Summary
Bu akciğer hücre dışı matristen 3 boyutlu hücre kültürü iskele oluşturmak için bir yöntemdir. Bozulmamış akciğer üç boyutlu hücrelerin büyümesini destekleyen hidrojeller olarak işlenir.
Abstract
Burada, in vitro akciğer hücre kültürü için çok bileşenli hücre kültürü hidrojeller oluşturulması için bir yöntem sunulmaktadır. Domuz, sıçan veya fare bloğun akciğer dokusunda en sağlıklı ile başlayarak, doku perfüze selüler artığın ayrılması için, daha sonraki kimyasal deterjanlar içinde kalmasını sağlar. işlem öncesi ve sonrası dokunun histolojik karşılaştırma çift sarmallı DNA ve alfa galaktosidaz boyama% 95'in üzerinde kaldırılmasını teyit hücresel enkaz çoğunluğu kaldırılır göstermektedir. Decellularization sonra, doku liyofılize edildi ve sonra toz haline cryomilled olup. Matris toz, bir asidik pepsin sindirim çözeltisi içinde 48 saat boyunca sindirilir ve daha sonra PREGEL çözelti oluşturmak için nötralize edilir. PREGEL çözeltisinin jelasyon, 37 ° C'de inkübe edilerek uyarılabilir ve hemen ardından nötralizasyon kullanılabilir veya iki haftaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir. Kaplama C için muamele edilmemiş plaka PREGEL çözeltisi kullanılarak oluşturulabilirarşın eki. Hücreler, hücreleri iskele boyunca göç veya kaplamalar üzerinde kaplama sağlayan bir oluşturulmuş jelin yüzeyi üzerine kaplanmış, bir 3D kültür elde etmek için kendiliğinden montaj öncesinde PREGEL, içinde süspanse edilebilir. stratejiye değişiklikler jelasyon sıcaklığının, kuvvet ya da protein parçası boyutları etkileyebilir sunulmaktadır. hidrojel oluşumu ötesinde, hidrojel sertlik genipin kullanılarak arttırılabilir.
Protocol
| Çözüm | Steril Filtresi | Yol |
| Dihidro 2 O | Evet | Dihidro 2 O; Steril süzüldü |
| % 0.1 Triton X-100 Çözüm | Evet | Davlumbaz altında dihidroksi 2 O 100 ml, 100 ul, Triton-X 100 çözüm ekleyin ve çözülene kadar ajite; steril filtre. |
| % 2 Deoksikolat Çözelti | Evet | davlumbaz altında 2 gr Sodyum Deoksikolat çözüm ekleyin 100 mi dihidro 2 O ve eriyinceye kadar ajitasyon başı; steril filtre |
| 1 M NaCl | Evet | Dihidro 2 O 1 L 58.44 g NaCI ekleyin; çözülene kadar ajite; steril filtre |
| DNaz çözümü | Evet | 12,000 eklebirimleri DNaz 1 L DIH 2 O; 0.156 gr MgSO 4 ekleme (Susuz) ve 0.222 g CaCl2; çözülene kadar ajite; steril filtre |
| PBS | Evet | , 27.2 g Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (dibazik heptahidrat) birleştirin 80 g NaCI ve 10 L dihidroksi 2 O 2 g KCI; çözülene kadar ajite; 7.4 pH ayarlamak; steril filtre |
Tablo 1: Doku Decellularization için gerekli çözümler. decellularization işlemi için yukarıdaki çözümler olun. 4 ° C'de saklayın. Yaklaşık 2.5 L bir domuz akciğer için gerekli olacaktır.
1. Hidrojel Oluşumu
- (Referanslar 9,10 uyarlanmıştır) Domuz Akciğer Decellularization
- Kalp ve Vasc ile, bir mezbahadan, bir bloğun en normal bir domuz akciğer eldeulature bozulmamış.
- kalp mümkün olduğunca yakın damarsal kesim, kalbi uzak incelemek için doku makas veya neşter kullanın, kalan damar perfüzyon için daha sonraki adımlarda kullanılacaktır.
- Dikkatli bir neşter veya makas kullanarak trakea, bronşlar ve damarsal çevreleyen bağ dokusu uzak teşrih.
NOT: decellularization sürecinin etkinliğini engelleyebilir büyük kesikler veya delikler plevra yoluyla ve atelektazi veya damar tıkanıklığına büyük miktarlarda olmadan bir akciğer seçerek prosedürün geri kalanı için kullanılacak en iyi akciğer belirleyin. - (Atılabilir kalp, bağ dokusu ve kaldırılan akciğer lobları) mümkün olduğunca trakea bağlı olduğu kadar bronşu bırakarak bırakıyorsa akciğer kesip. tek akciğer trakea ve damarsal bağlı kalan olmalıdır.
NOT: İsterseniz histoloji için bölümleri saklayın. 9 - p kelepçeler veya sütür ile bağlantısız bronşlar kapatınRevent fazla geri tepme.
- (Tablo 1), gerekli olana kadar, 4 ° C de decellularization çözümleri ve buzdolabında hazırlayın.
- , Pulmoner arter uyum pulmoner arter ve trakea hem aracılığıyla akciğer dokusunda DI suyla 3 kez serpmek için kanüle bir el pompası kullanılarak. ilk her seferinde damarsal serpmek. damar sistemine yaklaşık 1 L ve her perfüzyon için trakea içine 1.5 L ile başlayın, ama hücresel enkaz kaldırıldıktan olarak daha likit sistemi ile perfüze edilebilir.
- Triton X-100 çözeltisi, her iki damar ve trakea serpmek.
- 4 ° C'de 24 saat boyunca, Triton X-100 çözeltisi akciğer dokusu daldırın.
- DI su ile perfuse damarsal ve trakea 3 kez durulayın.
- deoksikolat çözeltisi ile iki damar ve trakea serpmek.
- 4 ° C'de 24 saat boyunca deoksikolat doku bölümleri daldırın.
- DI su ile perfuse damarsal ve trakea 3 kez durulayın.
- NaCl çözeltisi ile iki damar ve trakea serpmek.
- 4 ° C'de 1 saat boyunca, filtre NaCI çözeltisi doku daldırın.
- DI su ile perfuse damarsal ve trakea 3 kez durulayın.
- DNaz çözeltisi ile iki damar ve trakea serpmek.
- 4 ° C'de 1 saat boyunca, filtre DNase solüsyon içerisinde dokuyu daldırın.
- damar ve trakea 5 kez PBS ile iki serpmek.
- fark kıkırdaklı dokuyu, trakea ve sadece solunum bölgeleri (öncelikle periferal alanlar) bırakarak, solunum yollarını yapmasına (öncelikle hilusun ve akciğerlerin medial kısımları çevresinde bulunan) çapında tüm tübüller 2 mm veya daha büyük parçalara ayır.
- 1 inç bölümleri veya daha küçük içine doku teşrih. doku Oryantasyon Bu aşama için önemli değil.
- 50 ml konik tüpler aşırı sıvı ve yer dokusu dökün. -80 ° C'de doku dondurun.
Not: histolojik hücre ve hücre debri çıkarılmasını sağlamak için bölümler saklayıns, arzu edildiği takdirde. Biz H & E kullanımı, α-galaktosidaz, Picogreen, hidroksiprolin, ninhidrin, alcian blue, SDS-PAGE ve kütle spektrometresi karakterize etmek. 9
- akciğer İşleme
- Decellularized akciğer dokusu içeren dondurulmuş tüplerin kapaklarını çıkarın.
- Tüp deliğinin üzerine filtre kağıdı yerleştirin ve lastik bant ile sabitleyin.
NOT: Tüp ve içeriği hala donmuş kadar aksi -80 ° C yerleştirmek dondurulmuş olmalıdır. - Tüm aşırı sıvı üretici talimatlarına göre bir dondurma kurutma kullanılarak, bitene kadar doku liyofilize. değirmen hazır olana kadar -80 ° C'de saklayın.
- çalışma koşullarına yalıtımı ve iç bileşenlerin soğutulması için dondurucu değirmene sıvı azot eklemek başlamadan önce.
- değirmen tüpten manyetik değirmen çubuğunu çıkarın ve alt kapak doku ekleyin.
- değirmen çubuğunu değiştirin ve gevşek paketlenmiş doku ekleyin. değirmen bar hala serbestçe hareket etmelidir.
- değirmen tüpü ve pla kapatındondurucu değirmende ce.
- maksimum doldurma çizgisine kadar sıvı azot doldurun.
- Dondurucu değirmen ince toz haline tüm doku (yaklaşık 5 dakika, ~ 600 dakika çarpma hızı -1) bir paslanmaz çelik bir çarpma polikarbonat silindir hem de üretici talimatlarına göre dondurucu değirmen kullanılarak, paslanmaz çelik uç fişler. Kullanıma hazır olana kadar -80 ° C'de saklayın.
- Mikro-gözenekli bir jel formasyonu (8 mg / ml) (referans uyarlanmıştır 9,11)
- % 1 ekleyin (a / h) hücresizleştirilmiş tozu ve% 0.1 (ağırlık / hacim), 0.01 M HCI pepsin sürekli ajitasyon altında, oda sıcaklığında, (sıvı üst düzeyde akış görmek gerekir) 48 saat.
NOT: Toz statik toz tüp duvarlardan aşırı yıkamak için fırsat tanıyor sonra çok HCl ekleyerek tahsil edilir. - 48 saat boyunca sindirimden sonra, 5 dakika boyunca buz üzerinde solüsyonu ve reaktifleri.
- Sıcaklık 10 olarak% (h / h), 0.1 M NaOH, birD 11.11% (h / h) 10 x PBS, 7.4 fizyolojik pH sindirilmiş protein çözeltisi getirmek (konsantrasyon 1x tüm çözüm getirmek için).
NOT: Çözelti hemen bir haftaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir. Istenirse reometre 9 kullanarak jelleşme kinetik gerçekleştirin.
- % 1 ekleyin (a / h) hücresizleştirilmiş tozu ve% 0.1 (ağırlık / hacim), 0.01 M HCI pepsin sürekli ajitasyon altında, oda sıcaklığında, (sıvı üst düzeyde akış görmek gerekir) 48 saat.
2. Mekanik Gücü Artırmak İçin hidrojellerin Çapraz bağlama
- 1,% 0.1 ve% v genipin çapraz bağlama çözeltisi w /% 0.01 solüsyonları,% 10 DMSO içinde genipin tozun gerekli miktarda çözülmesiyle hazırlanmıştır.
- 1 saat çözüme her 15 dakika karıştırın.
- Daha önce kısmen 1.3.4 monte edilmiştir ECM hidrojeller (96 çukurlu bir levhanın her bölmesine 100 ul) kapsayacak şekilde genipin solüsyonu ekleyin.
- 37 ° C'de 24 saat boyunca çapraz bağlanması için her ECM hidrojel bırakın.
- yıkama solüsyonu artık mavi olana kadar ECM hidrojel PBS ile 3 kez durulayın. çapraz hidrojeller daha sonra karakterizasyon ve ce için hazır olacakll kültürü çalışmaları.
Mikro Jel ile 3. Hücre Kültürü
- İki boyutlu kaplama
- 1.3.3 solüsyonun kullanılarak, 96 çukurlu bir muamele edilmemiş doku kültür plakasının her bir oyuğuna PREGEL çözeltisinin 20 ul ekle.
- 4 ° C'de bir gece buzdolabında protein adsorpsiyon plaka izin vermek.
- Aspire Pregel çözümü ve PBS ile durulayın.
- Geçiş hücre, 9.
- Kuyulara 10.000 hücre / cm 2 ekleyin.
- oyuk başına 100 ul ortam artırmak ve 37 ° C'de inkübe edin.
- Üç boyutlu hücre kültürü 9
- 1.3.3 solüsyonun kullanarak, PREGEL çözeltisi 1.000.000 hücre / ml 'lik bir konsantrasyona kadar pelet hücreleri yeniden süspanse edin.
- Hızlı 3D hücre kültürü için ~ 500 um kalınlığında bir hidrojel oluşturmak üzere, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna PREGEL hücre süspansiyonu 16 ul dağıtmak.
- 30 dakika süre ile 37 ° C'de inkübe edinjel dakika oluşturulması için.
- oluşturulan hidroj en medya 100 ul ilave edin ve 37 ° C'de inkübe edin.
- Değişken sertlik jeller Üç boyutlu hücre kültürü
- 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna pipetle, 1.3.3 gelen PREGEL çözeltisi 100 ul çözelti kullanılması.
- Jel oluşturmak için 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
Not: Burada kullanılan kısmı 2 adım Çapraz bağlama. - Geçiş hücre, 9.
- Kuyulara 10.000 hücre / cm 2 ekleyin.
- oyuk başına 100 ul ortam artırmak ve 37 ° C'de inkübe edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntem kullanılarak, normal domuz, sıçan ve fare akciğer (Şekil 1) gelen hidrojeller üretmişlerdir. İşlenmiş akciğerler bir sırası ile, 5 mg, 40 mg ve ECM tozun 10 g tahmin sağlar. Işlemin bir genel görünüşü Şekil 2 'de gösterilmiştir. sürecinde kilit görselleştirme şunlardır: deoksikolat durulama sonra akciğerlerin beyaz bir görünüm; PREGEL oluşumundan sonra, çözelti, opak olmalı ve 4 ° C'de muhafaza edildiğinde çözelti ay homojen görünmelidir. Biz sürecin (Tablo 2) boyunca hata kaynaklarını belirlemenize yardımcı olması için bir temel sorun giderme tablosu dahil ettik. jelleşme sonra hidrojeller hemen kullanılabilir ya da gelecekte kullanılmak üzere saklanabilir. Reolojik test jelleştirici üzerinde% 90, 37 ° C (Şekil 3) ulaştıktan sonra, ilk dakikada oluşur doğrulamaktadır. Oluşturulan hidrojeller uzun PBS süreler, ancak hücre eki ve proliferatio stabildirn (Şekil 4) değişebilir.
Bu protokol domuz akciğer için yazılmış olsa da, uzay sınırlamaları domuz akciğerleri decellularizing yalnızca bir akciğeri kullanmak için bize sınırlamak. Biz diğer türler için her iki akciğerde decellularize minör değişiklik ile aynı prosedürü kullandık. sıçanlar ve fareler için, akciğerleri bütün halde bırakılabilir ve kalp bağlı ama bağ doku hala bir neşter veya makas ile temizlenmelidir. Biz sağlam ve sıçanlar ve fareler için ekli kalp tutmak ve sağ ventrikül yerine pulmoner arter yoluyla çözüm serpmek. trakea perfüzyon hala aynı; Ancak, kanül küçük türler için erişim kolaylığı için trakea sütüre edilebilir.
Biz birden fazla hücre tipleri, insan mezenkimal kök hücreleri, 9 fare mezenkimal kök hücreleri, insan epitel hücre hatları (A549s), insan primer mikrovasküler endo ekledikendotel hücreleri (HpuVECs) içinde ve akciğer ECM hidrojeller yüzeyinde, insan göbek damarı epitel hücreleri (HUVECler). Biz oluşturulan jellerin ksenojenik doğası ile ilgili sorunlar karşılaştı değil. Bizim önceki çalışma domuz Hidrojellerde α-galaktosidaz önemli bir düşüş göstermiştir. 9 önceden jel çözeltisi, hücre eki artırmak için 4 ° C sıcaklıkta bir kaplama olarak kullanılabilir. Akciğer ECM kaplı doku kültürü plakaları eklendiğinde PREGEL çözümü HpuVEC eki ve çoğalmasını arttırır. Kuyucuklar anlamlı olmayan işlenmiş oyuklarla (Şekil 5) ile karşılaştırıldığında hücre eki iyileştirmesi.
genipin ekleme hidrojel çapraz bağlanmasını arttırır. ECM bozulma düşürürken yüksek çapraz bağlama, fizyolojik olarak daha uygun sertlik sağlayabilir. Bozulma azalması, in vitro küçük olsa da, bağlı arasında artan bağlama oluşabilirproteinler ve hücreler tarafından ECM yeniden dolayısıyla daha fazla direnç gösterir. Bu çapraz bağlanmış hidrojel mekanik özelliklerini ölçmek için bir reometre frekans temizleyicileri kullanılır. Hidrojel sertliği doğrudan medyan ve en alakalı konsantrasyonu% 0.01 olmak konsantrasyonunu genipin korele olduğu bulunmuştur (Şekil 6, yerli doku gösterilmemiştir). MTT deneyi, çapraz bağlanmış hidrojel hücre proliferasyonu ve hayatta kalma ölçmek için kullanılmıştır. Hücre çoğalması, çapraz bağlanmış hidrojel (Şekil 7) daha yüksektir. Bu diğerlerinden artan sertlik üzerinde artan hücre çoğalmasını destekler. Süresinin veya sıcaklığının çapraz bağlama 12 değiştirilmesi genipin farklı çapraz bağlama derecesi ile sonuçlanabilir.
Şekil 1: Biz Akciğerler görüntüleri decellularized var. Decellulari sonra (A) Fare akciğer Resimleriyon ve kalp çıkarılır, Triton X-100, uzak durulandı sonra (B) Sıçan (Cı) Domuz ilk çalkalama öncesindeki; sırasıyla, ~ 5 mg, 40 mg, ve Akciğer ECM'nin 10 g. Kanül ile Decellularization sonra (D) Fare akciğer ve bozulmamış kalp, hala yerinde dikildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Yöntemlerine Genel Bakış. Bu akciğerlerden hidrojeller üretmek için yöntemin genel bir bakış. blok domuz akciğer decellularization ECM proteinleri oluşur, sadece opak beyaz veya saydam doku bırakarak oluşur tr ile başlayarak. Sonra kalan suyun çıkarılması ve asit sindirimi optimize etmek için yüzey alanını arttırarak sonra doku çözündürülmüş olduğunu. ac nötralizasyonuid ve fizyolojik seviyelere tuz artan jelleşme hazır Pregel çözümü oluşturur. Çözelti, 37 ° C'de bir hidrojel oluşturan bir kez, karakterizasyon jel reometresi ve taramalı elektron mikroskobu ile gerçekleştirilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Sıcaklık ramping altında jelleşme için Temsilcisi Reolojik Veri: Şekil 3. bir ilk genlik süpürme, doğrusal viskoelastik aralığını belirlemek için sonra sıcaklık rampası jelasyon kinetiklerini belirlemek için kullanılmıştır. Veriler ortalama +/- standart sapma olarak gösterilmiştir. n = 4.
Şekil 4: Uzun Vadeli İstikrar. bir imOda sıcaklığında 6 aydan fazla bir süre için PBS içinde saklanan bir domuzu akciğer ECM hidrojel yaşı.
Şekil 5: HpuVECs Metabolik Deneyi. işlenmemiş doku kültürü plakaları üzerinde büyütülmüş insan primer mikrovasküler endotelyal hücreleri (HpuVECs) arasında MTT proliferasyon verileri. 1.3.3 arasında PREGEL çözümü plakaları, bir gece boyunca buzdolabında önceden jel akciğer ECM kaplanmış plakalar meydana getirmek üzere durulandı ilave edildi. HpuVECs kaplanmamış ile karşılaştırıldığında ECM kaplı plakalar daha yüksek MTT aktivitesi göstermiştir. * P <0.05 kontrol ile karşılaştırıldığında. Veriler ortalama ± standart sapma grup başına n = 3 bulunmaktadır.
Şekil 6: Gelişmiş çapraz bağlama için Reolojik veriler. genipin çapraz bağlama için reometre verileri. geni artan konsantrasyonları ile sertliğini arttıran% 1 genipin bir plato pin. Veri genipin ile çapraz bir kat bir artış göstermek için normalize edilir.
Şekil 7; Genipin Çapraz Gels üzerinde Hücre Çoğalması. genipin çapraz hidrojeller üzerinde A549s için normalize MTT verileri. Artan hücre çoğalması artan sertlik görülen. p <0.05 kontrol ile karşılaştırıldığında. Veriler ortalama ± standart sapmadır. Grup başına n = 3.
| Sorun | Konu | çözüm |
| Decellularization sonra muhafaza Kırmızı / pembe renk | etkisiz decellularization | yeni akciğerler ile yeniden başlayın |
| Eksik Decellularization alanları kaldırın </ Td> | ||
| Vasküler oklüzyonu | yeni akciğerler ile yeniden başlayın | |
| Eksik Decellularization alanlarını kaldır | ||
| Önemli hücresel enkaz muhafaza | etkisiz decellularization | yeni akciğerler ile yeniden başlayın |
| Eksik Decellularization alanlarını kaldır | ||
| Vasküler oklüzyonu | yeni akciğerler ile yeniden başlayın | |
| Eksik Decellularization alanlarını kaldır | ||
| atelektazi | yeni akciğerler ile yeniden başlayın | |
| Eksik Decellularization alanlarını kaldır | ||
| Histolojik numuneler bulunan membran Tahribat | perfüzyon sırasında gemilerin Aşırı basınçlandırma | perfüzyon basıncı azaltmakdeterjanların |
| Büyük parçacık halinde öğütme sonra kalan | tüp içinde çok fazla liyofilize madde | silindir taşlama malzeme azaltmak |
| Yeterince uzun öğütülmüş değil | freze süresini artırmak | |
| jelleşme değil Pregel çözümü | Çözelti pH çok yüksek bir | Yap pH 7.4 |
| taze toz ile Pregel çözüm başlayın | ||
| Çözelti pH değeri çok düşük | Yap pH 7.4 | |
| taze toz ile Pregel çözüm başlayın | ||
| sindirilmiş üzerinde ECM | taze toz ile Pregel çözüm başlayın | |
| Hücreler hayatta yok | HCl sindirim sonra tanıtılan Mikroplar | taze toz ile tekrar başlayın ve steril süzülmüş çözümleri kullanmalarını |
| pH'ı,ff | Yine Pregel çözümü başlayın | |
| Yap pH 7.4 | ||
| hücreler patlama | Pregel çözeltide tuz içeriği düzeltmek |
Tablo 2: Sorun Giderme Kılavuzu Potansiyel Hata Kaynakları tanımak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
biyoloji ayrılmaz yönlerinden biri belirli bir görevi gerçekleştirmek hiyerarşik yapıların içine moleküllerin öz-örgütlenme olduğunu. Laboratuarda 13, kendinden montaj gibi tuz konsantrasyonu, pH ve sindirim süresi gibi pek çok faktöre bağlıdır. Gösterildiği gibi, bir kendi kendini düzenleyen hidrojel çözünür proteinler fizyolojik sıcaklığında tekrar. Oluşan hidrojel in vitro hücresel yapışma ve canlılık geliştirme kapasitesine sahiptir.
ECM'den biyofiziksel sinyallere hücresel yanıtı polimerler kullanılarak araştırılmış edilemez. biyofizik sinyallere doku spesifik hücresel yanıtı diğer dokulara kullanılarak araştırılmıştır edilemez. Rejenerasyon araştırmacılar ve klinisyenler decellularized iskeleleri kullanılarak doku rejenerasyonu ve yara iyileşmesini hızlandırır inanıyorum. Kronik akciğer hastalığı olanlar, organ kullanılabilirliğini artırmak ve bağışıklık azaltmak için tedavi iyileştirmeler gerekiyor. Organa özgü, ECM etkileşimlerinde olmalıdırDaha fazla organı biyolojisi araştırdı.
akciğer hücrelerine için bir hücre iskelesi olarak kullanılarak ECM tutarlı sonuçlar göstermiştir. Hastalıklı modellerden akciğer dilim kullanma 14,15 hastalık yenileme, uzak akciğerlerde 17,18 bulundu 16 kök veya progenitör hücreler, teşvik ve teratom oluşumunu önlemek için özel niş gerektirir. bir iletim aracı olarak dokuya özgü ECM kullanarak, progenitör hücrelerin iyileştirici etkileri artırılabilir. ECM, hidrojel hücre dışı matrisine doğru hücresel reaksiyonları değerlendirmek için daha uygun bir ortam oluşturur.
o hücresel sinyal ile ilgili olarak araştırma büyük bir gövde sertliği bakarak Varlığından. genipin çapraz bağlama Bizim yöntemi hücre sertlik sinyal hem de hücre-ECM bileşeni etkileşimi mümkün kılar. Hidrojel sertliği ECM miktarı ve protein oranı ile manipüle edilebilir olsa da, genipin kullanımı ECM içeriği biraz bağımsız hidrojel sertliği değişikliklere izin verir. gen ayarlamaTopuk konsantrasyonu en yakın doğal akciğer dokusu 6 benzemeye mekanik özelliklerinin doğru ayar için izin verebilir. genipin veriler bu çalışmada periferik akciğer hidrojeller kullanılarak elde edilen dan, (5 Pa 75 Pa) 15 kat artış gözlendi. periferik akciğer hidrojeller% 1 genipin eklenmesi veya tahmini (tüm akciğer hidrojeller% 0.01 oranında ilave ederek, yaklaşık periferik akciğer dokusu sertliği (veriler gösterilmemiştir) elde aynı yöntemler kullanılarak hücresizleştirilmiş olan biyopsi normal sıçan akciğer dokusunun reolojik verilere göre ). Akciğer parankimi oluşan periferik akciğer ECM kullanarak önceden yayınlanmış tüm akciğer ECM hidrojel sonuçları 7 ile karşılaştırıldığında oldukça yumuşak jel yaptı. Bu nedenle ek olarak önemli ölçüde sertliğini etkileyebilir decellularize akciğer dokusunun belirli bölgelerini seçerek, genipin için.
yaygın perfusi kullanılan ek adımlar içerebilir bu yöntemi geliştirmek için fırsatlar vardırtüm akciğer dokusunun Decellularization üzerinde. Bu yöntem, normal akciğer dokusu üzerinde kullanılmış ve hastalıklı akciğer Decellularization için değişiklik gerektirebilir. Henüz belirli hastalık durumlarında bu süreci incelenmiş değil. Biz bir mezbahadan gecede buz üzerinde sevk bizim akciğerleri edinin. Bu yöntem nedeniyle atelektazi veya damar tıkanıklığına bizim sürecinin etkinliğini sınırlayabilir; Ancak, nadiren iyice decellularized henüz akciğer alanlarını kaldırmak gerekir. Taze akciğer dokusu elde ederken, biz doku işleme duraklamaları önlemek için akciğerlere almadan önce gerekli çözümlerin tüm yapım öneriyoruz. Önceki araştırmalar, üretim matris nihai sterilizasyon adımı olarak perasetik asit kullanılarak 19 potansiyel olarak hücresizleştirilmiş doku proregenerative etkilerinin iyileştirilmesi infiltrasyonlu immün hücrelere bir rejeneratif M1 makrofaj fenotipe yol olduğunu bulmuştur. Diğer araştırma sürecini tamamlamak için diğer deterjan kullanılarak gitti, ancak bu appea ettir Decellularization nihayetinde aynı etkiye sahip laboratuvar özel tercihleri olmak. decellularization prosedürü ve sindirim adımları araştırmacının belirli uygulamaya bağlı olarak optimize edilebilir. Örneğin, jel sindirim süresi veya nötralizasyon yöntemlerini değiştirerek protein bileşimi, mekanik özellikler, ya jelleştirme kinetiğini değiştirebilir.
Burada ele alınan yönteme alternatifler istenen deney sonuçlarına göre karmaşıklık düzeyi değişebilir. Amacınız mümkün olduğunca çok sağlam bazal membran tutmak ise Örneğin, basınç sınırlı kontrollü bir perfüzyon pompası bariyer hasarı azaltabilir. daha büyük bir türün bozulmadan her iki akciğerde tutmak için kullanılabilir bir laboratuvar kurulum vardı, ayrıca, decellularization işlemi etkinliğini artırabilir. Bunun aksine, bir havan ve havan tokmağı ile bileme tekniği bir el cryomill olmayan laboratuarlar için liyofilize dokuya uygulanabilir. Biz el grindin beklenebilirSindirim kez bu durumda değiştirilmesi gerekebilir, bu nedenle g asit sindirim için uygun olan yüzey alanını sınırlayan, büyük fragmanları üretmek için.
Alternatif decellularization adımları ve hidrojellerin oluşumu ile sınırlı değildir. Gluteraldehid modeli sistemleri için kullanılan biyolojik hidrojellerin mekanik gücünü arttırmak için olası bir alternatif sunmaktadır, hidrojeller bir çapraz bağlayıcı olarak kullanılmıştır. Diğer model sistemler model 3D in vitro iskele olarak akciğer dilim bakarak bir in vitro 3D kültür sistemi, ya da daha yaygın olarak bozulmamış decellularized akciğerleri içerir. 20 Biz zaten polimer iskeleler yanı sıra tek bileşenli iskeleleri ile çalışan gelen kısıtlamalar belirtmiştik, ancak bu burada sunulan prosedüre olası alternatifler olarak kalır. Buna ek olarak, alternatif (örneğin DNA izolasyonu gibi) decellularization etkinliğini, jelleşme (bulanıklık tahlilleri kullanabilirsiniz) belirleme yöntemleri ve hücre eki bir vardırND çoğalması (örneğin CCK8 kullanımı gibi). Biz burada açıklanan yöntemler modeli 3D iskeleler olarak kullanılmak üzere hidrojeller karakterize etmek için yeterli fazla olduğunu bulmuşlardır.
Biz burada açıklamak akciğer ECM hidrojeller hücre ECM etkileşimleri çalışmak için etkili bir platform sağlar. PREGEL çözümü mezenkimal kök hücrelerin teslim yardımcı polimer ilaç taşıyıcıları için bir kaplama olarak bir potansiyele sahip, veya kendi başına bir ilaç verme platformu. Burada sunulan protokol akciğer ECM türetilen çok yönlü bir hidrojel oluşturmak için temel adımları sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz sağlam domuz akciğer dokusu bağış için Smithfield çiftlikleri teşekkür etmek istiyorum. Biz de bize kendi ekipman kullanmak için izin Dr. Hu Yang, Dr. Christina Tang ve VCU Plastik Cerrahi Bölümü'ne teşekkür etmek istiyorum. Hidrojel ve doku örnekleri finansman formu NIH-NCI Kanser Merkezi Destek Grant, kısmen, NIH-NINDS Merkezi Çekirdek Grant 5 P30 NS047463 dan fon tarafından, kısmen desteklenen Anatomi ve Nörobiyoloji Mikroskopi Tesisi VCU Bölümü'nde SEM için hazırlandı P30 CA016059. VCU Nanoteknoloji Çekirdek Karakterizasyonu Tesisi (KKK) numunelerin SEM görüntüleme. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı, CMMI 1351162 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use in hood with eye protection and gloves. |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
| HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
| Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
| PBS | VWR | 45000-448 | None |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
| Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
| Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
| Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
| Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |
References
- Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. 14, (2008).
- Haycock, J. W. 3D Cell Culture. , Humana Press. (2011).
- Walker, J. M., Ed, Epithelial cell culture protocols. , Humana Press: Springer. New York: New York. (2012).
- Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta Biomater. 5 (1), 1-13 (2009).
- Koo, H. -J., Lim, K. -H., Jung, H. -J., Park, E. -H. Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin. J. Ethnopharmacol. 103 (3), 496-500 (2006).
- Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels to Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
- Suckow, M. A., Voytik-Harbin, S. L., Terril, L. A., Badylak, S. F. Enhanced bone regeneration using porcine small intestinal submucosa. J. Invest. Surg. 12 (5), 277-287 (1998).
- Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl. Res. J. Lab. Clin. Med. 163 (4), 268-285 (2014).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. J.Biomed.Mater.Res.A. , (2016).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS One. 5 (9), e12905 (2010).
- Ratner, B. D., Bryant, S. J. Biomaterials: where we have been and where we are going. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41-75 (2004).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nat Protoc. 7 (6), 1138-1144 (2012).
- Zhang, W. -J., et al. The reconstruction of lung alveolus-like structure in collagen-matrigel/microcapsules scaffolds in vitro. J. Cell. Mol. Med. 15 (9), 1878-1886 (2011).
- Booth, A. J., et al. Acellular Normal and Fibrotic Human Lung Matrices as a Culture System for In Vitro Investigation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 186 (9), 866-876 (2016).
- Matsuda, A., et al. Evidence for human lung stem cells. N. Engl. J. Med. 364 (19), 1795-1806 (2011).
- Zuo, W., et al. p63+Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517 (7536), 616-620 (2015).
- Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
- Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).
