Summary
Это метод для создания 3-мерной клеточной культуры леску от легочной внеклеточного матрикса. Неповрежденными легких перерабатывается в гидрогели, которые могут поддерживать рост клеток в трех измерениях.
Abstract
Здесь мы представляем метод для создания нескольких компонентов гидрогели для культивирования клеток в пробирке клеток легочной культуры. Начиная с здоровой ткани EN блок легкого из свиных, крысы или мыши, ткань перфузию и погружают в последующих химических моющих средств для удаления остатков клеток. Гистологическое сравнение ткани до и после обработки, подтверждает удаление более 95% двухцепочечной ДНК и альфа-галактозидазы окрашивание предполагает, что большинство клеточных остатков удаляется. После того, как decellularization, ткань подвергают лиофилизации, а затем cryomilled в порошок. Порошок матрицы переваривается в течение 48 ч в кислом растворе пепсином и затем нейтрализуют с образованием раствора Прегелем. Гелеобразования раствора Прегелем может быть индуцирована путем инкубации при 37 ° С и может быть использован сразу же после нейтрализации или хранили при 4 ° С в течение до двух недель. Покрытия могут быть сформированы с использованием раствора Прегелем на необработанной пластины для CELL вложение. Клетки могут быть взвешенными в Прегелем до начала самосборки для достижения 3D культуры, высевали на поверхности формованного геля, из которого клетки могут мигрировать через строительные леса, или плакированной на покрытиях. Изменения в стратегии представлены может повлиять на температуру гелеобразования, прочность, или размеры фрагментов белка. За образованием гидрогеля, жесткость гидрогель может быть увеличена с помощью генипин.
Protocol
| Решение | стерильный фильтр | Направления |
| DIH 2 O | да | DIH 2 O; стерильно фильтруют |
| 0,1% Тритон Х-100 Раствор | да | Под вытяжкой добавляют 100 мкл тритона-X 100 раствора до 100 мл DIH 2 O и перемешивают до полного растворения; стерильный фильтр. |
| 2% деоксихолатом Решение | да | Под вытяжкой добавляют 2 г раствора натрия деоксихолатом на 100 мл DIH 2 O и перемешивают до полного растворения; Стерильный фильтр |
| 1 М NaCl | да | Добавить 58,44 г NaCl в 1 л DIH 2 O; перемешивать до растворения; стерильный фильтр |
| ДНКазы решение | да | Добавить 12000единиц ДНКазы до 1 л DIH 2 O; Добавить 0,156 г MgSO 4 (Безводная), и 0,222 г CaCl 2; перемешивать до растворения; стерильный фильтр |
| PBS | да | Комбинат 27,2 г Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (гептагидрата двухосновного), 80 г NaCl и 2 г KCl с 10 л DIH 2 O; перемешивать до растворения; отрегулировать рН до 7,4; стерильный фильтр |
Таблица 1: Решения , необходимые для тканей Decellularization. Сделать решения выше для процесса decellularization. Хранить при температуре 4 ° С. Приблизительно 2,5 л потребуется для одного свиных легких.
1. Гидрогель Формирование
- Свиной Lung Decellularization (адаптировано из ссылок 9,10)
- Получите, собственная блока нормальный свиную легких, от бойни, с сердцем и Vasculature нетронутыми.
- Используйте ножницы ткани или скальпель, чтобы отсечь сердце, резки сосудистую сеть как можно ближе к сердцу, оставаясь васкулатура будет использоваться в последующих стадиях для перфузии.
- Тщательно отсечь соединительной ткани вокруг трахеи, бронхов и сосудистую сеть, используя скальпель или ножницы.
Примечание: Определите лучшее легкое, чтобы использовать для остальной части процедуры, выбирая легкие без больших разрезов или проколов через плевры и большого количества ателектазов или окклюзии сосудов, которые могут препятствовать эффективности процесса decellularization. - Срежьте неоптимальный легкие оставляя как можно больше бронх, прикрепленные к трахее, как возможно (сердца, соединительной ткани и лопастями удаленного легкого могут быть удалены). Там должно быть одно легкое, которые остаются прикрепленными к трахее и сосудистую сеть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните секции для гистологического исследования, если это необходимо. 9 - Закрыть отключенные бронхи с зажимами или швом к рРевент избыток обратного потока.
- Подготовьте decellularization решения и хранить в холодильнике при 4 ° С , пока не понадобится (таблица 1).
- С помощью ручного насоса каннюлирован, чтобы соответствовать легочной артерии, заливать легочной ткани 3 раза дистиллированной водой через обе легочной артерии и трахеи. Заливать сосудистую первый каждый раз. Начинают с около 1 л в сосудистую сеть и 1,5 л в трахею для каждого перфузией, а также продукты распада клеток удаляется больше жидкости может перфузию через систему.
- Заливать как сосудистую и трахеи с Triton раствором X-100.
- Погрузите ткань легкого в Triton растворе X-100 в течение 24 ч при 4 ° С.
- Заливать васкулатура и трахеи 3 раза дистиллированной водой для полоскания.
- Заливать как сосудистую и трахеи с деоксихолата раствором.
- Submerge срезах тканей в дезоксихолате в течение 24 ч при температуре 4 ° С.
- Заливать васкулатура и трахеи 3 раза дистиллированной водой для полоскания.
- Заливать как сосудистую и трахеи с раствором NaCl.
- Погрузите ткань в отфильтрованном растворе NaCl в течение 1 часа при 4 ° С.
- Заливать васкулатура и трахеи 3 раза дистиллированной водой для полоскания.
- Заливать как сосудистую и трахеи с ДНКазы раствором.
- Погрузите ткань в отфильтрованного раствора ДНКазы в течение 1 ч при 4 ° С.
- Заливать как сосудистую и трахею 5 раз PBS.
- Отсечь заметное хрящевой ткани, трахеи и все канальцы 2 мм или больше в диаметре (в основном найдены вокруг рубчика и медиальных отделах легких) от проводящих дыхательных путей, оставляя только дыхательные зоны (в основном периферийные районы).
- Рассеките ткани в 1-дюймовые секций или меньше. Ориентация ткани не имеет значения для этого шага.
- Слить лишнюю жидкость и поместить ткань в 50 мл конические пробирки. Замораживание ткани при температуре -80 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните секции для гистологии, чтобы обеспечить удаление клеток и клеточных Дебрис, при желании. Мы используем H & E, α-галактозидазы, PicoGreen, гидроксипролин, нингидрином, Альциановый синий, SDS-PAGE и масс-спектрометрии, чтобы охарактеризовать. 9
- Обработка легких
- Удалите крышки из замороженных труб, содержащих decellularized легочной ткани.
- Поместите фильтровальную бумагу над отверстием трубки и закрепите резинкой.
Примечание: Трубка и содержимое должно по-прежнему быть заморожены в противном случае поместить в -80 ° C до тех пор, пока заморожен. - Лиофилизации ткани, пока весь избыток жидкости не исчезнет, с использованием сублимационной сушилки в соответствии с инструкциями производителя. Хранить при температуре -80 ° С до готовности к мельнице.
- Перед началом добавления жидкого азота в морозильной камере мельницы для охлаждения и изоляции внутренних компонентов к условиям труда.
- Удалить магнитную мельницы бар из мельницы трубки и добавить ткань для того чтобы покрыть дно.
- Заменить мельницы бар и добавить свободно упакованной ткани. Бар мельница должна по-прежнему свободно перемещаться.
- Закройте трубку мельницы и ПЛАCE в морозильной камере мельницы.
- Заполните жидким азотом до максимальной линии заполнения.
- Морозильник мельница все ткани в мелкий порошок (примерно 5 мин, скорость сдавление ~ 600 мин -1), в поликарбонатного цилиндра с ударника из нержавеющей стали, а также из нержавеющей стали конечными заглушками с использованием морозильной мельницы в соответствии с инструкциями производителя. Хранить при температуре -80 ° С до готовности к использованию.
- Микропористая образование геля (8 мг / мл) (адаптировано из ссылок 9,11)
- Добавить 1% (вес / объем) decellularized порошка и 0,1% (вес / об) пепсина до 0,01 М HCl при постоянном перемешивании (должны быть в состоянии увидеть поток на верхнем уровне жидкости), при комнатной температуре, в течение 48 ч.
Примечание: Порошок статически заряжен, поэтому добавление HCl после того, как порошок дает возможность вымыть избыток от стенок трубы. - После гидролиза в течение 48 часов, поместите раствор и реагенты на льду в течение 5 мин.
- Использование охлажденный 10% (об / об) 0,1 М NaOH, А.Н.г 11,11% (об / об) в 10 раз PBS, (чтобы довести весь раствор до 1х концентрацию), довести переваренной белкового раствора в физиологическом рН 7,4.
Примечание: Решение теперь можно хранить при температуре 4 ° С в течение одной недели. Выполнение кинетики гелеобразования с использованием Реологии 9 при желании.
- Добавить 1% (вес / объем) decellularized порошка и 0,1% (вес / об) пепсина до 0,01 М HCl при постоянном перемешивании (должны быть в состоянии увидеть поток на верхнем уровне жидкости), при комнатной температуре, в течение 48 ч.
2. Сшивка гидрогели для улучшения высокой механической прочностью
- Растворы с концентрацией 1%, 0,1% и 0,01% вес / об раствора сшивающего генипин готовили путем растворения необходимого количества генипин порошка в 10% ДМСО.
- Vortex раствор каждые 15 мин в течение 1 часа.
- Добавить генипин решение для применения ECM гидрогели (100 мкл для каждой лунки 96-луночного планшета), которые ранее были собраны в части 1.3.4.
- Оставьте каждое сообщение ЕСМ гидрогель сшивание в течение 24 ч при 37 ° С.
- Промыть ECM-гидрогелевые 3 раза PBS, пока промывной раствор больше не синий. Сшитые гидрогели будет готово для дальнейшей характеристики и CEисследования LL культуры.
3. Культура клеток с микропористой Gel
- Двумерная покрытие
- Используя решение из 1.3.3, добавить 20 мкл Прегелем раствора в каждую лунку 96-луночного необработанной планшет для тканевых культур.
- Охладить в течение ночи при 4 ° С, чтобы позволить адсорбции белка на пластине.
- Раствор Аспирируйте ПРЕГЕЛЯ и промыть PBS.
- Пассаж клетки 9.
- Добавить 10000 клеток / см 2 в лунки.
- Увеличение средств массовой информации до 100 мкл на лунку и инкубировать при температуре 37 ° C.
- Трехмерная клеточная культура 9
- Использование раствора из 1.3.3, ресуспендируют осажденные клетки до концентрации 1000000 клеток / мл Прегелем раствора.
- Быстро обойтись 16 мкл ПРЕГЕЛЯ-клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета, чтобы сформировать густой гидрогель ~ 500 мкм для культуры клеток 3D.
- Инкубировать при 37 ° С в течение 30мин для геля с образованием.
- Добавьте 100 мкл среды в верхней части, образованных гидрогелей и инкубировать при 37 ° С.
- Трехмерные культуры клеток на переменной жесткости гелей
- Использование раствора из 1.3.3, пипетка 100 мкл Прегелем раствора в каждую лунку 96-луночного планшета.
- Инкубируют при 37 ° С в течение 30 минут для геля для образования.
Примечание: Сшивка шаги со стороны 2 может быть использован здесь. - Пассаж клетки 9.
- Добавить 10000 клеток / см 2 в лунки.
- Увеличение средств массовой информации до 100 мкл на лунку и инкубировать при температуре 37 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя этот метод, мы изготовили гидрогели из нормальной свиньи, крысы и легких мышей (рисунок 1). Обработанные легкие обеспечивают, по оценкам, 5 мг, 40 мг и 10 г порошка ECM соответственно. Обзор процесса показана на рисунке 2. Ключевые визуализации во время процесса включают в себя: белый вид легких после ополаскивания дезоксихолат; после образования Прегелем, раствор должен быть непрозрачным, и раствор должен появиться гомогенным в течение нескольких месяцев при хранении при 4 ° С. Мы включили в базовую таблицу поиска неисправностей , чтобы помочь идентифицировать источники ошибок на протяжении всего процесса (таблица 2). После того, как гелеобразование, гидрогели можно использовать сразу или хранить для будущего использования. Реологические испытания подтверждают , что более 90% от гелеобразования происходит в течение первых минут после достижения 37 ° C (рисунок 3). Сформированные гидрогели являются стабильными в течение длительного периода времени в PBS, но прикрепление клеток и proliferatioп может измениться (рисунок 4).
Хотя этот протокол написан для свиных легких, пространственные ограничения ограничивают нас использовать только одно легкое, когда decellularizing свиных легких. Мы использовали ту же самую процедуру с незначительной модификацией decellularize оба легких для других видов. Для крыс и мышей, легкие могут быть оставлены нетронутыми и прикрепленного сердца, но соединительная ткань должна еще быть удалены с скальпелем или ножницами. Мы держать сердце нетронутыми и прилагается для крыс и мышей, и заливать решения через правый желудочек вместо легочной артерии. Кровоснабжение трахеи все та же; Тем не менее, канюля может быть зашивают в трахею для облегчения доступа для более мелких видов.
Мы добавили несколько типов клеток, мезенхимальных стволовых клеток человека, 9 мышиные мезенхимальные стволовые клетки, эпителиальные клеточные линии человека (A549s), человеческий первичный капиллярный эндоthelial клетки (HpuVECs) и пупочной вены эпителиальные клетки человека (HUVECs) внутри и на поверхности ECM легких гидрогелей. Мы не сталкивались с проблемами в отношении ксеногенного природы образовавшихся гелей. Наша предыдущая работа показала значительное снижение альфа-галактозидазы в свиных гидрогели. 9 Раствор предварительно гель также может быть использован в качестве покрытия при температуре 4 ° С , чтобы улучшить прикрепление клеток. Решение ПРЕГЕЛЯ улучшает вложение HpuVEC и пролиферации при добавлении в легких ECM покрытием культуральных планшетах. Покрытые скважины демонстрируют значительно улучшить клеточное вложение по сравнению с необработанными скважин (рисунок 5).
Добавление генипин увеличивает сшивание гидрогеля. Это увеличенное сшивание может обеспечить более физиологически соответствующую жесткость, при одновременном уменьшении деградации внеклеточного матрикса. Уменьшение деградации, хотя и незначительным в пробирке, может произойти из - за увеличения связи междубелки и, следовательно, большее сопротивление к ECM ремоделирования клетками. Мы использовали частоту свип на вискозиметре для измерения механических свойств гидрогель сшитой. Гидрогель жесткость была обнаружена прямо коррелирует с концентрацией генипин с медианой и наиболее соответствующей концентрации быть 0,01% (рисунок 6, родной ткани не показано). МТТ использовали для количественной оценки пролиферации клеток и выживаемость на гидрогель сшитой. Пролиферации клеток выше на сшитый гидрогель (рисунок 7). Это поддерживает повышенную клеточную пролиферацию на повышенную жесткость со стороны других. 12 Варьирование генипин время или температура сшивания может приводить к различным сшивающих градусов.
Рисунок 1: Изображения Легких Мы ли Decellularized. Иллюстрации (A) Мышь легких после decellulariнизации и сердце удалены, (B) , после того, как крыса Тритон Х-100 смывается, (С) Свиньи, перед первым полоскании; они дают ~ 5 мг, 40 мг и 10 г легкого ЕСМ, соответственно. Легкого (D) Мышь и неповрежденными сердце, после того, как decellularization, с канюлей еще пришивают на месте. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Обзор методов. Это обзор метода для получения гидрогелей из легких. Начиная с гуртом decellularization свинья легких происходит оставляя только белый непрозрачный или полупрозрачный ткань, которая состоит из белков ЕСМ. Затем после удаления остатка воды, а также к увеличению площади поверхности с целью оптимизации кислотной обработки ткань солюбилизированный. Нейтрализация переменного токаID и увеличение соли до физиологических уровней создает решение ПРЕГЕЛЯ готовый к желатинизации. После того, как раствор образует гидрогель при температуре 37 ° С, характеристики происходит с гелем реометра и сканирующей электронной микроскопии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Представитель реологических данных для Гелеобразование при температуре Ramping. После того, как начальная амплитуда качания частоты для определения линейного диапазона вязкоупругой, температура рампа была использована для определения кинетики гелеобразования. Данные представлены в виде среднее +/- стандартное отклонение. п = 4.
Рисунок 4: Долговременная стабильность. имвозраст свиньи легкого ЕСМ гидрогеля, хранящегося в PBS в течение более 6 месяцев при комнатной температуре.
Рисунок 5: Метаболический Количественный анализ HpuVECs. Данные пролиферации МТТ от человека первичных микрососудистых эндотелиальных клеток (HpuVECs), выращенных на необработанными культуральных планшетах. Pregel раствор из 1.3.3 был добавлен к пластинам, охлажденных в течение ночи и промытые с образованием предварительно гель ECM легких пластин с покрытием. HpuVECs показали более высокую активность МТТ на ЕСМ планшетам, покрытым по сравнению с не покрытой оболочкой. * Р <0,05 по сравнению с контролем. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение n = 3 на группу.
Рисунок 6: реологических данных для улучшения сшивание. Данные Реологии для генипин сшиванию. Жесткость увеличивается с увеличением концентрации Geniприколоть к плато на 1% генипин. Данные нормализованы, чтобы показать кратное увеличение сшивания с генипин.
Рисунок 7; Пролиферации клеток на генипин сшитых гелей. Нормированные данные МТТ для A549s на генипин сшитых гидрогелей. Увеличение пролиферации клеток видно с повышенной жесткостью. р <0,05 по сравнению с контрольной группой. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. п = 3 на группу.
| проблема | выпуск | разрешение |
| Красный / розовый цвет сохраняется после decellularization | Неэффективное decellularization | Начать сначала с новыми легкими |
| Удалить области неполного decellularization </ TD> | ||
| окклюзия сосуда | Начать сначала с новыми легкими | |
| Удалить области неполного decellularization | ||
| Значительные клеточные остатки сохраняются | Неэффективное decellularization | Начать сначала с новыми легкими |
| Удалить области неполного decellularization | ||
| окклюзия сосуда | Начать сначала с новыми легкими | |
| Удалить области неполного decellularization | ||
| ателектаз | Начать сначала с новыми легкими | |
| Удалить области неполного decellularization | ||
| Разрушение мембран найдены в гистологических образцов | Чрезмерное повышение давления сосудов во время перфузии | Снижение перфузионного давлениямоющих средств |
| Большие частицы остаются после размола | Слишком много лиофилизированный материал в трубе | Уменьшить материал в измельчении цилиндр |
| Не измельчали в течение достаточно долго | увеличить время фрезерования | |
| Pregel решение не желирующий | РН раствора слишком высока | Сделать рН 7,4 |
| Начало ПРЕГЕЛЯ раствора со свежим порошком | ||
| Решение рН слишком низкое | Сделать рН 7,4 | |
| Начало ПРЕГЕЛЯ раствора со свежим порошком | ||
| ECM над переваренных | Начало ПРЕГЕЛЯ раствора со свежим порошком | |
| Клетки не выживают | Микробы, введенные после того, как HCl пищеварения | Начните снова со свежим порошком и использовать стерильные отфильтрованные растворы |
| рН OФ.Ф. | Начинают ПРЕГЕЛЯ решение снова | |
| Сделать рН 7,4 | ||
| Клетки взрыв | Фикс содержание соли в растворе ПРЕГЕЛЯ |
Таблица 2: Руководство по устранению неисправностей для выявления источников потенциальной ошибки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одним из неотъемлемых аспектов биологии является самоорганизация молекул в иерархических структур, которые выполняют определенную задачу. 13 В лаборатории, самосборка зависит от целого ряда факторов , таких как концентрация соли, рН и продолжительности сбраживания. Как показала практика, самоорганизующейся гидрогелевые формы, когда солюбилизировать белки возвращают к физиологической температуре. Гидрогель формируется способна стимулировать клеточную пролиферацию и прикрепление в пробирке.
Клеточный ответ на биофизических сигналов от ECM не могут быть исследованы с использованием полимеров. Тканевая специфический клеточный ответ на биофизических сигналы не могут быть исследованы с помощью других тканей. Регенерация исследователи и врачи считают, используя decellularized каркасы улучшает регенерацию тканей и заживление ран. Хронические страдальцы болезни легких нуждаются терапевтические улучшения для повышения доступности органов и снижение иммуногенности. Органные специфические, клеточно-ECM взаимодействия должны бытьисследовал для дальнейшей биологии органов.
Использование ECM в качестве каркаса клетки для клеток легких показал стабильные результаты. 14,15 Использование срезов легких от заболевшего моделей способствует ОБНОВЛЕНА болезни 16 стволовых или клеток - предшественников, найденных в дистальных легких, 17,18 и требует специальных нишах для предотвращения образования тератомы. Использование тканеспецифическую ECM в качестве носителя для доставки, регенерирующее действие на дифференцировку стволовых клеток может быть повышена. ECM гидрогель устанавливает более применимый среду для оценки клеточных реакций на внеклеточного матрикса.
Большое тело исследования существует смотря на жесткость, как он относится к клеточной сигнализации. Наш метод генипин сшиванию позволяют сигнализации клеточной жесткости, а также взаимодействие компонентов клеточной ECM. В то время как гидрогель жесткость можно манипулировать количеством ECM и соотношения белков, использование генипин позволяет гидрогелевые изменения жесткости несколько независимо от содержимого ECM. Регулировка генКонцентрация EPIN может позволить для точной настройки механических свойств наиболее близко напоминают ткани легких естественно 6. Из генипин данные, полученные с использованием гидрогелей из периферической легких в данном исследовании, было отмечено 15-кратное увеличение (от 5 Па до 75 Па). На основании реологических данных биопсию нормальной ткани крыс легких, которая была decellularized с использованием тех же методов, можно добиться приблизительной периферический легких жесткости ткани (данные не показаны) путем добавления 1% генипин к периферийным гидрогелей легких или добавлением 0,01% до целых гидрогелей легких (по оценкам ). Использование периферийное ECM легких , состоящий из паренхимы легких сделал значительно более мягкий гель по сравнению с ранее опубликованными результатами всего легкого ECM - гидрогелевых 7. Поэтому в дополнение к генипин, выбор конкретных областей легочной ткани к decellularize может существенно повлиять на жесткость.
Есть возможность улучшить этот метод, который может включать в себя дополнительные шаги, обычно используемые в perfusiна decellularization всей легочной ткани. Этот метод был использован на нормальной легочной ткани и может потребовать модификации для decellularization пораженных легких. Мы еще не изучили этот процесс в конкретных болезненных состояний. Мы получаем наши легкие погруженные на льду в течение ночи с бойни. Этот метод может ограничить эффективность нашего процесса вследствие ателектаза или окклюзии сосудов; Тем не менее, мы редко должны удалить участки легких, которые не были тщательно decellularized. При получении свежей ткани легкого, мы рекомендовали бы сделать все необходимые решения, прежде чем попасть в легкие, чтобы предотвратить любые паузы в обработке ткани. Предыдущее исследование показало , что с помощью надуксусной кислоты в качестве конечной стадии стерилизации , чтобы матрица производства вызывает регенеративной M1 макрофагами фенотип в инфильтрации иммунных клеток, 19 потенциально улучшая proregenerative эффекты decellularized ткани. Другие исследования ушли в другие моющие средства, используя для завершения процесса, но те appeaг быть лаборатории конкретные предпочтения в конечном счете то же влияние на decellularization. Порядок и этапы пищеварения decellularization могут быть оптимизированы в зависимости от конкретного применения исследователя. Например, изменение времени или нейтрализации методов гель пищеварением может изменить состав белка, механические свойства, или кинетики гелеобразования.
Альтернативы методу, изложенному здесь может варьироваться в степени сложности в зависимости от желаемых результатов эксперимента. Например, если цель состояла в том, чтобы держать базальную мембрану неповрежденной в максимально возможной степени, перфузионный насос с ограниченным контролем давления может уменьшить повреждение барьера. Кроме того, если одна была лабораторная установка доступны, чтобы держать оба легких неповрежденными для более крупных видов, процесс decellularization может улучшить эффективность. И наоборот, рука технологии помола с помощью ступки и пестика, могут быть применены к лиофилизированной ткани для лабораторий, которые не имеют CryoMill. Мы ожидаем, что рука шлифог дл получени более крупных фрагментов, ограничивая площадь поверхности, доступной для кислотного разложения поэтому время переваривания возможно, должны быть изменены в данном случае.
Альтернативы не ограничиваются ступеньках decellularization и образованию гидрогелей. Gluteraldehyde был использован в качестве сшивающего агента для гидрогелей, обеспечивая одну возможную альтернативу повышению механической прочности биологических гидрогелей, используемых для модельных систем. Другие модельные системы включают в себя интактные decellularized легкие как в пробирке системы культуры 3D, или чаще , глядя на срезах легких в качестве модели 3D в пробирке строительных лесов. 20 Мы уже упоминали об ограничениях , которые приходят от работы с полимерными подмостей, а также отдельных компонентов каркасах, но те остаются в качестве возможных альтернатив процедуре , представленной здесь. Кроме того, существуют альтернативные способы определения decellularization эффективности (например, выделения ДНК), гелеобразование (можно использовать мутности пробы), а также прикрепление клетоке пролиферации (например, использование CCK8). Мы обнаружили, что методы, описанные здесь, более чем достаточно, чтобы охарактеризовать гидрогели для использования в качестве модели 3D-строительные леса.
В ECM гидрогели легких мы описываем здесь обеспечивают эффективную платформу для изучения клеточных взаимодействий ECM. Решение ПРЕГЕЛЯ имеет потенциал в качестве покрытия для носителей полимера наркотиков, способствуя доставке мезенхимальных стволовых клеток, или в качестве платформы для доставки лекарственного средства сама по себе. Протокол, представленные в настоящем документе представлены основные шаги по созданию универсальной гидрогель, полученный из ЕСМ легких.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Smithfield фермы за пожертвование неповрежденную свиную легочной ткани. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Ху Янг, доктор Кристина Тан и отделение хирургии VCU Plastic за предоставленную нам возможность использовать свое оборудование. Гидрогеля и тканевые образцы были приготовлены для SEM на VCU кафедры анатомии и нейробиологии Микроскопия фонда при поддержке, в частности, путем финансирования из NIH-NINDS Центр Основной Grant 5 P30 NS047463 и, в частности, по форме финансирование NIH-NCI онкологический центр поддержки Грант P30 CA016059. SEM изображения образцов на VCU Nanotechnology Ядро характеризации фонда (НКК). Эта работа финансировалась Национальным научным фондом, CMMI 1351162.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use in hood with eye protection and gloves. |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
| HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
| Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
| PBS | VWR | 45000-448 | None |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
| Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
| Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
| Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
| Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |
References
- Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. 14, (2008).
- Haycock, J. W. 3D Cell Culture. , Humana Press. (2011).
- Walker, J. M., Ed, Epithelial cell culture protocols. , Humana Press: Springer. New York: New York. (2012).
- Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta Biomater. 5 (1), 1-13 (2009).
- Koo, H. -J., Lim, K. -H., Jung, H. -J., Park, E. -H. Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin. J. Ethnopharmacol. 103 (3), 496-500 (2006).
- Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels to Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
- Suckow, M. A., Voytik-Harbin, S. L., Terril, L. A., Badylak, S. F. Enhanced bone regeneration using porcine small intestinal submucosa. J. Invest. Surg. 12 (5), 277-287 (1998).
- Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl. Res. J. Lab. Clin. Med. 163 (4), 268-285 (2014).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. J.Biomed.Mater.Res.A. , (2016).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS One. 5 (9), e12905 (2010).
- Ratner, B. D., Bryant, S. J. Biomaterials: where we have been and where we are going. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41-75 (2004).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nat Protoc. 7 (6), 1138-1144 (2012).
- Zhang, W. -J., et al. The reconstruction of lung alveolus-like structure in collagen-matrigel/microcapsules scaffolds in vitro. J. Cell. Mol. Med. 15 (9), 1878-1886 (2011).
- Booth, A. J., et al. Acellular Normal and Fibrotic Human Lung Matrices as a Culture System for In Vitro Investigation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 186 (9), 866-876 (2016).
- Matsuda, A., et al. Evidence for human lung stem cells. N. Engl. J. Med. 364 (19), 1795-1806 (2011).
- Zuo, W., et al. p63+Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517 (7536), 616-620 (2015).
- Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
- Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).
