Summary
Nous avons établi un procédé pour la purification des protéines d'interaction co-régulation utilisant le système LC-MS / MS.
Introduction
interactions protéine-protéine jouent un rôle important dans de nombreuses fonctions biologiques. Par conséquent, ces interactions ont été impliquées dans la transduction du signal; le transport de protéines à travers les membranes cellulaires; le métabolisme cellulaire; et plusieurs processus nucléaires, y compris la replication de l' ADN, la réparation des dommages de l' ADN, la recombinaison et la transcription 1, 2, 3, 4. L'identification des protéines impliquées dans ces interactions est par conséquent essentiel de faire progresser notre compréhension de ces processus cellulaires.
Immunoprécipitation (IP) est une technique utilisée pour valider l'analyse des interactions protéine-protéine. Afin de faciliter l'identification des protéines co-immunoprécipitation, la spectrométrie de masse est souvent utilisée 5, 6, 7, 8,9. En ciblant un élément connu d'un complexe protéique avec un anticorps, il est possible d'isoler le complexe de protéines et d'identifier ensuite les composants inconnus par analyse par spectrométrie de masse. ARIP4 (protéine androgène-récepteur coopérant 4), un co - régulateur de la transcription, interagit avec les protéines de récepteurs nucléaires, afin d'activer ou de réprimer les promoteurs cibles d'une manière dépendante du contexte 9, 10. Pour mieux comprendre les mécanismes de régulation de transcription qui régissent ces facteurs nucléaires, nous décrivons une méthode complète pour purifier et identifier les protéines qui interagissent ARIP4 en utilisant le système LC-MS / MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. transfection
- Ensemencer des cellules HEK293 dans des plaques de culture à 100 mm (2 x 10 6 cellules / boîte). La culture des cellules dans un milieu de Eagle modifié par Dulbecco supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal, 100 ug / ml de streptomycine et de 100 unités / ml de pénicilline. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 5% de CO 2 et 37 ° C.
- Le lendemain, transfecter les cellules avec 10 pg de étiquetée FLAG ARIP4 plasmide en utilisant 40 ul de réactif de transfection selon les instructions du fabricant 11.
2. Extraction des protéines
- Environ 36 heures après la transfection, laver les cellules avec du PBS glacé et récolter les cellules en utilisant un grattoir. Transférer les cellules dans un 1,5 mltube et centrifuger à 8000 xg pendant 2 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 5x le volume du culot de tampon KCl 0,4 M (tampon salin élevé: 20 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 0,4 M de KCl, 5 mM de MgCl2, 10% de glycerol, 0,1% de NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, 1 x cocktail inhibiteur de protease). Tourner le mélange pendant 20 min à 4 ° C.
- Centrifuger le tube à 17.700 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Transférer le surnageant (extrait de cellules entières) dans un nouveau tube de 2 ml et ajouter 3 fois le volume initial de tampon 0 M de KCl (tampon de dilution: 20 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM de MgCl2, 10% de glycerol, 0,1% de NP-40, 10 mM β-mercaptoéthanol, 1x inhibiteur de la protéase cocktail).
- Effectuer une nouvelle centrifugation (17 700 g pendant 10 min à 4 ° C) et transférer le surnageant (extrait de cellules entières) dans un nouveau tube de 2 ml.
3. Immunoprécipitation
- Au cours de la centrifugation (2,4), laver 50 ul de billes anti-FLAG avec du PBS, 0,1 M de glycine-chlorhydrate, puis 1 M de Tris-chlorhydrate, suivie par deux lavages avec un tampon 0,1 M KCl (tampon faible teneur en sel: 20 mM de Tris- HCl (pH 8,0), 0,1 m de KCl, MgCl2 5 mM, glycerol à 10%, 0,1% de NP-40 à 10 mM b-mercaptoéthanol, 1x inhibiteur de la protéase cocktail). La centrifugation pour ce processus de lavage est effectué à 2000 xg pendant 1 min à 4 ° C.
- Mélanger 50 pi de perles de FLAG avec les extraits de cellules entières et faire tourner doucement le mélange pendant 4 heures à 2-4 ° C (1% de l'extrait de cellules entières de l'étape 2.4 devrait également être conservé à -80 ° C pour une utilisation ultérieure comme entrée).
- Transférer l'échantillon à une colonne de centrifugation micro (chute de poids). Gardez l'écoulement dans un tube de 1,5 ml, congeler en utilisant de l'azote liquide, et le stocker à -80 ° C (vérifier les niveaux de l'entrée et écoulement en utilisant une analyse Western blot de protéines).
- Ajouter 1 ml de tampon 0,1 M KCl (tampon pauvre en sel) pour laver les perles de FLAG (chute de gravité).
- Répétez l'étape 3.4 au moins quatre fois (pour un total de cinq lavages).
4. Elution
- Placer la colonne dans un tube de 1,5 ml et centrifuger à 2000 g pendant 1 min; les perles vont sécher.
- Boucher le fond dela colonne.
- Ajouter 50 ul (égal au volume de billes FLAG) de 0,1 M de glycine-HCl (pH 2,5).
- Secouer doucement le mélange pendant 10 min à température ambiante.
- Placer la colonne dans un nouveau tube de 1,5 ml et centrifuger à 2000 g pendant 1 min.
- La solution éluée est neutralisée avec 10 pl de 1 M de Tris-HCl (pH 8,0); bien mélanger par pipetage ou en utilisant une machine à vortex.
5. L'alkylation et trypsinisation
- Ajouter 50 ul de 100 mM de NH 4 HCO 3, 10 pi de CH3CN et 2 pl de dithiothréitol au mélange (112 ul de volume total).
- Incuber l'échantillon pendant 30 minutes à 56 ° C.
- Placer l'échantillon à la température ambiante pendant 10 min.
- Ajouter 10 ul de 333 mM d'iodoacétamide à l'échantillon et incuber dans l'obscurité pendant 30 min à 37 ° C.
- Ajouter 10 pi de trypsine (33 ng / ul) au mélange, et incuber pendant une nuit à 37 ° C.
- Après trypsinisation durant la nuit, le transport du produit final à une LC-MS / MS installation ou à un tiers laboratoire de spectrométrie de masse pour l' analyse 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nous avons identifié un signal fort de ARIP4, environ 160 kDa, ainsi que ceux d'un contrôle de l' échantillon mock et plusieurs autres protéines inconnues (Figure 1). Analyse LC-MS / MS a identifié deux peptides ARIP4 complexes et les cofacteurs de peptides potentiels dans la fraction de billes de pavillon (tableau 1). p62 (Sequestosome1), un cofacteur ARIP4 connu 11 a été identifié dans l'analyse (tableau 1), ce qui confirme l'efficacité de ce système 11. Nous avons également identifié de nombreuses autres protéines précédemment rapportées qui interagissent avec ARIP4. De cette façon, Sumo2 10 et 13 DryK ont été détectés par l'analyse LC-MS / MS. peptides ARIP4 ont également été identifiés en utilisant l'analyse LC-MS / SP, ce qui suggère que la propriété intellectuelle était de grande qualité. Dans l'ensemble, la technique LC-MS / MS est un outil puissant qui peut être utilisé pour identifier inconnue lien des événements nucléairesée à des interactions protéine-protéine. Résultats complets de spectrométrie de masse seront disponibles sur demande.
Figure 1: Purification de ARIP4 Complexes. coloration à l'argent de l'épitope FLAG étiquetée ARIP4 (ARIP4-F) exprimé dans des cellules HEK293 et immunoprécipitation avec un anticorps spécifique de FLAG. Les protéines purifiées ont été résolus par électrophorèse sur gel et visualisés par une coloration à l'argent. Comme témoin, une purification maquette a été réalisée sur des cellules HEK293 qui n'expriment des protéines exogènes. Les standards de poids moléculaire sont indiqués sur la gauche. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1: identification de Novel ARIP4 protéines de liaison. perles FLAG liés à des complexes protéiques purifiés ont été dissociées par digestion à base de trypsine. Ces protéines ont été ensuite identifiés en utilisant une analyse LC-MS / MS. Les données LC-MS / MS a été analysé en utilisant la base de données Swiss-Prot et le logiciel MASCOT. Le nombre de peptides et de l'identité de ces protéines sont indiquées. Seules les protéines avec des scores significatifs MASCOT (p <0,05) ont été sélectionnés.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
transfection efficace est essentielle pour obtenir un bon résultat avec ce protocole. En conséquence, nous vous recommandons d'utiliser l'analyse Western blot pour déterminer les niveaux de protéine FLAG-tagged immunoprécipitées. Cette étape permet aux utilisateurs de vérifier que leur protéine d'intérêt est correctement surexprimée et, en outre, que l'adresse IP a été réalisée avec succès. les niveaux de protéine étiquetée FLAG doivent également être vérifiés avant l'analyse par spectrométrie de masse.
Un échantillon simulé doit être utilisé comme témoin négatif pour éviter l'obtention d'un résultat faussement positif et de discriminer l'arrière-plan des interactions véritables. En outre, lors de l' étude des protéines humaines, des expériences doivent être réalisées dans un environnement relativement propre (par exemple une salle blanche) afin d' éviter toute contamination. Bien qu'un tampon d'extraction de protéines avec une forte concentration en sel (de 0,3 à 0,4 M) peut être parfois utilisé pour extraire les protéines du noyau, un tampon IP avec une concentration de 0,1 à 0,15 M de sel est le plus souventdix recommandée. Ceci permet à la procédure à suivre IP sans perturber les interactions protéine-protéine. Afin de réduire davantage le signal d'arrière-plan, des billes magnétiques peuvent être utilisées pour le procédé de purification. Il est également important d'optimiser les conditions de lyse des cellules, afin de réduire les résultats faussement positifs.
(Identification basée sur la digestion , par exemple, dans le gel unique de protéine) , l'importance de la méthode décrite dans cette étude par rapport à d' autres techniques 5, 10, 11 est qu'il permet aux utilisateurs d'effectuer une analyse / MS LC-MS pour l'identification à haut débit des interactions entre des protéines nucléaires cofacteurs et leurs partenaires de liaison. la régulation transcriptionnelle du gène est fortement dépendante de la coopération des protéines de liaison d'ADN spécifiques de séquence. En conséquence, les facteurs de transcription interagissent souvent avec un grand nombre de co-facteurs pour modifier l'expression du gène cible. th erefore, pour mieux comprendre les événements cellulaires qui régissent ces mécanismes de transcription, l'identification de partenaires de transcription qui favorisent l'activité de la protéine cible est primordiale. Notre méthode permet aux utilisateurs d'identifier rapidement les cofacteurs nucléaires putatifs via leur facteur de transcription d'intérêt et renforce encore davantage notre compréhension des mécanismes de régulation transcriptionnelle.
Peptide FLAG peut également être utilisé au lieu d'une solution 0,1 M de glycine-HCl (pH 2,5) pendant le processus d'élution. Toutefois, si cette modification est employée, le pH du tampon utilisé pour diluer les peptides FLAG doit être surveillé. 3x peptides FLAG devraient également être utilisés pour éluer les protéines des perles de FLAG. Par conséquent, une solution avec un pH relativement élevé doit être utilisé pour diluer les peptides FLAG dans ces conditions modifiées. Il est également crucial pour éviter le gel et décongélations répétées des échantillons afin de maintenir les interactions protéine-protéine appropriées.
t "> À l'occasion, l'optimisation du processus de trypsine peuvent également être nécessaires pour améliorer la précision des résultats de l'examen de l'interaction de la protéine. Bien que la méthode LC-MS / MS est un outil qui peut être utilisé pour identifier les interactions entre nucléaires protéines, l' une de ses limites est qu'il ne fournit pas de détails précis concernant l'assemblage du complexe protéique. Pour améliorer la stabilité du complexe, réticulation chimique des traitements peut être utilisé 14. Comme une méthode alternative, électrophorèse-MS capillaire / MS est également utile 15 .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x) | nacalai tesque | 03969-21 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Micro Bio-Spin Columns | BIO-RAD | 732-6204 |
References
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807 (2010).
- Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification of protein interactions involved in cellular signaling. Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).
- MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).
- Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers. Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).
- Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).
- Shi, Y., et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).
- Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).
- Huang, B. X., Kim, H. Y. Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), 61430 (2013).
- ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide. Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).
- Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1. Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).
- Tsuchiya, M., et al. Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation. Sci.Rep. 5, 14498 (2015).
- Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads. Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).
- Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4. Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).
- Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes. Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).
- Fonslow, B. R., Yates, J. R. Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis. J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).
