En Protein Forberedelse metode for High-throughput identifisering av proteiner samspill med et kjernefysisk kofaktor Bruke LC-MS / MS-analyse

Summary

Vi har etablert en metode for rensing av coregulatory interaksjons proteiner ved anvendelse av LC-MS / MS-system.

Introduction

Protein-protein-interaksjoner spiller en viktig rolle i mange biologiske funksjoner. Som sådan, har disse interaksjoner vært innblandet i signaltransduksjon; protein transport over cellemembraner; celle metabolisme; og flere nukleære prosesser, blant annet DNA-replikasjon, DNA-skade reparasjon, rekombinasjon, og transkripsjon ^{1, 2, 3, 4.} Identifisere proteiner som er involvert i disse interaksjonene er derfor avgjørende for å fremme vår forståelse av disse cellulære prosesser.

Immunoutfelling (IP) er et validert teknikk som brukes til å analysere protein-protein-interaksjoner. For å lette identifiseringen av ko-immunopresipitert proteiner, blir massespektrometri ofte benyttet ^{5, 6, 7, 8,9.} Ved å målrette et kjent medlem av et proteinkompleks med et antistoff, er det mulig å isolere proteinkomplekset og deretter å identifisere de ukjente komponentene via massespektrometri-analyse. ARIP4 (androgen reseptor-samspill protein 4), en transkripsjons coregulator, samhandler med atom reseptor proteiner for å aktivere eller undertrykke sine mål arrangører i en kontekstavhengig måte ^{9, 10.} For bedre å forstå de transkripsjonsregulerende mekanismer som styrer disse nukleære faktorer, beskriver vi en omfattende fremgangsmåte for å rense og identifisere ARIP4 samspill proteiner ved hjelp av LC-MS / MS-system.

Protocol

1. Transfeksjon

1. Seed HEK293 celler i 100 mm-kultur plater (2 x 10 ⁶ celler / parabol). Kultur ble cellene i Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplementert med 10% føtalt kalveserum, 100 ug / ml streptomycin, og 100 enheter / ml penicillin. Cellene inkuberes i en fuktig inkubator med _5% CO2 og 37 ° C.
2. Neste dag, transfektere cellene med 10 mikrogram av FLAG-merket ARIP4 plasmid bruker 40 ul transfeksjon reagens i henhold til produsentens anvisninger ^11.

2. Protein Extraction

1. Omtrent 36 timer etter transfeksjon, vask cellene med iskald PBS og høste cellene ved hjelp av en skrape. Overfør cellene inn i en 1,5 mltube og sentrifuge det ved 8000 xg i 2 min ved 4 ° C. Aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes i 5x pelleten volum av 0,4 M KCl-buffer (høy saltbuffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,4 M KCl, 5 mM _MgCl2, 10% glycerol, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, 1x protease inhibitor cocktail). Rotere av blandingen i 20 minutter ved 4 ° C.
2. Sentrifuger røret ved 17 700 xg i 10 min ved 4 ° C.
3. Overfør supernatanten (hel-celleekstrakt) i et nytt 2-ml rør og tilsett 3 ganger utgangsvolumet fra 0 M KCl-buffer (fortynningsbuffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM _MgCl2, 10% glycerol, 0,1% NP-40, 10 mM β-merkaptoetanol, 1x protease inhibitor cocktail).
4. Utføre en annen sentrifugering (17 700 xg i 10 minutter ved 4 ° C) og overføre den overliggende væske (hele celleekstrakt) i et nytt 2 ml rør.

3. Immunpresipitasjon

1. Under sentrifugering (2,4), vask 50 ul av anti-FLAG perler med PBS, 0,1 M glycin-hydroklorid, og deretter ble 1 M Tris-hydroklorid, etterfulgt av vasking to ganger med 0,1 M KCl-buffer (lav saltbuffer: 20 mM Tris- HCl (pH 8,0), 0,1 m KCl, 5 mM MgCl2, 10% glycerol, 0,1% NP-40, 10 mM b-Mercaptoethanol, 1x proteasehemmer cocktail). Den sentrifugering i denne vaskeprosessen utføres ved 2.000 x g i 1 min ved 4 ° C.
2. Bland 50 ul av FLAG perler med hel-celle-ekstrakter og forsiktig rotere blandingen i 4 timer ved 2-4 ° C (1% av det hel-celle-ekstraktet fra trinn 2.4 bør også holdes ved -80 ° C for fremtidig bruk som en inngang).
3. Overføre prøven til et mikro-spinnkolonne (tyngdekraft dråpe). Hold gjennomstrømning i et 1,5 ml rør, fryses ved hjelp av flytende nitrogen, og lagre det ved -80 ° C (sjekk protein nivåer av både inngangs- og gjennomstrømning ved hjelp av Western blot-analyse).
4. Tilsett 1 ml 0,1 M KCl buffer (lav salt buffer) for å vaske flagget perler (gravitasjon slipp).
5. Gjenta trinn 3.4 minst fire ganger (for totalt fem vaskinger).

4. Elution

1. Plasser kolonne i et 1,5 ml rør og sentrifuge det ved 2000 xg i 1 min; perlene vil tørke.
2. Cap bunnen avkolonnen.
3. Tilsett 50 ul (lik volumet av FLAG perler) av 0,1 M glycin-HCl (pH 2,5).
4. Rist blandingen i 10 minutter ved romtemperatur.
5. Plasser kolonne inn i et nytt 1,5 ml rør og sentrifuge det ved 2000 x g i 1 min.
6. Den eluerte oppløsningen nøytraliseres med 10 ul av 1 M Tris-HCl (pH 8,0); Bland godt ved å pipettere eller ved hjelp av en vortex maskin.

5. Alkylering og trypsinering

1. Tilsett 50 pl av 100 mM NH ₄ HCO _3, 10 pl _CH3CN, og 2 ul av ditiotreitol til blandingen (112 pl totalt volum).
2. Inkuber prøven i 30 minutter ved 56 ° C.
3. Plasser prøven ved romtemperatur i 10 min.
4. Tilsett 10 ul 333 mM jodacetamid til prøven og inkuber den i mørket i 30 minutter ved 37 ° C.
5. Tilsett 10 ul trypsin (33 ng / mL) til blandingen, og inkuber det over natten ved 37 ° C.

1. Etter over natten trypsinering, transportere det endelige produktet til en LC-MS / MS-anlegget eller til en tredjepart massespektrometri laboratorium for analyse ^12.

Representative Results

Vi identifiserte en sterk ARIP4 signal, rundt 160 kDa, så vel som de av en uekte prøve kontroll og flere andre ukjente proteiner (figur 1). LC-MS / MS-analyse er identifisert både ARIP4 komplekse peptider og de potensielle peptid kofaktorer innenfor brøkdel av FLAG kuler (tabell 1). p62 (Sequestosome1), ble en kjent ARIP4 kofaktor ¹¹ identifisert i analysen (tabell 1), som bekrefter virkningen av dette system ^11. Vi identifiserte også mange andre tidligere rapportert proteiner som samhandler med ARIP4. På denne måte ble Sumo2 ¹⁰ og DryK ¹³ detektert via LC-MS / MS-analyse. ARIP4 peptider ble også identifisert ved anvendelse av LC-MS / MS-analyse, noe som antyder at IP var av høy kvalitet. Totalt sett er LC-MS / MS teknikk et kraftig verktøy som kan brukes til å identifisere ukjent atomhendelser lenkeed til protein-protein interaksjoner. Full massespektrometri Resultatene vil være tilgjengelig på forespørsel.

Figur 1: Rensing av ARIP4 komplekser. Silver farging av FLAG epitop-merket ARIP4 (ARIP4-F) uttrykt i HEK293 celler og immunoprecipitation med en FLAG-spesifikt antistoff. Rensede proteiner ble oppløst ved anvendelse av gel elektroforese og visualisert med en sølvfarge. Som en kontroll ble en uekte rensing utført på HEK293-celler som ikke uttrykker eksogene proteiner. Molekylvekt standarder er vist til venstre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: Identification av Novel ARIP4 bindende proteiner. FLAG perler bundet til rensede proteinkomplekser ble dissosiert ved trypsin-baserte fordøyelsen. Disse proteiner ble deretter identifisert ved anvendelse av LC-MS / MS-analyse. LC-MS / MS-data ble analysert ved anvendelse av Swiss-Prot-databasen og MASCOT programvare. Antallet peptider og identiteten til disse proteinene er vist. Bare proteiner med betydelige maskot score (p <0,05) ble valgt.

Discussion

Effektiv transfeksjon er avgjørende for å oppnå et vellykket resultat med denne protokoll. Derfor anbefaler vi at du bruker Western blot analyse for å fastslå de immunoutfelt FLAG-tagget protein nivåer. Dette trinnet gjør det mulig å verifisere at deres protein av interesse er riktig uttrykt, og dessuten at IP er vellykket gjennomført. FLAG-merket protein nivåer bør også sjekkes før massespektrometri analyse.

En mock prøven bør brukes som en negativ kontroll for å unngå å få et falskt positivt resultat, og for å diskriminere på bakgrunn av sanne interaksjoner. Dessuten, når man vil studere humane proteiner, forsøk bør utføres i et forholdsvis rent miljø (f.eks, et rent rom) for å unngå forurensning. Selv om en proteinekstraksjon buffer med høy saltkonsentrasjon (0,3-0,4 M) kan av og til anvendes for å trekke ut kjerneproteiner, en IP-buffer med en 0,1 til 0,15 M saltkonsentrasjon er de flesteti anbefales. Dette gjør at IP måten for å fortsette uten å forstyrre protein-protein interaksjoner. For ytterligere å minimalisere bakgrunnssignalet, kan magnetiske kuler brukes for renseprosessen. Det er også viktig for å optimalisere cellelyse betingelsene for å redusere falske positive resultater.

Betydningen av den metode som er beskrevet i denne studie med hensyn til andre teknikker (for eksempel i gel fordøyelse baserte enkelt protein identifikasjon) ^{5, 10, 11} er at den tillater brukere å utføre LC-MS / MS-analyse for high-throughput identifisering av protein interaksjoner mellom atom kofaktorer og deres bindingspartnere. Transkripsjonen genregulering er svært avhengig av samarbeidet av sekvensspesifikke DNA-bindende proteiner. Følgelig transkripsjonsfaktorer ofte samvirke med et stort antall ko-faktorer for å endre mål genekspresjon. th erefore, for bedre å forstå de cellulære hendelser som styrer disse transkripsjonsmekanismer, identifiserer transkripsjons partnere som fremmer målet protein aktivitet er viktig. Vår metode gjør at brukerne raskt identifisere mulige atom kofaktorer via deres transkripsjon faktor av interesse og ytterligere forbedrer vår forståelse av transkripsjonsregulerende mekanismer.

FLAG-peptid kan også brukes i stedet for en 0,1 M glycin-HCl-løsning (pH 2,5) under eluering prosessen. Imidlertid, hvis denne modifikasjon anvendes, pH-verdien til bufferen anvendt til å fortynne flagget peptider bør overvåkes. 3x FLAG peptider bør også brukes til å eluere proteiner fra flagget perler. Følgelig bør en løsning med en relativt høy pH-verdi anvendes for å fortynne flagget peptidene under disse endrede betingelser. Det er også viktig for å unngå gjentatt frysing og tining av prøvene for å kunne opprettholde de riktige protein-protein-interaksjoner.

t "> Av og til optimalisering av trypsinering prosessen kan også være nødvendig for å øke nøyaktigheten av resultatene av proteininteraksjon screening. Selv om LC-MS / MS-metoden er et verktøy som kan brukes til å identifisere interaksjonene mellom atom proteiner, er en av dens begrensninger at den ikke gir nøyaktige detaljer vedrørende monteringen av proteinkomplekset. for å forbedre kompleksstabilitet, kjemisk tverrbindingsbehandlinger kan brukes ^14. som en alternativ metode, er kapillær elektroforese-MS / MS også anvendelige ¹⁵ .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	11668019
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x)	nacalai tesque	03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220
Micro Bio-Spin Columns	BIO-RAD	732-6204