Summary
Dette er en metode for å lage en tre-dimensjonal cellekultur stillaset fra lunge ekstracellulære matriks. Intakt lunge blir bearbeidet til hydrogeler som kan understøtte veksten av celler i tre dimensjoner.
Abstract
Her presenterer vi en fremgangsmåte for å etablere flere komponentcellekultur hydrogeler for in vitro lungecellekultur. Fra og med sunn en bloc lungevev fra svin, rotte eller mus, er vevet perfused og nedsenket i påfølgende kjemiske vaskemidler for å fjerne cellerester. Histologisk sammenligning av vev før og etter behandling bekrefter fjernet over 95% av dobbeltkjedet DNA og alfa-galaktosidase farging antyder de fleste av cellerester fjernes. Etter decellularization, er vevet lyofilisert og deretter cryomilled til et pulver. Matrisen pulver oppløses i 48 timer i en sur løsning fordøyelsen pepsin og deretter nøytraliseres til å danne det Pregel oppløsning. Gelering av Pregel oppløsningen kan induseres ved inkubering ved 37 ° C og kan brukes umiddelbart etter nøytralisering eller lagret ved 4 ° C i opptil to uker. Belegg kan dannes ved hjelp av Pregel løsning på en ubehandlet plate for cell vedlegg. Celler kan bli suspendert i Pregel før selv-montering for å oppnå en 3D-kultur, belagt på overflaten av en formet gel hvorfra cellene kan migrere inn i stillaset, eller belagt på beleggene. Endringer i strategien presenteres kan påvirke geleringstemperaturen, styrke eller proteinfragmentstørrelser. Utover hydrogel formasjon, kan hydrogelen stivhet økes ved å bruke genipin.
Protocol
| Løsning | steril Filter | Veibeskrivelse |
| DIH 2 O | Ja | DIH 2 O; steril filtrert |
| 0,1% Triton X-100 Løsnings | Ja | Under avtrekk Tilsett 100 Triton-X 100 Solution til 100 ml DIH 2 O og agitere til det er oppløst; sterilt filter. |
| 2% deoxycholate Solution | Ja | Under avtrekk tilsett 2 g Natrium deoxycholate løsning per 100 ml DIH 2 O og agitere til det er oppløst; steril filter |
| 1 M NaCl | Ja | Legg 58,44 g NaCl i 1 l av DIH 2 O; agitere til det er oppløst; sterilt filter |
| DNase løsning | Ja | Legg 12000enheter DNase til en L DIH 2 O; Legg 0,156 g MgSO4 (Vannfri), og 0,222 g CaCl2; agitere til det er oppløst; sterilt filter |
| PBS | Ja | Kombiner 27,2 g Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (toverdig heptahydrat), 80 g NaCl, 2 g KCl og med 10 L DIH 2 O; agitere til det er oppløst; juster pH til 7,4; sterilt filter |
Tabell 1: Løsninger som kreves for Tissue Decellularization. Gjør løsningene ovenfor for decellularization prosessen. Oppbevar ved 4 ° C. Omtrent 2,5 l vil være behov for en porcine lunge.
1. Hydrogel Dannelse
- Svine-Lung Decellularization (tilpasset fra referanser 9,10)
- Skaff en en bloc normal svin lunge, fra et slakteri, med hjerte og Vasculature intakt.
- Bruk vev saks eller en skalpell til å dissekere bort hjertet, skjæring blodkar så nær som mulig til hjertet, vil resten av blodkar brukes i senere trinn for perfusjon.
- Nøye dissekere bort bindevevet rundt luftrøret, bronkiene, og blodkar ved hjelp av en skalpell eller saks.
MERK: Bestem beste lunge å bruke for resten av prosedyren ved å velge en lunge uten store kutt eller punkteringer gjennom pleura og store mengder atelektase eller vaskulær okklusjon som kan hindre effektiviteten av decellularization prosessen. - Skjær bort suboptimal lunge forlater så mye bronkie festet til luftrøret som mulig (hjerte, bindevev og de fliker av lungen fjernet kan kastes). Det bør være en lunge gjenværende festet til luftrøret og blodkar.
MERK: Behold seksjoner for histologi hvis ønskelig. 9 - Lukk frakoblede bronkiene med klemmer eller sutur til pRevent skytende tilbakestrømning.
- Klargjør decellularization løsninger og avkjøl ved 4 ° C inntil nødvendig (tabell 1).
- Ved hjelp av en håndpumpe kanylert for å passe lungearterien, perfuse lungevevet 3 ganger med DI-vann gjennom både lungearterien og trakea. Perfuse blodkar første hver gang. Begynne med rundt en L inn i vaskulaturen og 1,5 L inn i luftrøret for hver perfusjon, men som cellerester fjernes mer væske kan perfusert gjennom systemet.
- Perfuse både blodkar og luftrør med Triton X-100-løsning.
- Senk lungevev in Triton X-100-løsning i 24 timer ved 4 ° C.
- Perfuse blodkar og luftrør 3 ganger med DI vann for å skylle.
- Perfuse både blodkar og luftrør med deoxycholate løsning.
- Senk vevet seksjoner i deoxycholate i 24 timer ved 4 ° C.
- Perfuse blodkar og luftrør 3 ganger med DI vann for å skylle.
- Perfuse både blodkar og luftrør med NaCl-løsning.
- Senk vev i filtrert NaCl-løsning i 1 time ved 4 ° C.
- Perfuse blodkar og luftrør 3 ganger med DI vann for å skylle.
- Perfuse både blodkar og luftrør med DNase løsning.
- Senk vev i filtrert DNase løsning for en time ved 4 ° C.
- Perfuse både blodkar og luftrør 5 ganger med PBS.
- Dissekere bort merkbar bruskvevet, luftrør og alle tubuli 2 mm eller større i diameter (først og fremst funnet rundt hilum og mediale deler av lungene) fra å gjennomføre luftveiene, slik at bare luftveis soner (primært de perifere områder).
- Dissekere vevet inn 1 tomme seksjoner eller mindre. Orientering av vevet spiller ingen rolle for dette trinnet.
- Hell av overflødig væske og plass vev i 50 ml koniske rør. Fryse vevet ved -80 ° C.
MERK: Behold seksjoner for histologi for å sikre fjerning av celler og celle debris, om ønskelig. Vi bruker H & E, α-galaktosidase, picogreen, hydroksyprolin, ninhydrin, Alcian blått, SDS-PAGE, og massespektrometri for å karakterisere. 9
- Lung Processing
- Fjern lokk fra frosne rør som inneholder decellularized lungevevet.
- Plasser filterpapiret over tube åpning og fest med gummistrikk.
MERK: Tube og innholdet bør fortsatt være frosset ellers plassere i -80 ° C inntil frosset. - Lyofilisere vevet til all overflødig væske er borte, ved hjelp av en frysetørker i henhold til produsentens anvisninger. Oppbevar ved -80 ° C til den er klar til møllen.
- Før du begynner legge flytende nitrogen til fryser mill for å kjøle isolasjon og interne komponenter til arbeidsforhold.
- Fjern magnetisk mølle bar fra mill rør og legge vev til å dekke bunnen.
- Bytt mill feltet og legge løst pakket vev. Fabrikken bar bør likevel bevege seg fritt.
- Nedleggelses rør og place i fryser mill.
- Fyll flytende nitrogen til maks streken.
- Kombi mølle alle vev til fint pulver (ca. 5 min, else hastighet på ~ 600 min-1), i et polykarbonat sylinder med en rustfri stålanslags samt rustfritt stål endeplugger ved hjelp av fryseren møllen i henhold til produsentens anvisninger. Oppbevar ved -80 ° C til den er klar til bruk.
- Mikro-porøs gel-dannelse (8 mg / ml) (tilpasset fra referanser 9,11)
- Tilsett 1% (w / v) av decellularized pulver og 0,1% (w / v) av pepsin i 0,01 M HCl, under konstant omrøring (bør være i stand til å se strømning på øverste nivå av væske), ved romtemperatur, for 48 hr.
MERK: Pulveret blir statisk ladet, slik at tilsetning av HCl etter at pulveret gir mulighet for å vaske overskytende av rørveggene. - Etter fordøyelse i 48 timer, plasseres oppløsning og reagenser på is i 5 min.
- Ved hjelp av nedkjølt 10% (v / v) 0,1 M NaOH, end 11,11% (v / v) 10x PBS (for å bringe hele løsningen til 1x konsentrasjon), bringe spaltet proteinoppløsning til fysiologisk pH-verdi på 7,4.
MERK: Løsningen kan nå lagres ved 4 ° C i opp til en uke. Utfør geleringskinetikk ved hjelp rheometri 9 hvis ønskelig.
- Tilsett 1% (w / v) av decellularized pulver og 0,1% (w / v) av pepsin i 0,01 M HCl, under konstant omrøring (bør være i stand til å se strømning på øverste nivå av væske), ved romtemperatur, for 48 hr.
2. Cross-linking Hydrogeler å forbedre mekanisk styrke
- Løsninger på 1%, 0,1% og 0,01% vekt / volum genipin kryssbindingsoppløsning ble fremstilt ved å oppløse den nødvendige mengde av genipin pulver i 10% DMSO.
- Vortex løsningen hvert 15 min for en time.
- Legg genipin løsning for å dekke ECM hydrogeler (100 ul til hver brønn av en 96-brønns plate) som tidligere er samlet i del 1.3.4.
- La hver ECM hydrogel for å tverrbinde i 24 timer ved 37 ° C.
- Skyll ECM hydrogel 3 ganger med PBS inntil vaskeløsningen er ikke lenger blå. De tverrbundne hydrogeler vil da være klar for ytterligere karakterisering og cell kulturstudier.
3. Cell Culture med Mikro Gel
- To-dimensjonal belegg
- Ved hjelp av løsningen fra 1.3.3, tilsett 20 ul Pregel-løsning til hver brønn av en 96-brønners ikke-behandlede vevkulturplate.
- Kjøle over natten ved 4 ° C for å tillate protein adsorpsjon til platen.
- Aspirer Pregel løsning og skyll med PBS.
- Passage celler 9.
- Legge til 10.000 celler / cm 2 til brønnene.
- Øke media til 100 ul per brønn og inkuber ved 37 ° C.
- Tredimensjonal cellekultur 9
- Ved hjelp av løsningen fra 1.3.3, resuspender pelleterte cellene til en konsentrasjon på 1.000.000 celler / ml Pregel oppløsning.
- Raskt å dispensere 16 ul av Pregel-cellesuspensjon til hver brønn i en 96-brønns plate, for å danne et ~ 500 mikrometer tykk hydrogel for 3D-cellekultur.
- Inkuber ved 37 ° C i 30min for å danne gel.
- Tilsett 100 media til toppen av dannet hydrogeler og inkuberes ved 37 ° C.
- Tredimensjonal cellekultur på variabel stivhet gels
- Ved hjelp av løsningen fra 1.3.3, pipetter 100 ul Pregel oppløsningen i hver brønn av en 96-brønns plate.
- Inkuber ved 37 ° C i 30 minutter for å danne gel.
Merk: Cross-linking skritt fra del 2 kan brukes her. - Passage celler 9.
- Legge til 10.000 celler / cm 2 til brønnene.
- Øke media til 100 ul per brønn og inkuber ved 37 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne metoden, har vi produsert hydrogeler fra normal gris, rotte og mus lungene (figur 1). Behandlet lungene tilveiebringe en estimert 5 mg, 40 mg, og 10 g av ECM pulver hhv. En oversikt over fremgangsmåten er vist i figur 2. Nøkkelvisualiseringer i løpet av prosessen er: hvitt utseende i lungene etter skylling deoksycholat; etter Pregel formasjon, bør løsningen være ugjennomsiktig og løsningen skal vises homogen i flere måneder hvis oppbevart ved 4 ° C. Vi har tatt med en grunnleggende feilsøkingstabellen for å identifisere feilkilder i hele prosessen (tabell 2). Etter gelering, kan hydrogeler brukes umiddelbart eller lagres for fremtidig bruk. Reologisk tester bekrefter at over 90% av geleringsforekommer i de første minutter etter å ha nådd 37 ° C (figur 3). Dannet hydrogeler er stabile i lange perioder i PBS, men cellebinding og proliferation kan endre seg (figur 4).
Mens denne protokollen er skrevet for svin lunge, plassbegrensninger begrense oss til å bruke bare én lunge når decellularizing gris lungene. Vi har brukt samme fremgangsmåte med mindre endring decellularize begge lungene for andre arter. For rotter og mus, kan lungene være intakt og hjertet festet, men bindevevet bør likevel fjernes med en skalpell eller saks. Vi holde hjertet intakt og festet til rotter og mus og perfuse oppløsningene gjennom den høyre ventrikkel i stedet for lungearterien. Perfusjon av luftrøret er fortsatt det samme; kan imidlertid kanylen sutureres i luftrøret for å lette adgang til mindre arter.
Vi har lagt til flere celletyper, menneskelige stamceller, 9 muse stamceller, menneskelige epiteliale cellelinjer (A549s), human primær microvascular endothelial celler (HpuVECs) og humane umbilikalvene epitelceller (HUVECs) i og på overflaten av lungene ECM hydrogeler. Vi har ikke møtt problemer i forbindelse med xenogen natur dannet geler. Vårt tidligere arbeid har vist en betydelig reduksjon i α-galaktosidase i svin hydrogeler. 9 Den pre-gel-løsning kan også anvendes som et belegg ved 4 ° C for å forbedre cellefesting. Den Pregel løsning forbedrer HpuVEC vedlegg og spredning når det legges til lunge ECM belagt vevskulturplater. Belagte brønner demonstrere betydelig forbedret mobil vedlegg sammenlignet med ikke-behandlede brønner (figur 5).
Legge genipin øker hydrogel kryssbinding. Denne økte kryssbinding kan gi en mer fysiologisk relevant stivhet, samtidig redusere nedbrytning av ECM. Nedgangen i fornedrelse, men mindre in vitro, kan oppstå på grunn av økt binding mellomproteiner og derfor mer motstand mot ECM remodellering av celler. Vi brukte frekvenssveip på et reometer for å måle de mekaniske egenskapene til den tverrbundne hydrogel. Hydrogel stivhet ble funnet å være direkte korrelert til genipin konsentrasjon med median og mest relevante konsentrasjon å være 0,01% (Figur 6, opprinnelig vev ikke vist). En MTT-assay ble anvendt for å kvantifisere cellevekst og overlevelse på den tverrbundet hydrogel. Celleproliferasjon er høyere på den tverrbundet hydrogel (figur 7). Dette støtter økt celledeling på økt stivhet fra andre. 12 Varierende genipin kryssbinding tid eller temperatur kan resultere i forskjellige kryssbindings grader.
Figur 1: Bilder av Lunger Vi har Decellularized. Bilder fra (A) Mouse lunge etter decellularisjonen og hjerte fjernet, (B) Rat etter Triton X-100 skylles bort, (C) Pig, før første skylling; de gir ~ 5 mg, 40 mg, og 10 g av Lung ECM, respektivt. (D) Mus lunge og hjerte intakt, etter decellularization, med kanyle fortsatt sutureres på plass. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Oversikt over metoder. Dette er en oversikt over fremgangsmåten for å fremstille hydrogeler fra lungene. Fra og med en bloc gris lunge decellularization oppstår slik at bare ugjennomsiktig hvit eller gjennomsiktig vev som består av ECM proteiner. Deretter etter fjerning av eventuelt gjenværende vann, og øke arealet for å optimalisere syre fordøyelse vevet er oppløst. Nøytralisering av acid og øke salt til fysiologiske nivåer skaper Pregel løsning klar for gelering. Når løsningen danner en hydrogel ved 37 ° C, foregår karakterisering sted med en gel rheometer og scanning elektronmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representant Reologi Data for Geleundertemperatur Ramping. Etter en innledende amplitude sveip for å bestemme lineære viskoelastiske område, ble en temperatur rampe som brukes til å bestemme geleringskinetikk. Data er presentert som gjennomsnitt +/- standardavvik. n = 4.
Figur 4: Long Term Stabilitet. en imalder av en gris lunge ECM hydrogel som er lagret i PBS i over 6 måneder ved romtemperatur.
Figur 5: Metabolsk analysen av HpuVECs. MTT data spredning fra menneske primære mikrovaskulære endotelceller (HpuVECs) dyrket på ikke-behandlede vev kultur plater. Pregel oppløsning fra 1.3.3 ble tilsatt til platene, nedkjølt over natten og skylles for å danne pre-gel lunge ECM-belagte plater. HpuVECs viste høyere MTT aktivitet på ECM-belagte plater i forhold til ikke-belagt. * P <0,05 sammenlignet med kontroll. Dataene er gjennomsnitt ± standardavvik n = 3 pr gruppe.
Figur 6: Reologi Data for Enhanced kryssbinding. Rheometry data for genipin kryssbinding. Stivheten øker med økte konsentrasjoner av Genifeste til et platå på 1% genipin. Dataene er normalisert for å vise en dobling i kryssbinding med genipin.
Figur 7; Cell Proliferation på Genipin Tverrbundne Gel. Normaliserte MTT data for A549s på genipin krysskoblet hydrogel. Økt celleproliferasjon sett med økt stivhet. p <0,05 sammenlignet med kontroll. Dataene er gjennomsnitt ± standardavvik. n = 3 per gruppe.
| Problem | Utgave | oppløsning |
| Rød / rosa farge beholdt etter decellularization | ineffektiv decellularization | Starte på nytt med nye lunger |
| Fjern deler av ufullstendig decellularization </ Td> | ||
| vaskulær okklusjon | Starte på nytt med nye lunger | |
| Fjern områder av ufullstendig decellularization | ||
| Betydelig mobilnettet rusk beholdt | ineffektiv decellularization | Starte på nytt med nye lunger |
| Fjern områder av ufullstendig decellularization | ||
| vaskulær okklusjon | Starte på nytt med nye lunger | |
| Fjern områder av ufullstendig decellularization | ||
| atelektase | Starte på nytt med nye lunger | |
| Fjern områder av ufullstendig decellularization | ||
| Ødeleggelse av membraner som finnes i histologiske prøver | Over-trykksetting av skip under perfusjon | Reduser perfusjonstrykkav vaskemidler |
| Store partikler blir igjen etter fresing | For mye frysetørket materiale i rør | Reduser materiale i sliping sylinder |
| Ikke frest for lenge nok | øke fresing tid | |
| Pregel løsning ikke gele | Løsning pH for høy | Gjør pH 7,4 |
| Begynn Pregel løsning med fersk pudder | ||
| Løsning pH for lav | Gjør pH 7,4 | |
| Begynn Pregel løsning med fersk pudder | ||
| ECM løpet fordøyd | Begynn Pregel løsning med fersk pudder | |
| Celler ikke overleve | Mikrober innført etter HCl fordøyelse | Begynn på nytt med fersk pudder og bruke sterile filtrerte løsninger |
| pH off | Begynn Pregel løsning igjen | |
| Gjør pH 7,4 | ||
| celler brast | Fix saltinnhold i Pregel løsning |
Tabell 2: problemløsing for å identifisere kilder Potential Error.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En av de integrerte aspekter av biologi er selvorganisering av molekyler i hierarkiske strukturer som utfører en bestemt oppgave. 13 I laboratoriet, avhenger selv-sammenstillingen på en rekke faktorer som for eksempel saltkonsentrasjon, pH-verdi, og fordøyelse varighet. Som vist, et selvorganiserende hydrogel dannes når solubiliserte proteiner som går tilbake til et fysiologisk temperatur. Den hydrogel som dannes er i stand til å fremme cellulær festing og formering in vitro.
Cellulær respons overfor biofysiske signaler fra ECM kan ikke bli undersøkt ved hjelp av polymerer. Tissue spesifikk cellulær respons overfor biofysiske signaler kan ikke bli undersøkt ved hjelp av andre vev. Regenerering forskere og klinikere mener bruker decellularized stillaser forbedrer vev regenerering og sårtilheling. Kronisk lungesykdom lider trenger terapeutiske forbedringer for å øke organ tilgjengelighet og redusere immunogenisitet. Organ spesifikke, celle-ECM interaksjoner må væreundersøkt for å ytterligere organ biologi.
Ved hjelp av ECM som en celle stillas for lungeceller har vist konsistente resultater. 14,15 Bruke lunge skiver fra syke modeller oppfordrer sykdom fornyelse 16 stilk eller stamceller, som finnes i distale lungene, 17,18 og krever spesielle nisjer som hindrer dannelsen av teratomas. Ved hjelp av vevsspesifikke ECM som et leverings kjøretøy, kan regenererende virkningen av stamceller bli forbedret. ECM-hydrogel etablerer en mer anvendelig miljø for å vurdere cellulære reaksjoner mot ekstracellulær matriks.
En stor mengde forskning eksisterer ser på stivhet i tilknytning til cellesignalering. Vår fremgangsmåte for kryssbinding genipin tillate for celle-signalering stivhet samt celle-ECM-komponent interaksjoner. Mens hydrogel stivhet kan manipuleres ved ECM mengde og forholdet mellom proteiner, bruk av genipin tillater hydrogel stivhet endres noe uavhengig av ECM-innhold. justere genepin konsentrasjon kan gi rom for nøyaktig justering av mekaniske egenskaper til de fleste ligne naturlige lungevev 6. Fra genipin data innhentet ved hjelp av hydrogel fra perifere lunge i denne studien, ble en 15-dobling (fra 5 Pa til 75 Pa) bemerket. Basert på reologiske data for biopsi normal rotte lungevev som ble decellularized med samme metoder, kan vi oppnå omtrentlig vev stivhet perifere lunge (data ikke vist) ved å tilsette 1% genipin til perifere lunge hydrogeler eller legge 0,01% til hele lunge hydrogel (estimert ). Bruke perifere lunge ECM består av lungeparenkym gjort en betydelig mykere gel sammenlignet med våre tidligere publiserte hel lunge ECM hydrogel resultater 7. Derfor i tillegg til genipin, velge spesifikke områder av lungevev til decellularize kan dramatisk påvirke stivheten.
Det er muligheter til å forbedre denne metoden, som kan inkludere flere trinn som vanligvis brukes i perfusipå decellularization av hele lungevev. Denne metoden har vært brukt på normal lungevev og kan kreve modifikasjon for decellularization av syke lunger. Vi har ennå ikke undersøkt denne prosessen i spesifikke sykdomstilstander. Vi får våre lunger sendes på is over natten fra et slakteri. Denne metoden kan begrense effektiviteten av vår prosess på grunn av atelektase eller vaskulær okklusjon; men vi sjelden trenger å fjerne deler av lungen som ikke har vært grundig decellularized. Ved innhenting av frisk lungevev, vil vi anbefale å gjøre alle de nødvendige løsningene før du får lungene til å hindre eventuelle pauser i vev behandling. Tidligere forskning har funnet at bruk av pereddiksyre som et siste steriliseringstrinn til matrise produksjon forårsaker en regenerativ M1 makrofag fenotype i infiltrere immunceller, 19 potensielt bedre proregenerative effekter av decellularized vev. Annen forskning har gått inn ved hjelp av andre vaskemidler til å fullføre prosessen, men de appear å være lab spesifikke preferanser med til slutt samme innvirkning på decellularization. De decellularization prosedyre og fordøyelse trinn kan optimaliseres avhengig av forskerens bestemt program. For eksempel kan endre de gel koketiden eller nøytralisering metoder forandre proteinsammensetningen, mekaniske egenskaper, eller geleringskinetikk.
Alternativer til metoden diskutert her kan variere i grad av kompleksitet avhengig av ønskede eksperimentelle resultater. Hvis for eksempel målet var å holde basalmembranen intakt så mye som mulig, kan en perfusjon pumpe med en trykk begrenset kontroll redusere barriereskade. I tillegg, hvis man hadde en laboratorieoppsett tilgjengelige for å holde begge lungene intakt for større fisk, kan den decellularization prosessen forbedre effektiviteten. Omvendt kan en håndslipeteknikken med en morter og pistill påføres på den lyofiliserte vev for laboratorier som ikke har et cryomill. Vi forventer hånd Grinding for å produsere større fragmenter, noe som begrenser det areal tilgjengelig for syre fordøyelsen slik at oppslutningstider kan måtte endres i dette tilfelle.
Alternativer er ikke begrenset til de decellularization trinn og dannelse av hydrogeler. Glutaraldehyd har vært brukt som et tverrbindingsmiddel for hydrogeler, og gir en mulig alternativ for å øke mekanisk styrke av biologiske hydrogeler som brukes for modellsystemer. Andre modellsystemer inkluderer intakte decellularized lungene som en in vitro 3D kultur systemet, eller oftere ser på lunge skiver som modell 3D in vitro stillaset. 20 Vi har allerede nevnt de begrensninger som følger av å arbeide med polymer stillaser samt enkeltkomponent stillas, men de forblir som mulige alternativer til prosedyren som presenteres her. I tillegg er det finnes alternative metoder for å bestemme decellularization effekt (for eksempel DNA), gelering (turbiditet kan bruke assays), og cellefesting ennd proliferasjon (så som bruk av CCK8). Vi har funnet at fremgangsmåtene som er beskrevet her er mer enn tilstrekkelig for å karakterisere hydrogeler for bruk som modell 3D stillaser.
Lunge ECM hydrogeler vi beskriver her gir en effektiv plattform for å studere celle-ECM interaksjoner. Den Pregel Løsningen har potensial som et belegg for polymer legemiddelbærere, hjelpe til levering av stamceller, eller som et stoff levering plattform av seg selv. Protokollen presenteres her gir de grunnleggende trinnene for å skape en allsidig hydrogel avledet fra lunge ECM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Smith gårder for å donere intakt svin lungevevet. Vi ønsker også å takke Dr. Hu Yang, Dr. Christina Tang og VCU plastisk kirurgi Avdeling for å tillate oss å bruke deres utstyr. Hydrogel og vevsprøver var forberedt på SEM ved VCU Institutt for anatomi og nevrobiologi Mikros Facility støttes delvis av midler fra NIH-ninds Senter Kjerne Grant 5 P30 NS047463 og dels av midler skjema NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30 CA016059. SEM avbildning av prøvene på VCU Nanoteknologi Kjerne Karakterisering Facility (NCC). Dette arbeidet ble finansiert av National Science Foundation, CMMI 1.351.162.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use in hood with eye protection and gloves. |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
| HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
| Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
| PBS | VWR | 45000-448 | None |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
| Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
| Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
| Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
| Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |
References
- Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. 14, (2008).
- Haycock, J. W. 3D Cell Culture. , Humana Press. (2011).
- Walker, J. M., Ed, Epithelial cell culture protocols. , Humana Press: Springer. New York: New York. (2012).
- Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta Biomater. 5 (1), 1-13 (2009).
- Koo, H. -J., Lim, K. -H., Jung, H. -J., Park, E. -H. Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin. J. Ethnopharmacol. 103 (3), 496-500 (2006).
- Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels to Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
- Suckow, M. A., Voytik-Harbin, S. L., Terril, L. A., Badylak, S. F. Enhanced bone regeneration using porcine small intestinal submucosa. J. Invest. Surg. 12 (5), 277-287 (1998).
- Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl. Res. J. Lab. Clin. Med. 163 (4), 268-285 (2014).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. J.Biomed.Mater.Res.A. , (2016).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS One. 5 (9), e12905 (2010).
- Ratner, B. D., Bryant, S. J. Biomaterials: where we have been and where we are going. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41-75 (2004).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nat Protoc. 7 (6), 1138-1144 (2012).
- Zhang, W. -J., et al. The reconstruction of lung alveolus-like structure in collagen-matrigel/microcapsules scaffolds in vitro. J. Cell. Mol. Med. 15 (9), 1878-1886 (2011).
- Booth, A. J., et al. Acellular Normal and Fibrotic Human Lung Matrices as a Culture System for In Vitro Investigation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 186 (9), 866-876 (2016).
- Matsuda, A., et al. Evidence for human lung stem cells. N. Engl. J. Med. 364 (19), 1795-1806 (2011).
- Zuo, W., et al. p63+Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517 (7536), 616-620 (2015).
- Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
- Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).
