH 8,0), 0,1 m KCl, 5 mM MgCl2, 10% glycerol, 0,1% NP-40, 10 mM B-merkaptoetanol, 1x proteasinhibitorcocktail). Centrifugeringen för denna tvättprocess utförs vid 2000 xg i 1 min vid 4 ° C.
2. Blanda 50 pl FLAG pärlor med extrakten helcells-och rotera försiktigt blandningen under 4 timmar vid 2-4 ° C (1% av hela cellextrakt från steg 2,4 bör också hållas vid -80 ° C för framtida bruk som en insignal).
3. Överföra provet till en mikrospinnkolonn (gravitations droppe). Hålla genomströmning i ett 1,5 ml rör, frysa den med hjälp av flytande kväve och förvara den vid -80 ° C (kontrollera proteinnivåer hos både den ingående och genomströmning genom att använda Western blot-analys).
4. Tillsätt 1 ml 0,1 M KCl-buffert (buffert med låg salthalt) att tvätta FLAG-pärlor (gravitation släpp).
5. Upprepa steg 3,4 åtminstone fyra gånger (för totalt fem tvättar).

4. Eluering

1. Placera kolonnen i ett 1,5 ml rör och centrifugera den vid 2000 x g under 1 min; pärlorna kommer att torka.
2. Cap botten avkolonnen.
3. Tillsätt 50 | il (lika med volymen av FLAG pärlor) av 0,1 M glycin-HCl (pH 2,5).
4. Skaka försiktigt av blandningen under 10 min vid rumstemperatur.
5. Placera kolonnen in i ett nytt 1,5 ml rör och centrifugera den vid 2000 xg i 1 min.
6. Den eluerade lösningen neutraliserades med 10 | il av 1 M Tris-HCl (pH 8,0), blanda väl genom pipettering eller genom användning av en virvelmaskin.

5. Alkylering och Trypsinering

1. Tillsätt 50 | il av 100 mM _{NH4 HCO3,} 10 ^ il av _CH3CN, och 2 pl av ditiotreitol till blandningen (112 | j, l total volym).
2. Inkubera provet under 30 min vid 56 ° C.
3. Placera provet vid rumstemperatur under 10 min.
4. Tillsätt 10 | il av 333 mM jodacetamid till provet och inkubera det i mörker under 30 min vid 37 ° C.
5. Tillsätt 10 | il trypsin (33 ng / | il) till blandningen och inkubera över natten vid 37 ° C.

1. Efter natten trypsinisering, transportera slutprodukten till en LC-MS / MS faciliteten eller en tredje part masspektrometri labb för analys ^12.

Representative Results

Vi identifierade en stark ARIP4 signal, cirka 160 KDa, såväl som de hos en mock kontrollprov och flera andra okända proteiner (Figur 1). LC-MS / MS-analys identifierat både ARIP4 komplexa peptider och de potentiella peptid kofaktorer inom den del av FLAG pärlor (tabell 1). p62 (Sequestosome1), var en känd ARIP4 cofaktor ¹¹ identifierats i analysen (tabell 1), vilket bekräftar effekten av detta system ^11. Vi identifierade också många andra tidigare rapporterade proteiner som interagerar med ARIP4. På detta sätt, var Sumo2 ¹⁰ och DryK ¹³ detekteras via LC-MS / MS analys. ARIP4 peptider också identifieras med användning av LC-MS / MS-analys, vilket tyder på att IP var av hög kvalitet. Totalt sett är LC-MS / MS-tekniken ett kraftfullt verktyg som kan användas för att identifiera okända kärn händelser länked till protein-proteininteraktioner. Full masspektrometriska resultat kommer att finnas tillgängliga på begäran.

Figur 1: Rening av ARIP4 Anläggningar. Silverfärgning av FLAG epitop-märkt ARIP4 (ARIP4-F) uttryckt i HEK293-celler och immunoutfällning med flagg specifik antikropp. Renade proteiner löstes med användning av gelelektrofores och visualiserades med silverfärgning. Som kontroll framställdes en mock rening utfördes på HEK293-celler som inte uttrycker exogena proteiner. Molekylviktsstandarder visas till vänster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: Identification av Novel ARIP4 bindande proteiner. FLAG pärlor bundna till renade proteinkomplex dissocierades genom trypsin-baserade digestion. Dessa proteiner därefter identifieras med användning av LC-MS / MS-analys. LC-MS / MS-data analyserades med användning av Swiss-Prot-databasen och MASCOT programvara. Antalet peptider och identiteten av dessa proteiner är visade. Endast proteiner med betydande MASCOT resultaten (p <0,05) valdes ut.

Discussion

Effektiv transfektion är viktigt att få ett lyckat resultat med detta protokoll. Följaktligen rekommenderar vi användning av Western blot-analys för att bestämma de immunoprecipiterade FLAG-märkt proteinnivåer. Detta steg gör det möjligt för användare att kontrollera att deras proteinet av intresse är korrekt överuttryckt och dessutom att IP utfördes framgångsrikt. bör också kontrolleras FLAG-taggade proteinnivåer före analysen masspektrometri.

Ett mock prov bör användas som en negativ kontroll för att undvika att erhålla ett falskt positivt resultat och att diskriminera bakgrunden från sanna interaktioner. Dessutom när man studerar humana proteiner, experiment bör utföras i en relativt ren miljö (t.ex. ett renrum) för att undvika kontaminering. Även om en protein extraktionsbuffert med en hög saltkoncentration (0,3-0,4 M) kan ibland användas för att extrahera nukleära proteiner, är de flesta av en IP-buffert med en 0,1-0,15 M saltkoncentrationtio rekommenderas. Detta gör det möjligt för IP-proceduren att gå vidare utan att störa protein-proteininteraktioner. För att ytterligare minska bakgrundssignalen, kan magnetiska kulor användas för reningsprocessen. Det är också viktigt för att optimera cell-lys förhållandena i syfte att minska falska positiva resultat.

Betydelsen av den metod som beskrivs i denna studie med avseende på andra tekniker (t.ex. i gel digestion baserade enda proteinidentifiering) ^{5, 10, 11} är att det tillåter användare att utföra LC-MS / MS-analys för hög genomströmning identifiering proteininteraktioner mellan kärn kofaktorer och deras bindningspartners. Transkriptionell genreglering är i hög grad beroende av samarbete av sekvensspecifika DNA-bindande proteiner. Följaktligen transkriptionsfaktorer interagerar ofta med ett stort antal kofaktorer att ändra mål-genuttryck. th erefore, för att bättre förstå de cellulära händelser som reglerar dessa transkriptionsmekanismer, identifiera transkriptions partner som främjar målproteinet aktivitet är av största vikt. Vår metod gör det möjligt för användare att snabbt identifiera förmodade kärnvapen kofaktorer via deras transkriptionsfaktor av intresse och ökar ytterligare vår förståelse av transkriptionsregleringsmekanismer.

FLAG-peptiden kan också användas i stället för en 0,1 M glycin-HCl-lösning (pH 2,5) under eluering processen. Men om denna modifiering användes, pH-värdet hos den buffert som används för att späda de FLAG-peptider bör övervakas. 3x FLAG-peptider bör också användas för att eluera proteinerna från flagg pärlor. Därför bör en lösning med ett relativt högt pH användas för att späda ut FLAG-peptider under dessa ändrade villkoren. Det är också viktigt att undvika upprepad frysning och upptining av proverna i syfte att upprätthålla de rätta protein-proteininteraktioner.

t "> Ibland optimering av trypsinisering processen kan också krävas för att förbättra noggrannheten hos resultatet av proteininteraktioner screening. Även om LC-MS / MS-metoden är ett verktyg som kan användas för att identifiera samspelet mellan kärn proteiner, är en av dess begränsningar att det inte ge exakta detaljer avseende monteringen av proteinkomplexet. för att förstärka komplexstabilitet, kemisk tvärbindningsbehandlingar kan användas ^14. som en alternativ metod, är kapillärelektrofores-MS / MS också användbara ¹⁵ .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	11668019
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x)	nacalai tesque	03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220
Micro Bio-Spin Columns	BIO-RAD	732-6204