Summary
Мы установили способ очистки coregulatory взаимодействия белков с использованием системы LC-MS / MS.
Introduction
Белок-белковые взаимодействия играют важную роль во многих биологических функций. Таким образом, эти взаимодействия участвуют в сигнальной трансдукции; транспортирование белка через клеточные мембраны; клеточный метаболизм; и несколько ядерных процессов, включая репликацию ДНК, ремонт повреждений ДНК, рекомбинации и транскрипции 1, 2, 3, 4. Идентификация белков, участвующих в этих взаимодействиях Поэтому крайне важно, чтобы углубления нашего понимания этих клеточных процессов.
Иммунопреципитации (IP) является утвержденным метод, используемый для анализа белок-белковых взаимодействий. Для того , чтобы облегчить идентификацию коинтегри- иммунопреципитации белков, масс - спектрометрия часто используется 5, 6, 7, 8,9. Нацеливаясь известный член белкового комплекса с антителом, можно выделить белковый комплекс и впоследствии определить его неизвестные компоненты с помощью масс-спектрометрического анализа. ARIP4 (андроген рецептор-взаимодействующий 4), транскрипционный coregulator, взаимодействует с белками ядерных рецепторов, чтобы активировать или репрессировать своих целевых промоторов в контекстно-зависимой манере 9, 10. Для того, чтобы лучше понять транскрипционные регуляторные механизмы, регулирующие эти ядерные факторы, мы описываем комплексный метод для очистки и идентификации ARIP4 взаимодействующих белков, используя систему LC-MS / MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Трансфекция
- Семенной клеток НЕК293 в культуральные планшеты 100-мм (2 х 10 6 клеток / чашку). Культуры клеток в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, 100 мкг / мл стрептомицина и 100 ед / мл пенициллина. Инкубируйте клетки в увлажненном инкубаторе при 5% CO 2 и 37 ° С.
- На следующий день трансфекции клеток с 10 мкг FLAG-меченый ARIP4 плазмиды с использованием 40 мкл реагента для трансфекции в соответствии с инструкциями изготовителя 11.
2. Белок экстракции
- Около 36 ч после трансфекции, промыть клетки с ледяным PBS и урожай клеток с помощью скребка. Передача клеток в 1,5 mltube и центрифугируйте при 8000 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. Аспирата супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 5х объем гранул 0,4 М KCl буфера (буфер с высоким содержанием соли: 20 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 0,4 М KCl,, 5 мМ MgCl 2, 10% глицерина, 0,1% NP-40, 10 мМ B-mercaptethanol, 1x ингибитор протеазы коктейль). Поворотом смесь в течение 20 мин при 4 ° С.
- Центрифуга трубки на 17700 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
- Передача супернатант (поклеточного экстракт) на новую 2-мл пробирку и добавляют 3 - кратный начальный объем 0 М KCl буфера (Буфер для разведения: 20 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 5 мМ MgCl 2, 10% глицерина, 0,1% NP-40, 10 мМ β-меркаптоэтанол, 1x ингибитор протеазы коктейль).
- Выполните еще один центрифугировани (17700 х г в течение 10 мин при 4 ° С) и передать надосадочной жидкости (экстракта цельных клеток) в новую 2 мл пробирку.
3. иммунопреципитация
- Во время центрифугирования (2.4), моют 50 мкл анти-FLAG бусинок с PBS, 0,1 М глицин-гидрохлорида, а затем 1 М Трис-гидрохлорида, с последующим промыванием дважды с помощью 0,1М KCl буфера (низкосолевой буфер: 20 мМ трис HCl (рН 8,0), 0,1 м KCl, 5 мМ MgCl2, 10% глицерина, 0,1% NP-40, 10 мМ б-меркаптоэтанол, 1x ингибитор протеазы коктейль). Центрифугирование для этого в процессе промывки проводят при 2000 х г в течение 1 мин при температуре 4 ° С.
- Смешайте 50 мкл FLAG бусинок с экстрактами целых клеток и осторожно повернуть смесь в течение 4 ч при температуре 2-4 ° С (1% экстракта цельноклеточной со стадии 2.4, также следует хранить при -80 ° С для последующего использования в качестве входных данных).
- Передача образца в микро ротационную колонку (сила тяжести капли). Держите Проточный в 1,5 мл пробирку, заморозить ее с помощью жидкого азота, и хранить его при температуре -80 ° С (проверьте уровни белка обоих входных и проточные, используя Вестерн-блот-анализ).
- Добавить 1 мл 0,1 М KCl буфера (буфера с низким содержанием соли), чтобы вымыть флаге шарики (сила тяжести капли).
- Повторите шаг 3.4 по крайней мере, еще четыре раза (в общей сложности пять стирок).
4. Элюирование
- Поместите колонку в 1,5 мл пробирку и центрифугируют ее при 2000 х г в течение 1 мин; шарики высохнут.
- Закрывают дноколонка.
- Добавить 50 мкл (равный объему флаговых гранул) 0,1 М глицин-HCl (рН 2,5).
- Слегка встряхните смесь в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Поместите колонку в новую 1,5 мл пробирку и центрифугируют ее при 2000 х г в течение 1 мин.
- Элюированные раствор нейтрализуют 10 мкл 1 М Трис-HCl (рН 8,0); хорошо перемешать с помощью пипетки или с помощью вихревой машины.
5. Алкилирование и трипсином
- Добавляют 50 мкл 100 мМ NH 4 HCO 3, 10 мкл CH 3 CN, и 2 мкл дитиотреитола к смеси (112 мкл общего объема).
- Инкубируйте образца в течение 30 мин при 56 ° C.
- Поместите образец при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Добавляют 10 мкл 333 мМ иодацетамида к образцу и инкубировать в темноте в течение 30 мин при 37 ° С.
- Добавьте 10 мкл трипсина (33 нг / мкл) в смеси и инкубировать ее в течение ночи при 37 ° С.
- После ночи трипсином, транспортировки готового продукта к LC-MS / MS объекта или сторонних масс - спектрометрического лаборатории для анализа 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы определили сильный ARIP4 сигнал, около 160 кДа, а также те из макете контроля образца и ряда других неизвестных белков (рисунок 1). Анализ ЖХ-МС / МС идентифицировали обе ARIP4 сложные пептиды , и потенциальные пептидные кофакторов внутри фракции флаговых шариков (таблица 1). P62 (Sequestosome1), известный ARIP4 кофактором 11 был идентифицирован в анализе (таблица 1), что подтверждает эффективность этой системы 11. Мы также определили многие другие ранее сообщенных белки, которые взаимодействуют с ARIP4. Таким образом, Sumo2 10 и DryK 13 были обнаружены с помощью анализа ЖХ-МС / МС. пептиды ARIP4 также были идентифицированы с помощью анализа LC-MS / MS, что говорит о том, что IP-было высокого качества. В целом, метод LC-MS / MS является мощным инструментом, который может быть использован для идентификации неизвестных событий ссылку ядернойе изд для белок-белковых взаимодействий. Полные результаты масс-спектрометрии будут доступны по запросу.
Рисунок 1: Очистка ARIP4 комплексов. Серебряное окрашивание FLAG эпитоп-меченого ARIP4 (ARIP4-F) экспрессируется в клетках HEK293 и иммунопреципитации с антителом FLAG-специфичны. Очищенные белки разделяли с помощью гель-электрофореза и визуализировали с серебром. В качестве контроля, насмешка очистку проводили на клетках НЕК293, которые не экспрессируют экзогенные белки. Молекулярные стандарты веса показаны на левой стороне. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1: Identificatioп Роман ARIP4 связывающих белков. FLAG шарики, связанные с очищенными белковыми комплексами, подвергали диссоциации трипсином на основе пищеварения. Эти белки были впоследствии идентифицированы с использованием анализа ЖХ-МС / МС. Данные ЖХ-МС / МС анализировали с использованием базы данных Swiss-Prot и программное обеспечение талисманом. Количество пептидов и идентичность этих белков показаны. были выбраны только белки с талисманом значимые счеты (р <0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эффективное трансфекция имеет важное значение для получения успешного результата с этим протоколом. Соответственно, мы рекомендуем использовать вестерн-блот анализ для определения Иммунопреципитированные FLAG-меченого уровни белка. Этот шаг позволяет пользователям проверить, что их интерес белок правильно гиперэкспрессия и, кроме того, что IP была выполнена успешно. FLAG-меченый уровни белка также должны быть проверены до масс-спектрометрического анализа.
Макет образец должен быть использован в качестве отрицательного контроля, чтобы избежать получения ложного положительного результата и дискриминировать фон от истинных взаимодействий. Кроме того, при изучении человеческих белков, эксперименты должны быть выполнены в относительно чистой окружающей среде (например, чистая комната) , чтобы избежать загрязнения. Хотя буфер экстракции белка с высокой концентрацией соли (0,3-0,4 М) может быть иногда используется для экстракции ядерных белков, буфер IP с концентрацией 0,1-0,15 М соли является большинстводесять рекомендуется. Это позволяет процедуре IP действовать, не нарушая белок-белковых взаимодействий. Для того, чтобы еще больше минимизировать фоновый сигнал, магнитные шарики могут быть использованы для процесса очистки. Кроме того, важно, чтобы оптимизировать условия для лизиса клеток с целью сокращения ложных положительных результатов.
Значение метода , описанного в данном исследовании , по отношению к другим методам (например, в виде геля переваривания на основе один знак идентификации белка) 5, 10, 11 является то , что она позволяет пользователям выполнять ЖХ-МС анализ / MS для идентификации с высокой пропускной способностью белковых взаимодействий между ядерными кофакторов и их партнерами по связыванию. Регуляция транскрипции генов сильно зависит от сотрудничества белков связывания ДНК последовательности специфических. Соответственно, факторы транскрипции часто взаимодействуют с большим количеством сопутствующих факторов для изменения экспрессии гена-мишени. Th erefore, чтобы лучше понять клеточные события, регулирующие эти транскрипционные механизмы, идентифицирующие транскрипционных партнеров, которые способствуют активности белка мишени имеет первостепенное значение. Наш метод позволяет пользователям быстро идентифицировать предполагаемые ядерные кофакторы через их транскрипции фактора интереса и еще более усиливает наше понимание транскрипционных регуляторных механизмов.
ФЛАГ пептид также может быть использован вместо 0,1 М раствора глицин-HCl (рН 2,5) в течение процесса элюирования. Тем не менее, если эта модификация используется, рН буфера, используемого для разбавления флаге пептиды должны контролироваться. 3x FLAG пептиды также должны быть использованы для элюирования белков из флаге бусинок. Соответственно, раствор с относительно высоким рН следует использовать для разбавления флаге пептидов в соответствии с этими измененными условиями. Очень важно также, чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания образцов с целью поддержания надлежащего белок-белковых взаимодействий.
т "> По случаю, оптимизация процесса обработки трипсином также может потребоваться для повышения точности результатов скрининга белкового взаимодействия. Хотя метод ЖХ-МС / МС является инструментом, который может быть использован для идентификации взаимодействие между ядерной белки, один из его ограничений является то , что она не дает точных деталей относительно сборки белкового комплекса. Для повышения устойчивости комплексов, химического сшивания лечения можно использовать 14. в качестве альтернативного метода, капиллярный электрофорез-МС / МС также полезно 15 ,Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x) | nacalai tesque | 03969-21 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Micro Bio-Spin Columns | BIO-RAD | 732-6204 |
References
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807 (2010).
- Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification of protein interactions involved in cellular signaling. Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).
- MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).
- Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers. Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).
- Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).
- Shi, Y., et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).
- Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).
- Huang, B. X., Kim, H. Y. Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), 61430 (2013).
- ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide. Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).
- Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1. Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).
- Tsuchiya, M., et al. Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation. Sci.Rep. 5, 14498 (2015).
- Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads. Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).
- Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4. Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).
- Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes. Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).
- Fonslow, B. R., Yates, J. R. Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis. J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).
